亮氨酸脱氢酶突变体、编码基因、载体、工程菌及其应用的制作方法

文档序号:12108679阅读:来源:国知局

技术特征:

1.一种亮氨酸脱氢酶突变体,其特征在于所述突变体是将SEQ ID NO.12所示氨基酸序列第41位、61位、77位、347位和358位进行单、双或三位点突变而成。

2.如权利要求1所述亮氨酸脱氢酶突变体,其特征在于所述单突变是将第41位亮氨酸突变为甘氨酸、第77位亮氨酸突变为半胱氨酸、第61位丙氨酸突变为苏氨酸、第347位蛋氨酸突变为甘氨酸或第358位谷氨酰胺突变为苏氨酸。

3.如权利要求1所述亮氨酸脱氢酶突变体,其特征在于所述突变体氨基酸序列为下列之一:SEQ ID NO.13,SEQ ID NO.14,SEQ ID NO.15,SEQ ID NO.16,SEQ ID NO.17,SEQ ID NO.18,SEQ ID NO.19,SEQ ID NO.20,SEQ ID NO.21和SEQ ID NO.22。

4.一种权利要求1所述亮氨酸脱氢酶突变体编码基因,其特征在于所述基因核苷酸序列为下列之一:SEQ ID NO.2,SEQ ID NO.3,SEQ ID NO.4,SEQ ID NO.5,SEQ ID NO.6,SEQ ID NO.7,SEQ ID NO.8,SEQ ID NO.9,SEQ ID NO.10和SEQ ID NO.11。

5.一种由权利要求4所述亮氨酸脱氢酶突变体编码基因构建的重组载体。

6.一种由权利要求4所述重组载体转化制备的重组工程菌。

7.一种权利要求1所述亮氨酸脱氢酶突变体在催化2-丁酮酸异构化制备L-2-氨基丁酸中的应用。

8.如权利要求7所述应用,其特征在于所述的应用为:以含亮氨酸脱氢酶突变体编码基因的重组工程菌经诱导培养获得的湿菌体分离纯化的纯酶为酶源,以2-丁酮酸为底物,以NADH和氨水为助剂,以pH=7.5、0.02M的磷酸缓冲液为反应介质构成反应体系,在10-50℃、150r/min条件下反应,反应完全后,将反应液分离纯化,获得L-2-氨基丁酸。

9.如权利要求8所述应用,其特征在于所述反应体系中,底物2-丁酮酸初始浓度为50-200g/L,酶源用量为500~1000U/L,所述NADH质量用量为5~100g/L,所述氨水体积终浓度为1~10%。

10.如权利要求8所述应用,其特征在于所述酶源按如下步骤制备:将含亮氨酸脱氢酶突变体编码基因的重组工程菌接种至含终浓度40μg/mL卡那霉素的LB液体培养基,37℃、150r/min培养至OD600=0.8~1.0,获得种子液;将种子液以体积浓度2%的接种量转入含终浓度40μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中,于37℃、150r/min条件下培养OD600=0.4~0.8,添加终浓度0.5mM IPTG,28℃、150r/min诱导培养10h,获得诱导培养液,将诱导培养液离心,收集湿菌体,用0.85%生理盐水润洗后,按100g菌体/L生理盐水的比例溶解菌体,振荡均匀后,超声破碎,12000r/min,20min离心,上清为粗酶液,经过镍柱纯化,收集得到纯酶液即为酶源;所述LB液体培养基组成:胰蛋白胨10g/L,酵母粉5g/L,NaCl 10g/L,溶剂为水,pH值为7.0。

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