一种黄梁木蔗糖转运蛋白同源基因的克隆方法与流程

本发明属于分子生物学及基因工程技术领域，具体涉及一种黄梁木蔗糖转运蛋白同源基因(NcSUT2、NcSUT3、NcSUT4)的克隆方法。

背景技术：

黄梁木(Neolamarckia cadamba)，又称团花树，茜草科团花属树种，在食用、药用以及工业用途等众多方面都发挥着不容小觑的作用，是一种重要的速生经济树种。而蔗糖为根部、生殖结构、储存和发育器官等的异养细胞提供大量的营养物质，为了确保这些异样的库组织的生长和发育接收到足够量的蔗糖，蔗糖转运蛋白在整个植物中对蔗糖的膜运输及分布起到关键作用。因此，对黄梁木的蔗糖转运蛋白基因的研究，有助于进一步了解蔗糖在黄梁木中转运机制和作用机理以便充分加以利用。

技术实现要素：

为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供一种黄梁木蔗糖转运蛋白同源基因(NcSUT2、NcSUT3、NcSUT4)的克隆方法。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种黄梁木蔗糖转运蛋白同源基因的克隆方法，包括以下操作步骤：应用如SEQ ID NO：1所示的引物F，如SEQ ID NO：2所示的引物R，进行PCR扩增NcSUT2；应用如SEQ ID NO：3所示的引物F，如SEQ ID NO：4所示的引物R，进行PCR扩增NcSUT3；应用如SEQ ID NO：5所示的引物F，如SEQ ID NO：6所示的引物R，进行PCR扩增NcSUT4。

所述PCR的反应条件是：94℃预变性2min，98℃变性10sec，50℃退火30sec，68℃延伸2min，将变性、退火和延伸三个步骤重复40个循环；循环结束后，68℃再延伸2min，4℃冷却10min；反应后加3μL dNTPs、0.5μL Taq酶，72℃反应20min。

所述PCR的体系是：

所述cDNA第一链模板是按照以下方法合成：

(1)基因组DNA去除：

在RNase free离心管中配配置下列溶液：

RNase free ddH₂O to 16μL

4×gDNA wiper Mix 4μL

模板RNA 1000ng

移液器吹打混匀42℃，2min。

(2)在步骤(1)中的PCR管中直接加入5×HiScriptⅡqRT super MixⅡ4μL，溶液吹打均匀，以以下条件进行反转录扩增：25℃反转录引物和模板RNA退火结合10min，50℃延伸30min，85℃保持5min把合成的cDNA和RNA变性打开得到cDNA，然后4℃恒温保存。

所述RNA是按照以下提取方法得到：

(1)收集100mg研磨冰冻的黄梁木韧皮部样品在离心管中，在组织解冻之前，加入500μL的裂解液RLT和50μL PLAN Taid混匀，用手立即剧烈震荡20s，使样品充分混匀；

(2)接着室温下以速度13000rpm离心10min，从而将不能裂解的碎片和结合有多糖多酚的PLANTaid沉淀；

(3)吸取上清液并转移到一个新的centrifugal tube中，量取上清体积，加入二分之一的无水乙醇，立即吹打混匀，不要离心；

(4)立即把混合物加到一个基因组吸附柱中，以速度13000rpm，离心2min，弃废液，若量较多则可分多次放入离心；

(5)将基因组吸附柱放在一个干净2mL离心管中，在基因组吸附柱柱内加500μL裂解液RLT Plus，以速度13000rpm离心30s，收集滤液，用微量移液器较精确估计滤过液体积(通常450-500μL左右)，加入二分之一体积的无水乙醇，这个时候可能会有沉淀，但是不会对提取产生影响，混匀，不需离心；

(6)马上将混合物加入到一个置于收集管的吸附柱RA中，以速度13000rpm离心2min，弃废液；

(7)加入700μL去蛋白液RW1至过滤柱，室温放置1min，在室温下以速度13000rpm离心30s，弃废液；

(8)加入500μL漂洗液RW，以速度13000rpm，离心30s，弃废液。再加入一次500μL漂洗液RW，重复一遍；

(9)将吸附柱RA放回空收集管中，以速度13000rpm离心3min；

(10)取出吸附柱RA，放入一个RNase free离心管中，根据预期RNA产量在吸附膜的中间部位加30-50μL RNase free H₂O(事先在70-90℃水浴中加热可提高产量)，室温放置1min，以速度12000rpm离心1min；

(11)用核酸快速测定仪和琼脂糖凝胶电泳测浓度与纯度。

一种由权利要求1所述的克隆方法获得的黄梁木蔗糖转运蛋白同源基因NcSUT2，其特征在于：所述的黄梁木蔗糖转运蛋白同源基因NcSUT2的核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示。具体如下：Seq1[organism＝Neolamarckia cadamba][clone＝1569bp]sucerose transporter 2cDNA,complete CDS

ATGGAGGGTGGCAGAGTCAATGATCAAGAAAATGGCAAAACCTTATCTTCTTTTCAAGTCCAGTCTCATCAACCGCCGCCACCACCACCGCTCTCACTACCACCTCAGCCACCTCAGCCAGTTCGAAATTTAATAATGGTGGCTGCTATAGCTGCCGGAATCCAATTCGGATGGGCGTTACAGCTTTCTTTGCTGACCCCATATGTGCAGCTTTTGGGAATATCCCACAAATTGGCCCCCATAATTTGGCTATGCGGTCCTATTTCTGGGTTGCTTGTCCAACCCATGGTTGGATACTACAGTGACAACTGTACCTCCCGCTTCGGCCGCCGCCGCCCTTTCATTGCTGCCGGTGCTGGCCTTGTGGCCATCGCCGTCGTCCTCATTGGCTTTGCTGCTGACATTGGTCATATGTCTGGTGACCCTCTTGGCAAATCCAGCAAACCTCGAGCTATCGCTGTTTTCATTGTTGGCTTTGCCATTCTTGACGTAGCCAACAACATGTTACAGGGTCCATGCAGAGCTCTGTTGGCCGATCTGTCAGGTGGGAATGCGCGCAAGACGCGCATGTCATACGCAGGCTATTCTTTTTTTATGGCAGTAGGGAATGTGTTGGGTTATGCAGCCGGTTCATACAGTAAACTTTACAAATTATTCCCATTTACTGAAACAAAAGCGTGTGATATTTACTGTGCAAACCTTAAGAGCTGTTTCATTATCTCCATAGCTCTTTTATTAACCTTAACAGTGCTAGCTTTGACAATTGTTCGTGAAAAGCCCTACTCAGGAACGGAACCAGAAAGTGAGGAAGCTACAGAAGGTGAAAAGCATCATGCCAAAATTCCCTTTTTTGGGGAAATATTTGGTGCTCTTAAGGATTTGCCTAGACCCATGTGGATCCTACTTCTGGTAACATGTTTGAATTGGATTGGTTGGTTCCCTTTCTTCTTGTTCGACACTGATTGGATGGGTAGGGAGGTGTATGGAGGAAAGGTCGGTGATAAGTTGTACGACAAAGGTGTACATGCTGGTGCTTTAGGACTCATGCTTAACTCAATTGTCCTGGGTGTCGCATCGGTAGGTGTAGAGCACTCGGCGCGTTGGGTTGGTGGTGTGAAGAGGTTGTGGGGAGGTGTAAACTTCATCCTTGCAATTTGCTTTGCTTTCACTGTTTTAATCACCAAATTGGCCAAATCTACGCGTCGCTCTAATGGACTACCGGCCGAGGGTATCAAGATCGGGTCCCTAGCCCTCTTTTCTGTTTTGGGAATTCCTCTAGCGGTCACATACAGCATCCCTTTTGCTTTGGCATCCATATTTTCTACCGACTCTGGCTCAGGACAAGGTCTTTCACTAGGAGTTCTGAATCTTGCCATTGTCGTGCCACAGATGTTGGTTTCTCTCCTAAGTGGACAATTTGATGCCTTATTTGGAGGTGGTAACTTACCAGCCTTTGTTGTAGGGGCCATTGCTGCCGGTTTGAGTGGATTAATTGCAGTCACTAAATTACCATCTCCACCGGCAGATATTCCAGCGCACAAGACTCAGGCAATTGCGGCGTTCCATTAA

一种由权利要求1所述的克隆方法获得的黄梁木蔗糖转运蛋白同源基因NcSUT3，其特征在于：所述的黄梁木蔗糖转运蛋白同源基因NcSUT3的核苷酸序列如SEQ ID NO：8所示。具体如下：Seq2[organism＝Neolamarckia cadamba][clone＝1872bp]sucerose transporter 3cDNA,complete CDS

ATGCCGATGAGCGCCGCCACCAAGATGGATGCGGTATCGATCCGCCTGCCGTACCGGAATTTGAAGCAAGAAGTTGAGCTCATCGGCGTCGATCAAGCTCAACTACGTCGTTTACAGATCGCCGCTCAGAATCGTAACAATAGGAATTTGAATACTAGTAATGAGAATTTTAGCGGTAGCAATAATTCATCGCCGCCTTCCGCGGCGGACGGAGATGCTGAAAGTCAGCAGGAGAAGCATAGTAGTTTGTTTATGTTGATTCTCAGTTGTACGGTGGCCGCCGGAGTGCAATTCGGCTGGGCGTTGCAGCTTTCTCTTCTCACTCCTTATATTCAGACACTTGGTGTGGATCATGCTTTTTCGTCATTTATTTGGCTTTGTGGCCCCATTACAGGTCTCGTGGTACAACCTTGTGTTGGTATATGGAGTGATAAATGCACTTCAAAATATGGCAGAAGGCGACCATTTATATTTGTTGGATCTCTCATGATCTCATTTGCTGTGATAATCATCGGGTTTTCTGCAGACATAGGATACATTTTAGGAGACACAGAAGAACACTGCAGCACATTTAAAGGCACTCGCACAAGAGCAGCTATTGTATTCATTATTGGGTTTTGGATGCTGGATCTTGCAAACAACACTGTGCAGGGCCCAGCTCGTGCTCTTTTGGCTGATCTGGCTGGCCCAGATCAAAGAAACTCCGCAAATGCTGTATTTTGTTCTTGGATGGCTGTTGGAAACATTCTAGGATTTTCTTCCGGAGCCAGTGGACATTGGCACAGATGGTTTCCATTTTTGTTGAGTAGAGCTTGTTGTGAACCCTGTGGAAATCTTAAAGCAGCATTTTTGGTTGCTGTGGTGTTCCTGGCTCTATGTA CACTTGTCACGCTCTACTTTGCCAAGGAGGTTCCATTGGCCCCAAGGCAACCTGTTGGTCTATCAGATTCTGCTCCTCTCTTGGATAATCCTGGACAAATTGGCTTTGACCTTTCAAAATCAGAAGTACAAAATGATAATGCATTGGAGATCAAGTCCAAGAATGAGATTTTCATTGAGAATGATAACATGAGGAATGAAAACCAAAAAGTTGAGGAAGATGTCGTTGAGAGTTTCAACAATAGCCCTGGAGCAGTTTTGGTCCATTTATTAACTAGCTTGCGGAAGTTACCTCCAGCCATGCATTCTGTGCTAATTGTCATGGCTTTGACCTGGCTGTCCTGGTTTCCATTTTTCCTCTTTGACACTGATTGGATGGGAAGAGAAGTTTATCATGGTGATCCCAAAGGAGATGTATCTGAAGTTAAAGCTTATCATCAGGGTGTGAGAGAAGGTGCATTCGGTTTGCTATTGAATTCAGTTGTTCTTGGGATCAGTTCCTTCTTTATTGAGCCTATGTGCCGGTGGATGGGTGCCAGAATAGTTTGGGCTATGAGTAATTTCATGGTGTTTGCCTGCATGGCTGGCACTGCTATCATTAGTTTGGTTTCTGTTAGAGGATATTCAGAAGGGGTTCAACATATCGTTGGGGCGAATGGAGCAGCCAAGATTGCCTCCTTGGTTGTTTTTGGTCTTCTTGGCTTACCTTTGGCTATCACTTATAGTGTTCCTTTCTCTGTCACTGCTGAGTTAACTGCTGATTCCGGGGGTGGCCAAGGATTGGCTATTGGAGTGTTGAATCTAGCAGTTGTTGTACCCCAGATGGTTGTGTCCCTTGGTGCTGGTCCTTGGGATGCCTTATTTGGTGGAGGAAACATACCAGCGTTTGTTTTGGCATCGTTGTGTGCCCTTGCAGCTGGTGTTATTGCGACCCAAAAGTTGCCAATTCTTGCAAGCAGTTCTTATAGATCAACTGGCCTCCATTTTGGTTAA

一种黄梁木蔗糖转运蛋白同源基因NcSUT4，其特征在于：由权利要求1所述的克隆方法获得，所述的黄梁木蔗糖转运蛋白同源基因NcSUT4的核苷酸序列如SEQ ID NO：9所示。具体如下：Seq3[organism＝Neolamarckia cadamba][clone＝1518bp]sucerose transporter 4cDNA,complete CDS

ATGCCGGAAATCGAGAGGCACAGTAAAGACAAACCGAGAACAACAACTCGTCATCCGGTTCGCGAACCGGTTCGACCACAACGAGTTCCGTTACGCCTGCTCCTCCGAGTCTCGTCCATCGCGTGCGGAATACAATTCGGTTGGGCGTTGCAGTTGTCGTTGCTGACTCCCTACGTGCAAGAGCTCGGGATTCCGCACGCGTGGGCGAGTATAATCTGGCTATGCGGACCGGTTTCCGGTTTCTTCGTCCAGCCGCTGGTCGGTCACATGAGCGACCGCTGCAGGAGCCGGCTCGGTCGTCGCAGGCCTTTTATTATCGCCGGCGCGGCTTCGATTGTTGTCGCCGTTGTCGTCATCGGCTTCTCCGCCGACATCGGCTGGCTCTTCGGCGATCGCGGCAAAGTTAAGCTACGCGCTATTGCGGCTTTTGTTTTAGGGTTTTGGCTGCTCGATGTTGCGAATAATATGACGCAAGGTCCTTGCAGAGCTCTGCTCGCTGATCTCACCGGAAAAGATCACAGGAGGACTCGAGTAGCAAATGCATATTTTTCACTATGGATGGCAGTTGGTAATATCCTTGGCTATGCCACTGGAGCTTACAGTGGTTGGTTCAAAATTTTACCCTTTACGCGCAGTTCTGCATGCAATGTCAACTGTGCAAATCTTAAGGCTGCCTTCCTTATTGACATTATTTTTATAACAATTACGACATATATAAGCATATCAGCGGCCCATGAGCAGCCACTGGATTCCCTCCATAGTTCACCCGCCTCCATAGAAGAAAGATTTGAACACTCAAGCCACGAACAAGAAGCTTTCCTCTGGGAAATGTTTGGAACTTTTAAATATTTCACTGGTGTCATCTGGATTATCTTGCTTGCTATTGCTTTGACTTGGATTGGATGGTTTCCATTTCTTCTCTTTGATACTGATTGGATGGGGCGAGAAATTTATGGGGGG CAGCCAAATGATGGCCAGAATTACAGTGTTGGAGTCAGAATGGGTGCTTTCGGTCTAATGTTCAATTCAGTGGTCCTTGGAATAACTTCAGTGCTCATGGAGAAGCTCTGCCGCAAATGGGGGGCTGGTTTTACATGGGGAGTTTCAAACATTGTCATGTCTCTCTGTTTTGTTGCAATGCTTATAATTACTGCAGTCAGAACTCACATGGACATAGGTGACCGTCTTCCTCCAGATGGTGTCGTGATTGCTGCATTAGTAGTATTTGCCGTTCTTGGATTTCCGCTTGCAGTAACATACAGCGTTCCTTATGCCTTGATATCCTCAAGGATTGAAGCTTTAGGGCTTGGCCAGGGGTTGTCAATGGGTGTTCTCAATCTGGCAATTGTGGTCCCACAGATTTTGGTCTCTCTTGGAAGCGGACCGTGGGATGAGCTATTTGGTGGTGGCAACTCACCAGCCTTGGCAGTTGGAGCTGTTTCAGCATTTGCTAGTGGACTCATAGCCATTTTGGCAATCCCTCGAACAAGGGTGGAAAAATCAAGAATCCTCCCCTGA

与现有技术相比，本发明具有以下优点及有益效果：本发明设计的特异引物和特定的PCR扩增步骤能够有效的克隆出黄梁木NcSUT2、NcSUT3、NcSUT4的CDS序列。

附图说明

图1是黄梁木NcSUT2的cDNA PCR产物电泳图谱，其中1、2均为NcSUT2的cDNA PCR产物条带。

图2是黄梁木NcSUT3的cDNA PCR产物电泳图谱，其中1、2均为NcSUT3的cDNA PCR产物条带。

图3是黄梁木NcSUT4的cDNA PCR产物电泳图谱，其中1、2均为NcSUT4的cDNA PCR产物条带。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1黄梁木NcSUT2、NcSUT3、NcSUT4的cDNA克隆。

1、黄梁木RNA提取方法：使用Aidlab公司生产的植物RNA提取试剂盒。

(1)收集100mg研磨冰冻的黄梁木韧皮部样品在离心管中，在组织解冻之前，加入500μL的裂解液RLT和50μL PLAN Taid混匀，用手立即剧烈震荡20s，使样品充分混匀；

(2)接着室温下以速度13000rpm离心10min，从而将不能裂解的碎片和结合有多糖多酚的PLANTaid沉淀；

(3)吸取上清液并转移到一个新的centrifugal tube中，量取上清体积，加入二分之一的无水乙醇，立即吹打混匀，不要离心；

(4)立即把混合物加到一个基因组吸附柱中，以速度13000rpm，离心2min，弃废液，若量较多则可分多次放入离心；

(5)将基因组吸附柱放在一个干净2mL离心管中，在基因组吸附柱柱内加500μL裂解液RLT Plus，以速度13000rpm离心30s，收集滤液，用微量移液器较精确估计滤过液体积(通常450-500μL左右)，加入二分之一体积的无水乙醇，这个时候可能会有沉淀，但是不会对提取产生影响，混匀，不需离心；

(6)马上将混合物加入到一个置于收集管的吸附柱RA中，以速度13000rpm离心2min，弃废液；

(7)加入700μL去蛋白液RW1至过滤柱，室温放置1min，在室温下以速度13000rpm离心30s，弃废液；

(8)加入500μL漂洗液RW，以速度13000rpm，离心30s，弃废液。再加入一次500μL漂洗液RW，重复一遍；

(9)将吸附柱RA放回空收集管中，以速度13000rpm离心3min；

(10)取出吸附柱RA，放入一个RNase free离心管中，根据预期RNA产量在吸附膜的中间部位加30-50μL RNase free water(事先在70-90℃水浴中加热可提高产量)，室温放置1min，以速度12000rpm离心1min；

(11)将提取得到的RNA，使用浓度为1.5％琼脂糖凝胶电泳检测其完整性；用Thermo Fisher ND-1004全自动核酸蛋白快速检测仪检测浓度。

2、使用vazyme公司的试剂进行进行cDNA第一链的合成

(1)基因组DNA去除：

在RNase free离心管中配配置下列溶液：

RNase free ddH2O to 16μL

4×gDNA wiper Mix 4μL

模板RNA 1000ng

移液器吹打混匀42℃，2min。

(2)在步骤(1)中的PCR管中直接加入5×HiScriptⅡqRT super MixⅡ4μL，溶液吹打均匀，以以下条件进行反转录扩增：25℃反转录引物和模板RNA退火结合10min，50℃延伸30min，85℃保持5min把合成的cDNA和RNA变性打开得到cDNA，然后4℃恒温保存。

3、NcSUT2、NcSUT3、NcSUT4cDNA的扩增：

根据转录组序列，运用primer5.0设计NcSUTs cDNA扩增引物，并在上海生物工程公司合成引物。应用如SEQ ID NO：1所示的引物F，如SEQ ID NO：2所示的引物R，进行PCR扩增NcSUT2；应用如SEQ ID NO：3所示的引物F，如SEQ ID NO：4所示的引物R，进行PCR扩增NcSUT3；应用如SEQ ID NO：5所示的引物F，如SEQ ID NO：6所示的引物R，进行PCR扩增NcSUT4。引物序列如表1所示：

表1引物序列列表

(1)在灭菌的0.2mL离心管加入下列PCR试剂如下：

(2)PCR的反应条件是：94℃预变性2min，98℃变性10sec，50℃退火30sec，68℃延伸2min，将变性、退火和延伸三个步骤重复40个循环；循环结束后，68℃再延伸2min，4℃冷却10min；反应后加3μL dNTPs、0.5μL Taq酶，72℃反应20min。

(3)PCR反应的产物电泳结果：

如图1所示，其中1、2均为NcSUT2的cDNA PCR产物条带。

如图2所示，其中1、2均为NcSUT3的cDNA PCR产物条带。

如图3所示，其中1、2均为NcSUT4的cDNA PCR产物条带。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。