一种茶树MYB转录因子CsAN1及其在调控花青素代谢中的应用的制作方法

本发明涉及植物基因工程领域，具体地，涉及一种茶树MYB转录因子CsAN1及其在调控花青素代谢中的应用。
背景技术：
：茶叶是世界上最重要的无酒精饮料之一，其富含茶多酚、茶氨酸、咖啡碱及多种类黄酮类物质等，这些物质赋予了茶叶医疗保健的重要功效。中国是茶叶的生产大国，种植茶叶是目前很多山区经济的重要来源，茶叶也是我国出口创汇的重要农产品。高花青素含量的茶叶不仅能更直接的为饮茶者带来多重的保健功效，其紫化叶片特征使其具备了极高的观赏价值，在观光茶园中有着大规模的应用。茶树紫化芽叶形成的分子机制具有重要的现实意义及广泛的利用价值。花青素是植物界中最大的水溶性色素家族，也是类黄酮类家族中的一员。现已知的花青苷有20多种，植物中常见的有6种，即矢车菊色素（Cyanidin）、飞燕草色素（Delphidin）、天竺葵色素（Pelargonidin）、芍药色素（Peonidin）、牵牛花色素（Petunidin）和锦葵色素（Malvidin）。花青素储存在植物的液泡中，是根、茎、叶、花、果实和种子等这些植物组织显示紫色、红色及蓝色的主要原因（Koesetal.，2005；Tanakaetal.，2008）。花青素对植物的生长代谢具有非常重要的作用，如吸引昆虫授粉和帮助种子传播等。在植物体内，花青素还充当着响应生理和环境变化的保护机制，有利于植物应对各种生物和非生物胁迫（Xuetal.，2015；Zhouetal.，2014）。由于花青素具有多种的生物学活性，其在人类医疗保健方面也扮演着重要的角色。花青素是一种天然的抗氧化剂，能够保护人体免受自由基等有害物质的伤害，在增强血管弹性、预防心脑血管疾病、保护肝脏等方面有着重要的作用。最新的流行病学研究数据表明：花青素可能具有持久的保健功效并且能减少慢性疾病的发病机率（Trakaetal.，2011）。Espley（2014）等用高花青素的玉米，番茄和苹果对小动物进行喂养试验，结果表明：这些高花青素的食物对小动物的成长显示出有益作用。此外，花青素作为一种天然无害色素，在食品色素开发中有着广泛的应用前景。目前，食品加工中所用的色素多为合成色素，有着不同程度的毒性，长期食用会危害人体健康。随着人们对食品安全关注度的提高，花青素这种植物中存在的天然色素越来越引起科研领域的关注。因此，高花青素含量的食物选育成为植物学家研究的热门主题。茶树是起源于我国的一种重要的木本植物，也是目前我国大部分山区主要栽培的经济作物之一。在生产栽培上，红紫化是茶树叶片较为常见的性状之一，除了某些特异茶树资源新梢芽叶常年呈紫红色外（如“紫娟”），其他一些茶树品种在春秋季节受生长发育状态、光照、温度等因素的影响，其幼嫩芽叶也会出现不同程度的紫化现象，进一步的理化分析表明紫色芽叶往往花青素含量较高（季鹏章等，2010；李双伶等，2009；萧力争等，2009）。过去认为，茶叶中的花青素含量的高低与茶叶品质呈负相关，含有紫色的芽叶不宜来制作绿茶。但随着花青素的分子组成、生物化学功能、医学价值的发现，茶叶中的花青素成为一个研究热点之一。Lv等（2015）对“紫娟”的花青素成分进行测定发现：“紫娟”主要含有8种花青素，其中矢车菊-3-O-半乳糖（cyanidin-3-O-galactoside）的含量最高。高花青素的积累使“紫娟”具备了强抗氧化活性。马春雷等（2012）利用基因芯片技术对紫芽和绿芽进行分析，筛选到43个差异表达基因，这些基因主要参与能量代谢、次生代谢和转录调控等；并且克隆了2个茶树转录因子基因CsMYB1（登录号：HQ660373）和CsMYB2（登录号：HQ660374）的基因全长，用荧光定量PCR检测发现：CsMYB2在叶片的表达量是根的100多倍，遮阴处理显著提高茶树花青素的含量，这时CsMYB1的表达量也增加。陈林波等（2012）利用cDNA-AFLP技术对“紫娟”幼嫩叶片和成熟叶片的基因表达进行分析，筛选到59个差异表达基因，在幼嫩紫色部位上调表达的有26个片段，33个下调表达，这些基因主要有代谢相关蛋白、转录因子、信号蛋白及一些假设蛋白。最近，周琼琼等（2015）研究发现：茶树中9个花青素合成途径关键酶基因PAL、C4H、CHS、CHI、F3H、F3'H、F3'5'H、DFR和ANS在幼嫩紫叶中均呈上调表达。紫外光、低温以及缺氮的环境条件有利于茶树花青素的积累，这主要是通过诱导花青素合成关键结构基因的表达，从而影响花青素的积累（李智，2014）。目前，对“紫娟”茶树芽、第二叶、开面叶、成熟叶四个时期的转录组测序也已经完成，这将为可为研究茶树紫色基因的遗传育种奠定基础（陈林波等，2015）。上述研究虽然对茶树花青素的代谢研究进行了初步探讨，但是茶树花青素代谢途径转录水平的调控机制及花青素合成相关转录因子的作用机理尚不明确，有待于进一步研究。技术实现要素：为了克服现有技术的上述缺点与不足，本发明的首要目的在于提供一种茶树MYB转录因子CsAN1基因。本发明的另一个目的在于提供上述茶树MYB转录因子CsAN1蛋白。本发明的另一个目的在于提供一对用于扩增茶树MYB转录因子CsAN1的引物。本发明的另一个目的在于提供上述茶树MYB转录因子CsAN1在调控植物花青素合成过程中的应用。本发明的另一个目的在于提供一种含有上述茶树MYB转录因子CsAN1的重组表达载体。本发明的另一个目的在于提供一种含有上述茶树MYB转录因子CsAN1的转基因植株。本发明上述目的是通过以下技术方案来实现的。一种茶树MYB转录因子CsAN1，其核苷酸序列如SEQIDNO：1所示，最大开放阅读框（编码区）为765bp。上述茶树MYB转录因子CsAN1，其氨基酸序列如SEQIDNO：2所示。该序列有254个氨基酸，具有R2R3MYB转录因子的典型结构特征，并且具备调控花青素合成转录因子特有的KPRPR[S/T]F结构域（见图1）。一对用于扩增茶树MYB转录因子CsAN1的引物，包括上下游引物，其核苷酸序列分别如SEQIDNO：3和SEQIDNO：4所示。bHLH、MYB、WD40这三类蛋白，是参与花青苷合成的主要转录调控因子。它们通过DNA序列的特异结合和蛋白-蛋白的相互作用，达到激活或者抑制靶基因转录表达，从而调控植物花青苷的合成。一般来说，转录因子可以调控多个花青素合成途径结构基因表达，从而很大程度影响花青素的合成。超表达花青素合成相关的关键转录因子（一般为MYB家族），如：拟南芥的AtMYB75/PAP1，番茄的SlANT1，苹果的MdMYB10和MdMYB110a，花椰菜的BoMYB2以及甜菜的BvMYB1等可以显著的提高花青素的含量。与之相反的，如果MYB基因功能缺失或表达受到抑制，将会导致花青素在植物体内不能正常的积累。上述茶树MYB转录因CsAN1在调控植物花青苷合成过程中的应用。一种重组表达载体，将SEQIDNO：1所示的茶树MYB转录因子CsAN1与35S启动子连接后，连接到表达载体上。一种转基因植株的制备方法，将SEQIDNO：1所示的茶树MYB转录因子CsAN1与35S启动子连接后，连接到表达载体上得到含有CsAN1的重组载体；将重组载体通过农杆菌介导转化植物，即可得到转基因植株。优选地，所述植株为烟草。更优选地，将含有CsAN1的重组载体通过农杆菌介导转化植物的同时，也将CsGL3和CsTTG1基因与CsAN1一起转化植物。一种转基因烟草的制备方法，包括如下步骤：（1）将SEQIDNO：1所示的茶树MYB转录因子CsAN1与35S启动子连接后，连接到表达载体上得到含有CsAN1的重组载体，将重组载体转化农杆菌感受态细胞，获得重组农杆菌，向重组农杆菌中加入等体积的含0.2mmol/L的乙酰丁香酮，10mM的MgCl2和10mM的MES渗透缓冲液，制备得到CsAN1的侵染液；（2）按照步骤（1）的方法分别制备CsGL3和CsTTG1的侵染液；（3）将CsAN1、CsGL3和CsTTG1的侵染液等体积混合后，打入烟草叶片的背面，恒温培养10天即得转基因烟草。与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：本发明获得一种茶树MYB转录因子CsAN1的核苷酸序列，并对其氨基酸序列进行分析，发现CsAN1具有R2R3-MYB转录因子的保守结构域，并具有bHLH的结合位点和调控花青素合成的KPRPR[S/T]F结构域。CsAN1连接了35S启动子后连接到pBI121载体，利用农杆菌GV3101介导转化烟草，同时将该基因以及与其能形成复合物的基因CsGL3和CsTTG1分别转化烟草，4天后可以观察到叶片开始出现花青素，烟草叶片变红，到第10天花青素积累含量达到最大值。对烟草叶片的花青素浸提后，通过分光光度计检测到花青素含量显著提高，通过HPLC检测到矢车菊色素，（cyanidin-3-O-galactoside）和飞燕草色素（delphinidin-3-O-galactoside）两种主要色素。附图说明图1为CsAN1氨基酸序列分析图。图2为CsAN1超表达载体的构建示意图。图3为分别转化了CsAN1、CsAN1+CsGL3和CsAN1+CsGL3+CsTTG1的烟草叶片的显微结构图。图4为对照烟草叶片、转化CsAN1、CsAN1+CsGL3以及转化CsAN1+CsGL3+CsTTG1超表达烟草叶片的花青素提取液图。图5为对照烟草叶片、转化CsAN1以及转化CsAN1+CsGL3+CsTTG1超表达烟草叶片的花青素含量图。图6为对照烟草叶片、转化CsAN1超表达植株烟草叶片、CsAN1+CsGL3以及转化CsAN1+CsGL3+CsTTG1烟草叶片的花青素HPLC图。图7为花青素合成途径关键结构基因在对照以及超表达烟草中的表达量情况图。具体实施方式下面结合说明书附图和具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。实施例1茶树MYB转录因子CsAN1分离和克隆1、引物设计：本发明前期对茶树“紫娟”的不同发育阶段叶片进行转录组测序（安诺优达基因科技（北京）有限公司），在转录组数据库中得到了CsAN1的全长，根据已知的序列全长设计扩增CsAN1的特异引物：F：5’-TACTTATTCAGACAAACGCACAC-3’；R：5’-ATTTCAACTCTAATTTCAACCCA-3’；2、RNA的提取：采用HipurePlantRNAMiniKit（美基，广州）提取茶树“紫娟”顶芽，第二叶，第三、四叶混合样以及老叶的总RNA，用核酸蛋白仪测定OD260/OD280和OD260/OD230值，判断RNA的质量和产量，采用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性。3、cDNA第一链的合成cDNA的合成使用PrimeScript®1stStrandcDNASynthesisKit（TaKaRa，大连）进行，具体步骤如下：（1）在无菌的PCR管配制以下体系：RNA2μgcDNAsynthesisPrimer1μLSMARTⅡOligonucleotide1μLRnase-freeH2OUpto5μL（2）混合样品，72℃保温2min。（3）短暂离心收集样品于管底，保持试管于室温。（4）加入下列试剂于反应管中：5×First-StrandBuff2μLDTT1μL50×dNTPMix1μLScriptReverseTranscriptase1μL（5）混匀，用PCR仪42℃保温30min（6）加入30μL的TE缓冲液（7）加热试管85℃，7min（8）贮存于-20℃冰箱备用。4、PCR扩增反应条件：95℃预变性5min；95℃30s，60℃30s，72℃1min，34个循环；72℃延伸5min。将扩增获得的PCR产物连接到PMD19-T载体（购至TaKaRa），筛选阳性克隆并测序，获所需基因全长，将其命名为CsAN1。序列分析发现：CsAN1的最大开放阅读框为765个碱基，如SEQIDNO:1所示，编码254个氨基酸（如SEQIDNO:2所示），具有R2R3-MYB转录因子的保守结构域，并具有bHLH的结合位点和调控花青素合成的KPRPR[S/T]F结构域（见图1）。实施例2茶树MYB转录因子CsAN1超表达载体的构建和转化1、超表达载体的构建示意图如图2所示，具体步骤为：以实施列1得到的阳性克隆PMD19T-CsAN1载体为模板，设计特异引物：pBI121-CsAN1-F:5’-GGACTCTAGAGGATCCATGGACATTGTTTGTTGTGT-3’，pBI121-CsAN1-R:5’-GACCACCCGGGGATCCTCATCATTCATCACCTAACA-3’，进行PCR扩增。同时用BamHI（TaKaRa）酶切pBI121过表达载体使其线性化后，采用ClonExpress®IIOneStepCloningKit（南京诺唯赞生物科技有限公司）进行连接。酶切体系：BamHI1μL+Buffer1μL+pBI121质粒3μL+H2O补齐到10μL。置37℃水浴锅酶切4h，之后转到85℃水浴锅中灭活20min。表1ClonExpress®IIOneStepCloningKit的连接体系ddH2OUpto20μl5×CEIIBuffer4μl线性化克隆载体50～200ng插入片段扩增产物20～200ngExnase®II2μl体系配制完成后，用移液器上下轻轻吹打几次混匀各组分，避免产生气泡(请勿剧烈震荡或者涡旋混匀)。置于37℃反应30min。待反应完成后，立即将反应管置于冰水浴中冷却5min。之后，反应产物可直接进行转化；也可储存于-20℃，待需要时解冻转化。2、农杆菌感受态的制备（1）挑取农杆菌GV3101（Agrobacteriumtumefaciens）单菌落，接种于10mLYEP培养基中，28℃振荡培养过夜；（2）取400μL菌液置于50mLYEP培养液中，28℃振荡培养5～6h至OD600为0.5；（3）菌液倒入50mL离心管中，6000rpm离心5min后，弃上清液；（4）将菌体重悬于10mL0.15M的NaCl中，之后6000rpm离心5min，弃上清液；（5）菌体用lmL预冷的20mMCaCl2溶液轻轻悬浮，加入预冷的15%甘油，100μL分装，-80℃冰箱保存备用。3、重组质粒转化农杆菌感受态细胞（1）取-80℃保存的100μL农杆菌感受态细胞置冰上，完全解冻后轻轻将细胞悬浮；（2）加入5μL质粒混匀后冰上放置30min；（3）将离心管放入液氮中速冻5min，37℃水浴中热激1min，迅速将转至冰上，冰浴2min；（4）加入1mLYEP液体培养基，28℃振荡培养1h；（5）4000rpm离心5min，加100μLYEP培养液悬浮细胞；（6）将菌液涂布于含有相应抗生素的YEP平板上，28℃培养32～48h；（7）挑取长出的农杆菌菌落于YEP液体培养基28℃摇菌24h，再用PCR对菌落进行检测，结果为阳性的说明表达载体构建成功。4、制备侵染液（1）挑取阳性单克隆菌落到5mLYEP培养液中（含Kan+），28oC摇床180rpm活化培养18h～24h，直到菌液OD值达到0.6左右；（2）取步骤（1）中的1mL菌液接种到50mL的YEP培养液中（含Kan+），相同的条件在摇床进一步扩摇，待菌液OD值达到0.6左右；（3）于离心机中3000rpm，离心10min，收集菌体，加入等体积的渗透缓冲液（含0.2mmol/L的乙酰丁香酮，10mM的MgCl2和10mMMES）重悬浮菌体。5、转化烟草叶片（1）本氏烟草点播于湿润的营养土上，覆膜保湿至种子萌发，萌发的本氏烟草幼苗在20℃的光照培养箱（14h光照/10h黑暗）中培养2个星期后可用于侵染；（2）用1mL的无针头注射器将上述的侵染液打入本氏烟草叶片的背面；同样地，将CsEGL3和CsTTG1的侵染液分别与CsAN1侵染液等体积混合，配置CsAN1+CsEGL3和CsAN1+CsEGL3+CsTTG1侵染液，以相同的方法侵染本氏烟草叶片，之后将植株置于24℃恒温箱中培养48h；（3）4天后开始观察烟草叶片的颜色变化，10天后对积累了花青素的本氏烟草叶片取样，对其进一步分析。实施例3茶树MYB转录因子CsAN1超表达植株的花青素测量1、分别取转化了CsAN1、CsAN1+CsGL3和CsAN1+CsGL3+CsTTG1的烟草的叶片，利用显微镜观察各种转基因烟草叶片的的显微结构，结果见图3。2、花青素浸提：将3g的叶片鲜样于研钵中加入液氮磨碎，之后将其转移到试管中，加入3mL的浸提缓冲液（由18%正丙醇，1%盐酸：81%水配制而成），沸水浴3min，室温静置过夜。浸提结果见图4。3、花青素的测量：用紫外分光光度计测定浸提液在A535和A650的吸光值，最终的花青素含量用(A535～A650)g-1(FW)表示。测定结果见图5。4、花青素成分测定：取10μL（1）的浸提液注射到XSelectHSSC-18SB管（4.6×250mm，5μm，沃特世科技有限公司），用5%甲酸（A）和100%甲醇（B）作为流动相，在520nm检测花青素，具体操作参照发表的文献（Shanetal.2009）检测结果如图6。从图6的结果可知，在转基因烟草中检测到矢车菊色素，（cyanidin-3-O-galactoside）和飞燕草色素（delphinidin-3-O-galactoside）两种主要色素。实施例4为了进一步了解茶树MYB转录因子CsAN1在花青素合成中的作用机理，本实施例研究了花青素合成途径关键结构基因在对照以及超表达烟草中的表达量情况。具体步骤为，根据目的基因的序列设计特异引物和内参基因Actin引物（见表2），采用HipurePlantRNAMiniKit（广州美基）提取相应样品总RNA，反转成cDNA，并以该产物为模板进行qRT-PCR反应，每个反应设3次重复，qRT-PCR反应体系如下：cDNA模板0.25μL，2×SYBRGreenMIX5μL，10μmolL-1正向引物0.5μL，10μmolL-1反向引物0.5μL，加水至总体积达到10μL。qRT-PCR程序：94℃,10min；94℃,10s，55℃,15s，72℃,30s，40个循环。反应产物用融解曲线分析，并用琼脂糖凝胶电泳验证。使用Roche公司的LightCylcer480软件收集数据，不同转基因烟草样品间3种功能基因的相对表达量用CT值的2-△△CT法处理，结果见图7。表2为qRT-PCR检测表达量相关基因的引物序列NbF3’H-FTAAGGCTTCATCCATCCACCNbF3’H-RCAAAGTCATTTCCTCGCACANbDFR-FTTGTTGGTCCATTCCTCACGNbDFR-RCCACGGGCAAGTCCTTATCGNbLDOX-FAGTATGCTAATGACCAACCCTCNbLDOX-RAGTCCCAGCCCAATAGAAAGNbActin-FAGTCCTCTTCCAGCCATCCANbActin-RTAGGAGCCAAAGCCGTGATTSEQUENCELISTING<110>华南农业大学<120>一种茶树MYB转录因子CsAN1及其在调控花青素代谢中的应用<130><160>14<170>PatentInversion3.3<210>1<211>765<212>DNA<213>CsAN1的ORF<400>1atggacattgtttgttgtgttccattaggagtgagaaaaggtgcatggactggagaagaa60gatagtttgctaaagaactgcattgagcaatatggagagggaatgtggcaccaaattcct120tccagagcaggattgaatagatgcagaaaaagttgtagactaagatggctgaattatctg180agaccaaacataaaaagaggcaattttacgatggatgaagttgatctcattatcaagctt240cagaagctgctaggcaatagatggtcgttgattgcgggtagacttccaggaagaacagca300aatgatgtaaaaaactattggaataccaacttacagaagaaactgatcacccaaagagaa360aaggtgaaagccaagactcaagagaagatggaaaccataattatacgacctcggcctcga420atcttctccaaaaatcaaccacggttaatggacaaaactgccattatagaaaatattcga480acaagagacaaccttagcgagccatttccactaccgctaccgctaccaccatcgcgggat540gatggaatatcatgggataacattgttgttaactccaaaattaacaatggaatcacatgg600tccgcaaatggcttgattgaggaggccaatatagggaattgggatgggaaaataagacca660ggtacacatacatcttgtggcaatttcattgatgaagaccagagtgattggagtgacatt720ttctttaataatgtgaacctttgggatctgttaggtgatgaatga765<210>2<211>254<212>PRT<213>CsAN1氨基酸序列<400>2MetAspIleValCysCysValProLeuGlyValArgLysGlyAlaTrp151015ThrGlyGluGluAspSerLeuLeuLysAsnCysIleGluGlnTyrGly202530GluGlyMetTrpHisGlnIleProSerArgAlaGlyLeuAsnArgCys354045ArgLysSerCysArgLeuArgTrpLeuAsnTyrLeuArgProAsnIle505560LysArgGlyAsnPheThrMetAspGluValAspLeuIleIleLysLeu65707580GlnLysLeuLeuGlyAsnArgTrpSerLeuIleAlaGlyArgLeuPro859095GlyArgThrAlaAsnAspValLysAsnTyrTrpAsnThrAsnLeuGln100105110LysLysLeuIleThrGlnArgGluLysValLysAlaLysThrGlnGlu115120125LysMetGluThrIleIleIleArgProArgProArgIlePheSerLys130135140AsnGlnProArgLeuMetAspLysThrAlaIleIleGluAsnIleArg145150155160ThrArgAspAsnLeuSerGluProPheProLeuProLeuProLeuPro165170175ProSerArgAspAspGlyIleSerTrpAspAsnIleValValAsnSer180185190LysIleAsnAsnGlyIleThrTrpSerAlaAsnGlyLeuIleGluGlu195200205AlaAsnIleGlyAsnTrpAspGlyLysIleArgProGlyThrHisThr210215220SerCysGlyAsnPheIleAspGluAspGlnSerAspTrpSerAspIle225230235240PhePheAsnAsnValAsnLeuTrpAspLeuLeuGlyAspGlu245250<210>3<211>23<212>DNA<213>正向引物<400>3tacttattcagacaaacgcacac23<210>4<211>23<212>DNA<213>反向引物<400>4atttcaactctaatttcaaccca23<210>5<211>36<212>DNA<213>pBI121-CsAN1-F<400>5ggactctagaggatccatggacattgtttgttgtgt36<210>6<211>36<212>DNA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