一种耐热精氨酸酶的基因表达序列和应用的制作方法

文档序号:12249164阅读:来源:国知局

技术特征:

1.一种耐热精氨酸酶的基因表达序列,其特征在于对比不同微生物来源精氨酸酶基因,获得其保守氨基酸序列,并根据其氨基酸序列设计简并引物P1及P2,利用简并PCR,以 Rummeliibacillus pycnus SK31.001基因组为模板获得部分精氨酸酶基因序列SEQ ID NO:3;再设计反向引物P3及P4,进行反向PCR;获得耐热精氨酸酶的基因表达序列SEQ ID NO:1,其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

2.根据权利要求1所述的耐热精氨酸酶的基因表达序列,其特征在于部分精氨酸酶基因序列SEQ ID NO:3的获得:根据NCBI数据库中不同来源的精氨酸酶基因序列对比结果,找到保守序列:GVDMPSA, GNIHGM, GVGTPVI 和HLAMEML,并选取两段保守序列设计简并引物:

上游引物P1:5’-ggngtngaya tgggncc-3’,

下游引物P2: 5’-acnggngtnc cnacncc-3’,

提取Rummeliibacillus pycnus SK31.001的总DNA,以其基因组为模板,扩增部分精氨酸酶基因序列,琼脂糖凝胶电泳回收目的片段,并TA克隆至pMD-19T质粒上,测序结果为序列表中SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列。

3.根据权利要求1所述的耐热精氨酸酶的基因表达序列,其特征在于设计反向引物,扩增已知片段的外侧基因序列,引物设计如下:

上游引物P3:5’- tgcgcctaaa gtaaaacctg-3’,

下游引物P4:5’- gaattgcact tggacccat-3’,

选取合适的内切酶Hind Ⅲ单切Rummeliibacillus pycnus SK31.001基因组,再利用T4链接酶环化单切的基因组片段,并以此作为反向PCR的模板,进行反向PCR扩增;扩增已知序列的外侧未知序列;

两者相结合得到精氨酸酶基因的完整序列,其核苷酸序列为SEQ ID NO:1。

4.一种耐热精氨酸酶,其氨基酸序列为SEQ ID NO:2。

5.权利要求1所述的耐热精氨酸酶的基因表达序列的应用,其特征在于在大肠杆菌表达构建重组表达载体,将精氨酸酶编码基因插入到大肠杆菌表达载体中得到表达精氨酸酶的重组表达载体:所述的大肠杆菌表达载体优选为pET-28a(+),构建的重组表达质粒为pET-28a(+)-arg。

6.根据权利要求5所述的耐热精氨酸酶的基因表达序列的应用,其特征在于大肠杆菌表达,筛选得到表达精氨酸酶基因的重组菌株;所述的大肠杆菌优选为大肠杆菌BL21(DE3),构建的重组菌株为E.coliBL21(DE3)-pET-28a(+)-arg。

7.一种制备鸟氨酸的方法,其特征在于是以精氨酸为底物,用权利要求6所述的E.coli BL21(DE3)-pET-28a(+)-arg重组菌全细胞转化精氨酸生成鸟氨酸,反应底物浓度为200g/L,温度40℃,pH9.5,Mn2+浓度为1mM,100mL体系中加入0.3g湿菌体反应6h即得到95.4%转化率的鸟氨酸。

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