鸭疫里默氏杆菌的rpsL突变基因及其应用的制作方法

本发明属于生物技术领域，具体涉及鸭疫里默氏杆菌的rpsL突变基因，还涉及该基因在构建鸭疫里默氏杆菌无痕缺失候选菌株中的应用及构建无痕菌株的方法。

背景技术：

鸭疫里默氏杆菌病是由鸭疫里默氏杆菌(RA)引起的一种接触性传染性疾病，又称为鸭传染性浆膜炎等。已成为危害世界各国养鸭业的一种最常见细菌病。目前采用的防治方法主要有药物防治和疫苗防治。然而，鸭疫里默氏杆菌对多种药物具有耐药性，在很多地区都难以找到该菌的敏感药物。另一方面，鸭疫里默氏杆菌存在多种血清型，且各血清型之间不存在交叉保护作用。所以，疫苗的防治效果也不尽如人意，鸭疫里默氏杆菌感染与流行仍时有发生。深入研究该菌的致病机理，继而开发有效的防治方法已成为大势所趋。

在研究基因功能时，基因敲除是最有效的方法之一。目前，在鸭疫里默氏杆菌基因敲除中所使用的方法为传统的通过接合转移介导的“有痕”缺失，也就是被敲除基因会被抗性基因所替代，并在基因组上留下“疤痕”。且研究基因功能时，经常需要在多个基因进行敲除，每个位点的敲除都需要选择性标记以筛选正确的敲除株。传统方法每次基因敲除后都会将抗性标记基因残留在基因组中，这对于后续研究有很多不利的影响：首先，对一个转化体系而言，适用的抗性标记基因数量是有限的，一个抗性标记基因残留意味着其在以后的基因操作中不能被再次使用，无形中限制了基因操作的次数；其次，外源基因的插入会增加细胞负担，也可能会造成靶基因以外的基因突变，影响菌株的性状；另外，很多标记基因都是药物抗性基因，在制备减毒疫苗时，这种抗性基因的残留会对动物不利，并且这些基因残留在基因组中会为菌株带来抗药性，而这种抗性在环境中有可能进行平行转移，这样又会严重污染环境。因此急需要一种无痕缺失的基因敲除的方法。

技术实现要素：

本发明的目的之一在于提供鸭疫里默氏杆菌的rpsL突变基因；本发明的目的之二在于提供鸭疫里默氏杆菌的rpsL突变基因在构建鸭疫里默氏杆菌无痕缺失候选菌株中的应用；本发明的目的之三在于提供构建无痕缺失菌株的方法。

为实现上述发明目的，本发明提供如下技术方案：

1、鸭疫里默氏杆菌的rpsL突变基因，所述rpsL突变基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

2、所述鸭疫里默氏杆菌的rpsL突变基因在构建鸭疫里默氏杆菌无痕缺失候选菌株中的应用。

3、利用权利要求1所述鸭疫里默氏杆菌的rpsL突变基因构建鸭疫里默氏杆菌无痕缺失的方法，包括如下步骤：

(1)筛选鸭疫里默氏杆菌rps L基因突变菌株；

(2)将pMM47.A质粒用PstI酶切切去在鸭疫里默氏杆菌中的复制起点，回收pMM47.A质粒骨架并连接，然后将鸭疫里默氏杆菌的带启动子的rpsL基因连接至SalI和NcoI酶切位点处，获得自杀载体pORS；所述鸭疫里默氏杆菌的带启动子的rpsL基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；

(3)将待缺基因上游片段和下游片段构成融合片段连接至自杀载体pORS的XhoI和SpeI酶切位点处，获得重组载体，然后将重组载体转化至步骤(1)筛选的鸭疫里默氏杆菌rps L基因突变菌株中，先用头孢西丁筛选获得第一次同源重组的阳性克隆，然后再用链霉素筛选第二次同源重组的阳性克隆，获得所述待缺基因的鸭疫里默氏杆菌无痕缺失株。

进一步，所述鸭疫里默氏杆菌rps L基因突变菌株的筛选方法如下：将在血平板上过夜培养的鸭疫里默氏杆菌RA ATCC11845菌株与胰蛋白胨大豆肉汤培养基中混匀，然后将菌液稀释至OD₆₀₀＝1，再将菌液涂在含有100μg/mL链霉素的血平板培养基上，放在37℃培养过夜之后，挑选长出的单克隆菌落，即获得鸭疫里默氏杆菌rps L基因突变菌株。

进一步，步骤(3)中，所述融合片段由以下方法制得：以鸭疫里默氏杆菌RA ATCC11845为模板，分别以SEQ ID NO.8与SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10与SEQ ID NO.11为引物对进行PCR扩增，将扩增获得的片段进行融合获得融合片段。

进一步，所述PCR扩增的条件为98℃预变性30s；98℃变性10s，55℃退火30s，72℃延伸30s；循环30次；再72℃后延伸7min，最后22℃保存。

进一步，步骤(3)中，所述头孢西丁筛选为使用浓度为1μg/ml的头孢西丁筛选；所述链霉素筛选为使用浓度为100μg/ml链霉素。

本发明的有益效果在于：本发明公开了鸭疫里默氏杆菌的rpsL突变基因，该基因可以用于构建鸭疫里默氏杆菌无痕缺失候选菌株，以此作为候选菌株可以通过基因组结构内直接缺失，无需通过抗性基因来替代目的基因，从而大大降低了缺失株的耐药性，可以使缺失株更好的用于基因缺失疫苗的制备。并且此方法可以在基因组内缺失多个基因，无需费力挑选抗性基因直接就可以进行缺失，大大提高了基因功能研究的效率。此外，本发明的方法很具有生物普遍性，为研究其它细菌的无痕缺失提供了技术参考。

附图说明

图1为pORS.质粒图谱。

图2为鸭疫里默氏杆菌RA0C_1193基因上游序列和下游序列扩增结果(Maker为BM5000+1.5K DNA Maker，upstream为上游序列；downsream为下游序列)。

图3为融合片段电泳检测结果(Maker为BM5000+1.5K DNA Maker)。

图4为融合片段和自杀质粒pORS使用酶切位点XhoI和SpeI同时进行双酶切检测结果。

图5为融合片段和质粒骨架用T4连接酶连接转化DH5α的PCR检测结果。

图6为重组质粒pORS::RA0C_1193up+down转化供体菌S17.1后的PCR鉴定结果。

图7为第一次同源重组的阳性克隆PCR鉴定结果。

图8为第二次同源重组的阳性克隆PCR鉴定结果(每一组中左边泳道为缺失株ATCCsΔRA0C_1193，右边泳道为野生株作为对照)。

图9为RA0C_1193基因的缺失、野生菌株及回补菌株的生长曲线。

具体实施方式

下面将对本发明的优选实施例进行详细的描述。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。

本发明利用鸭疫里默氏杆菌RA ATCC11845血清型基因组上的rpsL基因在抗生素链霉素压力下发生的点突变来作为一种筛选标志，进而发展成一种无痕缺失的方法的技术。

本发明以鸭疫里默氏杆菌RA ATCC11845血清型基因组中对RA0C_1193基因的无痕缺失为例，来说明本发明的具体操作方法。

实施例1、鸭疫里默氏杆菌ATCC11845抗链霉素突变株的筛选

将在血平板上过夜培养的鸭疫里默氏杆菌RA ATCC11845菌株混匀在200μl的胰蛋白胨大豆肉汤培养基(TSB)液体培养基中，稀释到OD₆₀₀＝1，之后将其全部涂在含有100μg/mL链霉素的血平板培养基上，放在37℃培养过夜之后，挑选长出的单克隆菌落，即获得鸭疫里默氏杆菌突变株RA ATCCs。以鸭疫里默氏杆菌突变株RA ATCCs基因组DNA为模板，用rpsL基因的引物对rpsL P1和rpsL P2进行PCR扩增，rpsL P1和rpsL P2引物对序列如下：

rpsL P1：5’-gggacgaaagttgttctatggaag-3’(SEQ ID NO.1)；

rpsL P2：5’-ctgaatgcgatagacttcttaccg-3’(SEQ ID NO.2)；

PCR扩增的条件为98℃预变性30s；98℃变性10s，55℃退火30s，72℃延伸30s；循环30次；再72℃后延伸7min，最后22℃保存。

然后将扩增产物进行测序，获得鸭疫里默氏杆菌突变株RA ATCCs的rpsL序列，具体序列如SEQ ID NO.3所示，然后与未突变的鸭疫里默氏杆菌RA ATCC11845的rpsL基因(SEQ ID NO.4)序列比对。结果显示，鸭疫里默氏杆菌突变株RA ATCCs的rpsL序列鸭疫里默氏杆菌突变株RA ATCCs的128位碱基由A突变为G，因此将鸭疫里默氏杆菌突变株RA ATCCs作为无痕缺失所需要的突变株。

实施例2、无痕缺失突变株的验证

将带有启动子的野生株的rpsL片段克隆到穿梭质粒pLMF03(Genbank：KU997673)，具体方法如下：

以鸭疫里默氏杆菌RA ATCC11845为模板，rpsl exp P1和rpsl exp P2为引物进行PCR扩增，扩增获得带有启动子的野生株的rpsL片段，具体序列如SEQ ID NO.5所示，其中引物序列如下：

rpsl exp P1：5’-acgcgtcgacgtcggccatagcggatcaaaaataatttggttttcg-3’(SEQ ID NO.6)，(下划线表示SalI)；

rpsl exp P2：5’-catgccatggcatgttactttttagcatctttaggacgcttagcaccg-3’(SEQ ID NO.7)，(下划线表示NcoI)；

PCR扩增条件为：98℃预变性30s；98℃变性10s，55℃退火30s，72℃延伸17s；循环30次；再72℃后延伸7min，最后22℃保存。

将扩增产物进行琼脂糖电泳后，回收目的片段，然后将回收片段和质粒pLMF03分别用限制性内切酶SalI和NcoI进行酶切，将回收的片段和质粒骨架用T4连接酶连接，然后将连接产物转化至DH5α，待在抗性平板上长出克隆后进行PCR验证，取含有重组质粒的DH5α，经扩大培养后提取质粒。再通过接合转移的方式将其转入鸭疫里默氏杆菌突变株RA ATCCs，然后检测转化菌株的抗性。结果显示，突变株的表型由抗链霉素变成了对链霉素敏感，结果表明该菌株可用于后续的无痕缺失研究。

实施例3、构建无痕缺失的自杀载体pORS

将穿梭质粒pMM47.A用PstI内切酶切去鸭疫里默氏杆菌中复制的复制起点连接后，之后再将带有启动子的野生株的rpsL片段(SEQ ID NO.5)用SalI和NcoI两个酶切位点酶切入所得载体上，获得自杀载体，命名为pORS，质粒图谱如图1所示。

实施例4、构建无痕缺失鸭疫里默氏杆菌

(1)构建无痕缺失株ATCCsΔRA0C_1193

以鸭疫里默氏杆菌RA0C_1193(861bp)基因为例，以RA ATCC11845为模板，分别采用SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8为引物进行PCR扩增，具体引物序列如下：

RA0C_1193upP1：5’-ccgctcgagcggagaaagggcttagcagaataggtcgccc-3’(SEQ ID NO.8)；

RA0C_1193upP2：5’-cctaaaatccttttattgatttggctaagtttacttttcttgtacgg-3’(SEQ ID NO.9)；

RA0C_1193downP1：5’-ccgtacaagaaaagtaaacttagccaaatcaataaaaggattttagg-3’(SEQ ID NO.10)；

RA0C_1193down P2：5’-gactagtctggcaggtccgctaagtccccagtgagt-3’(SEQ ID NO.11)；

PCR扩增程序为：98℃预变性30s；98℃变性10s，55℃退火30s，72℃延伸30s；循环30次；再72℃后延伸7min，最后22℃保存。即扩增分别获得鸭疫里默氏杆菌RA0C_1193基因的上游805bp和下游746bp，电泳检测图如图2所示。

然后将获得的鸭疫里默氏杆菌RA0C_1193基因的上游805bp和下游746bp进行融合，具体方法如下：

将1μl上游片段和1μl下游片段加8μl ddH₂O稀释10倍之后，取混合物1μl加入PCR反应管中，在加入RA ATCC11845菌液并以此为模板，SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.11为引物进行PCR扩增，扩增获得融合片段。其中PCR扩增程序如下：

98℃预变性30s；98℃变性10s，55℃退火30s，72℃延伸1min；循环30次；再72℃后延伸7min，最后22℃保存。

将扩增获得的融合片段进行电泳检测，结果如图3所示。结果显示，融合后获得约1600bp的片段，表明片段融合成功。

接着将融合片段和自杀质粒pORS同时使用内切酶XhoI和SpeI进行双酶切，之后回收融合片段和质粒骨架，酶切电泳结果如图4所示。将回收的融合片段和质粒骨架用T4连接酶连接，然后将连接产物转化至DH5α，待在抗性平板上长出克隆后进行PCR验证，结果如图5所示。结果表明，融合片段与自杀质粒pORS连接成功，获得的重组质粒命名为pORS::RA0C_1193up+down。

取含有重组质粒的DH5α，经扩大培养后提取质粒，然后将重组质粒pORS::RA0C_1193up+down转化至供体菌S17.1，PCR鉴定结果如图6所示。结果显示，供体菌中含有融合片段，表明重组质粒转化成功。

再通过接合转移的方法将重组质粒pORS::RA0C_1193up+down转移至鸭疫里默氏杆菌抗链霉素的突变株ATCCs中，并涂在含有1μg/ml头孢西丁cfx的血平板上，筛选出第一次同源重组的阳性克隆，并用PCR的方法鉴定，结果如图7所示。然后将阳性克隆在4ml的TSB培养基中37℃180rpm摇菌过夜，第二天早上测OD之后，按照1OD含有鸭疫里默氏杆菌2×10⁹个来计算，将10⁵个菌涂板在含有100μg/ml链霉素的血平板上，使阳性克隆进行第二次同源重组，即将RA0C_1193基因的上游和下游基因整合到基因组，以此来缺失掉RA0C_1193基因，获得无痕缺失株ATCCsΔRA0C_1193。将第二天长出来的单克隆进行分离培养，鉴定缺失株和野生株当中的cfx基因/16s RNA/RA0C_1193基因/RA0C_1193基因的上游805bp下游746bp(若为缺失株由于缺失了RA0C_1193-861bp则有1600bp，若为野生株则有1600+861＝2461bp目的条带扩增出来)，结果如图8所示。

(2)RA0C_1193基因回补

通过对RA0C_1193基因进行回补，来进一步验证确实是该基因被缺失掉而导致细菌表型的变化。

扩增目的基因RA0C_1193，扩增引物如下：

RA0C_1193Comp P1:5’-catgccatggatgagccaaaccataaatac-3’(SEQ ID NO.12)(下划线表示NcoI)；

RA0C_1193Comp P2:5’-ctagtctagattagaaagtgattttgtaagtgcctg-3’(SEQ ID NO.13)(下划线表示XbaI)；

PCR程序为：98℃预变性30s；98℃变性10s，55℃退火30s，72℃延伸30s；循环30次；再72℃后延伸7min，最后22℃保存。

然后将扩增产物连接至穿梭质粒pLMF03上，获得重组质粒pLMF03::RA0C_1193，然后将重组质粒pLMF03::RA0C_1193转化至DH5α，筛选阳性克隆，将阳性克隆扩大培养后提取重组质粒pLMF03::RA0C_1193，再将重组质粒pLMF03::RA0C_1193转化至供体菌S17.1，再通过接合转移的方式转入无痕缺失株ATCCsΔRA0C_1193获得构建回补株ATCCsΔRA0C_1193pLMF03::RA0C_1193。

分别将转化pLMF03的鸭疫里默氏杆菌，无痕缺失株ATCCsΔRA0C_1193和回补株ATCCsΔRA0C_1193pLMF03::RA0C_1193在相同条件下培养，并控制初始OD为0.1，每隔2个小时测一次OD，结果如图9所示。结果显示，缺失之后，鸭疫里默氏杆菌生长状态明显比野生株要差。而回补之后其生长状态又有明显的回升，因此可以说明RA0C_1193基因的缺失确实影响了该细菌生长状态。

上述实验证明了突变株RA ATCCs的rpsL序列能够用于鸭疫里默氏杆菌基因的无痕缺失。

最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。