鸭疫里默氏杆菌的rpsL突变基因及其应用的制作方法

文档序号:12249139阅读:来源:国知局

技术特征:

1.鸭疫里默氏杆菌的rpsL突变基因,所述rpsL突变基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

2.权利要求1所述鸭疫里默氏杆菌的rpsL突变基因在构建鸭疫里默氏杆菌无痕缺失候选菌株中的应用。

3.利用权利要求1所述鸭疫里默氏杆菌的rpsL突变基因构建鸭疫里默氏杆菌无痕缺失的方法,其特征在于,包括如下步骤:

(1)筛选鸭疫里默氏杆菌rps L基因突变菌株;

(2)将pMM47.A质粒用PstI酶切切去在鸭疫里默氏杆菌中的复制起点,回收pMM47.A质粒骨架并连接,然后将鸭疫里默氏杆菌的带启动子的rpsL基因连接至SalI和NcoI酶切位点处,获得自杀载体pORS;所述鸭疫里默氏杆菌的带启动子的rpsL基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示;

(3)将待缺基因的上游片段和下游片段构成融合片段连接至自杀载体pORS的XhoI和SpeI酶切位点处,获得重组载体,然后将重组载体转化至步骤(1)筛选的鸭疫里默氏杆菌rps L基因突变菌株中,先用头孢西丁筛选获得第一次同源重组的阳性克隆,然后再用链霉素筛选第二次同源重组的阳性克隆,获得无痕缺失所述待缺基因的鸭疫里默氏杆菌。

4.根据权利要求3所述的方法,其特征在于:所述鸭疫里默氏杆菌rps L基因突变菌株的筛选方法如下:将在血平板上过夜培养的鸭疫里默氏杆菌RA ATCC11845菌株与胰蛋白胨大豆肉汤培养基中混匀,然后将菌液稀释至OD600=1,再将菌液涂在含有100μg/mL链霉素的血平板培养基上,放在37℃培养过夜之后,挑选长出的单克隆菌落,通过筛选rpsL基因第128位碱基由A变为G的菌株,即获得鸭疫里默氏杆菌rps L基因突变菌株。

5.根据权利要求3所述的方法,其特征在于:步骤(3)中,所述融合片段由以下方法制得:以鸭疫里默氏杆菌RA ATCC11845为模板,分别以SEQ ID NO.8与SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10与SEQ ID NO.11为引物对进行PCR扩增,将扩增获得的片段进行融合获得融合片段。

6.根据权利要求5所述的方法,其特征在于:所述PCR扩增的条件为98℃预变性30s;98℃变性10s,55℃退火30s,72℃延伸30s;循环30次;再72℃后延伸7min,最后22℃保存。

7.根据权利要求3~5任一项所述的方法,其特征在于:步骤(3)中,所述头孢西丁筛选为使用浓度为1μg/ml的头孢西丁筛选;所述链霉素筛选为使用浓度为100μg/ml链霉素。

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