黄芩苷的衍生物、制备方法及用途与流程

本发明涉及药物化学、药理学和治疗学领域，更具体涉及黄芩苷新的衍生物、制备方法及其抗菌新用途。
背景技术：
：金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureu)是严重危害人类健康的一种病原菌，是引起人类化脓感染中最常见的病原菌。可直接导致局部化脓感染、肺炎、伪膜性肠炎、心包炎等，甚至败血症、脓毒症等全身感染。由于各种耐药细菌的出现和蔓延，新型抗细菌药物正在成为研究热点。抗生素的滥用造成的细菌耐药性问题尤为突出，面对严峻的细菌抗生素耐药性，我们亟需发现新型的抗细菌感染药物。因此，开发抗金黄色葡萄球菌特别是抗甲氧西林耐药金黄色葡萄球菌(MRSA)的抗菌药物，具有非常重要的临床意义和科学价值。技术实现要素：本发明的目的在于提供黄芩苷衍生物的制备方法和新用途。本发明的另一目的在于提供具有新型化学结构的黄芩苷衍生物。本发明的第三目的，是式(I)化合物或其药学上可接受的盐的应用，用于制备抗菌药物。所述药学上可接受的盐为钠、钾、钙、镁等金属盐类；所述抗菌药物为抗金黄色葡萄球菌的药物；所述抗金黄色葡萄球菌为抗甲氧西林敏感的金黄色葡萄球菌或抗甲氧西林耐药的金黄色葡萄球菌(MRSA)。本发明的第四目的，是提供抗菌药物组合物。本发明式(I)化合物的制备方法：8-磺酸基黄芩素的制备称取黄芩苷粉末5g，加入25ml发烟硫酸和浓硫酸混合物(1∶3)，在40℃的恒温硅油浴中反应1小时。反应结束后，将所得产物倒入冰水中，静置12小时。过滤、取沉淀、重结晶，得黄色针状结晶(甲醇)。TOF-MS：m/s269[M-H-SO32-]-、349[M-H]-；核磁共振氢谱和碳谱数据见表1。表11H-NMRand13C-NMRspectraldataof8-sulfatebaicaleininDMSO-d6(300MHz)以上化学数据证明，所得产物为8-磺酸基黄芩素，纯度高于98％。3’-磺酸基黄芩素的制备称取10g黄芩苷粉末，加入50ml发烟硫酸，在50℃的恒温硅油浴中反应1.5小时。反应结束后，将反应液倒入冰水中，静置12小时后，过滤、取沉淀，重结晶，得黄色针状结晶(甲醇)。TOF-MS：349[M-H]-；核磁共振氢谱和碳数据谱见表2表21H-NMRand13C-NMRspectraldataof3’-sulfatebaicaleininDMSO-d6(300MHz)以上波谱学数据证明，所得产物为3’-二磺酸基黄芩素，纯度高于98％。8，3′-二磺酸基黄芩素的制备黄芩苷20克，加发烟硫酸100ml，在85℃下，搅拌7小时。反应结束后，将所得产物倒入冰水中，静置12小时。过滤、取沉淀，重结晶，得黄色针状结晶(甲醇)。质谱：ESI-MS(负离子模式)：m/z429[M-H]-，分子量：MW＝430，分子式为C15H10O11S2核磁共振氢谱和碳谱数据见表3表31H-NMR(400MHz)和13C-NMR(100MHz)数据(DMSO-d6)以上化学数据证明，所得产物为8，3’-二磺酸基黄芩素，纯度高于98％本发明式(I)化合物的抗菌活性测定(牛津杯法)实验菌株金黄色葡萄球菌ATCC6538(Staphylococcusaureu)购自中国科学院微生物保藏中心；临床分离株，经北京大学临床药理研究所，系统鉴定，为耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)。实验药品黄芩素、黄芩苷、8-磺酸基黄芩素、3’-磺酸基黄芩素、8，3’-二磺酸基黄芩素，为本研究室自制，纯度98％以上。培养基MH(Mueller-HintonAgar)固体培养基：英国OXOID，去离子水(38g/1L)LB(LysogenyBroth)液体培养基：胰蛋白胨(Tryptone，OXOID，10g)、酵母提取物(Yeast，OXOID，5g)、氯化钠(NaCl，AMRESCO，10g)、去离子水(1000ml)主要仪器TCH纯水机、哈东联超净工作台(DL-CJ-1NDII型)、牛津杯(外径8mm，内径6mm，高10mm)、Bio-rad680酶标仪、OHAUS电子天平、德国HeraeusB5060EK-CO2恒温培养箱、日本SANYOMLS-3750型高压灭菌锅、上海智城ZHWY-100H型恒温振荡器制备平板将经过高压灭菌的MH培养基冷却至45-50℃后，使用直径90mm平皿在水平的超净工作台上倾注，琼脂厚度为4±0.5mm，琼脂冷却至室温，若当天不使用则塑料包装放于4℃冰箱备用，并且应于制备7天内使用。药物配制分别将黄芩素、黄芩苷、8-磺酸基黄芩素、3’-磺酸基黄芩素、8，3’-二磺酸基黄芩素按需要用灭菌水配制成2mg/ml的母液，低温避光保存备用，使用时按照需要用灭菌水稀释成相应浓度。实验过程将菌接种于MH平板，37℃培养16～18小时。从琼脂平板上挑取至少3～5个形态特征一致的菌落，用接种环接触菌落顶部后将细菌转移到1ml生理盐水中，并用生理盐水调整菌液至1x108CFU/ml。用无菌棉拭子蘸取菌液，在管壁上挤压去掉多余菌液，用棉拭子在MH培养基表面划线接种，再重复两次，每次将平板旋转60°，最后沿周边绕两圈，保证涂布均匀。静待平板表面多余的水分被琼脂吸收，用无菌镊子取4个牛津杯等距离轻放，注入药品150μL。静止1h后放于恒温培养箱36℃培养18～24h。观察并测量抑菌圈直径，抑菌圈的边缘以肉眼见不到细菌明显生长为限。以溶解溶剂为对照组，每组3个平行实验，取平均值。实验结果式(I)化合物对金黄色葡萄球菌的抑制作用，抑菌圈数据(平均值±标准差)见表4表4式(I)化合物对S.a的抑菌圈大小比较实验结果表明，式(I)化合物明显抑制金黄色葡萄球菌生长，而黄芩素和黄芩苷没有抑制作用。式(I)化合物对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)的抑制作用，抑菌圈数据(平均值±标准差)见表5表5式(I)化合物对MRSA的抑菌圈大小比较实验结果表明，式(I)化合物明显抑制耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)生长，而黄芩素和黄芩苷未显示抑制作用。本发明式(l)化合物最低抑菌浓度(MIC)的测定主要仪器与试剂TCH纯水机、哈东联超净台(DL-CJ-1NDII)、Bio-rad680酶标仪、OHAUS电子天平、德国HeraeusB5060EK-CO2恒温培养箱、日本SANYOMLS-3750型高压灭菌锅、上海智城ZHWY-100H型恒温振荡器实验方法二甲基亚砜(DMSO)配制药液(40.96mg/ml)。从MH平板上挑单个菌落，接种于10mlLB液体培养基中，36℃，200r/min，培养过夜。用LB液体培养基调节菌液浓度至1x108CFU/ml。每组取11根摇菌管，第一管放9mlLB液体培养基，其余放5mlLB液体培养基，取40.96mg/ml的药液1ml加入第一管中，再从中取出5ml，加入下一管，依次倍比稀释至第十一管，并从第十一管中弃去5ml，每管药液的浓度分别为4096、2048、1024、512、256、128、64、32、16、8、4微克/毫升。再取一根摇菌管，只加入5mlLB液体培养基，作为阳性对照。第一至第十二号摇菌管均加入500微升菌液。第十三号摇菌管不加菌液，作为阴性对照。设置空白对照组，取11根摇菌管，第一管放9ml液体培养基和1mlDMSO，其余放5mlLB液体培养基，从第一管中取出5ml，加入下一管，依次倍比稀释至第十一管，每管加入500微升菌液。在36℃的恒温摇床中培养24小时，肉眼观察试管中的细菌生长完全被抑制时的最低药物浓度，此浓度即为该药物对金黄色葡萄球菌的MIC。结果(见表6)表-6式(I)化合物对S.a和MRSA的MIC(μg/ml)实验结果表明，式(I)化合物在低浓度下，明显抑制金黄色葡萄球菌生长，特别是对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)的抑制作用更强；而黄芩素和黄芩苷在相同条件下未显示抑菌作用。附图说明图1黄芩素对金黄色葡萄球菌的抑制作用(浓度：微克/毫升)左图右上：2000；左上：1750；右下：1500；左下：1250右图右上：1000，左上：750，右下：500，左下：250图2黄芩苷对金黄色葡萄球菌的抑制作用(浓度：微克/毫升)左图右上：2000；左上：1750；右下：1500；左下：1250右图右上：1000，左上：750，右下：500，左下：250图38-磺酸基黄芩素对金黄色葡萄球菌的抑制作用(浓度：微克/毫升)左图右上：2000；左上：1500；右下：1000；左下：500右图右上：1750；左上：1250；右下：750；左下：250图43’-磺酸基黄芩素对金黄色葡萄球菌的抑制作用(浓度：微克/毫升)左图右上：2000；左上：1500；右下：1000；左下：500右图右上：1750；左上：1250；右下：750；左下：250图58，3’-二磺酸基黄芩素对金黄色葡萄球菌的抑制作用(浓度：微克/毫升)左图左上：2000；右上：1750；右下：1250；左下：1500右图右上：1000；左上：750；右下：500；左下：250图6黄芩素对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)的抑制作用(浓度：微克/毫升)左图右上：2000；左上：1750；右下：1500；左下：1250右图右上：1000，左上：750，右下：500，左下：250图7黄芩苷对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)的抑制作用(浓度：微克/毫升)左图右上：2000；左上：1750；右下：1500；左下：1250右图右上：1000，左上：750，右下：500，左下：250图88-磺酸基黄芩素对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)的抑制作用(浓度：微克/毫升)左图右上：2000；左上：1750；右下：1500；左下：1250右图右上：1000，左上：750，右下：500，左下：250图93’-磺酸基黄芩素对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)的抑制作用(浓度：微克/毫升)左图右上：2000；左上：1750；右下：1500；左下：1250右图右上：1000，左上：750，右下：500，左下：250图108，3’-二磺酸基黄芩素对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)的抑制作用(浓度：微克/毫升)左图右上：2000；左上：1750；右下：1500；左下：1250右图右上：1000，左上：750，右下：500，左下：250下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。具体实施方式本申发明人经过广泛而深入的研究，首次意外发现黄芩苷的衍生物对金黄色葡萄球菌有抑制作用，可以制备抗菌药物，特别是制备抗金黄色葡萄球菌的药物。应用本发明的式(I)化合物，可以用于制备抗菌药物；所述抗菌药物为抗金黄色葡萄球菌的药物；所述抗金黄色葡萄球菌为抗甲氧西林敏感的金黄色葡萄球菌或抗甲氧西林耐药的金黄色葡萄球菌(MRSA)。药物组合物本发明的药物组合物，包含式(I)化合物或其药学上可接受的盐作为活性成分；以及药学上可接受的载体。通常，药物组合物含有10-2000mg活性成分/剂，更佳地，含有50-1000mg活性成分/剂。较佳地，所述的“一剂”为一个药片。“药学上可接受的载体”指的是：一种或多种相容性固体或液体填料或凝胶物质，它们适合于人使用，而且必须有足够的纯度和足够低的毒性。“相容性”在此指的是组合物中各组份能和本发明的活性成分以及它们之间相互掺和，而不明显降低活性成分的药效。药学上可以接受的载体部分例子有纤维素及其衍生物(如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素钠、纤维素乙酸酯等)、明胶、滑石、固体润滑剂(如硬脂酸、硬脂酸镁)、硫酸钙、植物油(如豆油、芝麻油、花生油、橄榄油等)、多元醇(如丙二醇、甘油、甘露醇、山梨醇等)、乳化剂(如吐温)、润湿剂(如十二烷基硫酸钠)、着色剂、调味剂、稳定剂、抗氧化剂、防腐剂、无热原水等。本发明的活性成分或药物组合物的施用方式没有特别限制，代表性的施用方式包括(但并不限于)：口服、瘤内、直肠、肠胃外(静脉内、肌肉内或皮下)等。用于口服给药的固体剂型包括胶囊剂、片剂、丸剂、散剂和颗粒剂。在这些固体剂型中，活性成分与至少一种常规惰性赋形剂(或载体)混合，如柠檬酸钠或磷酸二钙，或与下述成分混合：(a)填料或增容剂，例如，淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇和硅酸；(b)粘合剂，例如，羟甲基纤维素、藻酸盐、明胶、聚乙烯基吡咯烷酮、蔗糖和阿拉伯胶；(c)保湿剂，例如，甘油；(d)崩解剂，例如，琼脂、碳酸钙、马铃薯淀粉或木薯淀粉、藻酸、某些复合硅酸盐、和碳酸钠；(e)缓溶剂，例如石蜡；(f)吸收加速剂，例如酚性化合物；(g)润湿剂，例如鲸蜡醇和单硬脂酸甘油酯；(h)吸附剂，例如，高岭土；和(i)润滑剂，例如，滑石、硬脂酸钙、硬脂酸镁、固体聚乙二醇、十二烷基硫酸钠，或其混合物。胶囊剂、片剂和丸剂中，剂型也可包含缓冲剂。所述的固体剂型还可采用包衣和壳材制备，如肠衣和其它本领域公知的材料。它们可包含不透明剂，并且，这种组合物中活性成分的释放可以延迟的方式在消化道内的某一部分中释放。可采用的包埋组分的实例是聚合物质和蜡类物质。用于口服给药的液体剂型包括药学上可接受的乳液、溶液、悬浮液、糖浆或酊剂。除了活性成分外，液体剂型可包含本领域中常规采用的惰性稀释剂，如水或其它溶剂，增溶剂和乳化剂，例知，乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、丙二醇、1，3-丁二醇、二甲基甲酰胺以及油，特别是棉籽油、花生油、玉米胚油、橄榄油、蓖麻油和芝麻油或这些物质的混合物等。除了这些惰性稀释剂外，组合物也可包含助剂，如润湿剂、乳化剂和悬浮剂、甜味剂、矫味剂和香料。除了活性成分外，悬浮液可包含悬浮剂，例如，乙氧基化异十八烷醇、聚氧乙烯山梨醇和脱水山梨醇酯、微晶纤维素、甲醇铝和琼脂或这些物质的混合物等。用于肠胃外注射的组合物可包含生理上可接受的无菌含水或无水溶液、分散液、悬浮液或乳液，和用于重新溶解成无菌的可注射溶液或分散液的无菌粉末。适宜的含水和非水载体、稀释剂、溶剂或赋形剂包括水、乙醇、多元醇及其适宜的混合物。本发明化合物可以单独给药，或者与其他治疗药物联合给药。使用药物组合物时，是将安全有效量的本发明化合物适用于需要治疗的哺乳动物(如人)，其中施用时剂量为药学上认为的有效给药剂量，对于60kg体重的人而言，日给药剂量通常为20～2000mg，优选50～1000mg。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。本发明提到的上述特征，或实施例提到的特征可以任意组合。本案说明书所揭示的所有特征可与任何组合物形式并用，说明书中所揭示的各个特征，可以被任何提供相同、均等或相似目的的替代性特征取代。因此除有特别说明，所揭示的特征仅为均等或相似特征的一般性例子。本发明的有益之处在于：(1)本发明提供了具有新型化学结构的黄芩苷衍生物。(2)本发明提供了黄芩苷衍生物的制备方法，工艺简单高效。(3)本发明首次发现了黄芩苷新型衍生物的新用途，可以用于制备抗菌药物，特别是用于制备抗金黄色葡萄球菌的药物。向所需要的对象或向环境中施用安全有效量的式(I)化合物，所述需要的对象包括人或非人哺乳动物。本发明中，“安全有效量”指的是：活性成分式(I)化合物的量足以明显改善病情，而不至于产生严重的副作用。应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。本发明所述的式(I)化合物，其化学结构如下：(I)式中，R1，R2可为磺酸基(-SO3H)或氢原子(H)。化合物1.8-磺酸基黄芩素(R1＝SO3H，R2＝H)化合物2.3’-磺酸基黄芩素(R1＝H，R2＝SO3H)化合物3.8，3’-二磺酸基黄芩素(R1＝R2＝SO3H)其制备包括有以下步骤：以黄芩苷为原料，加硫酸或发烟硫酸或二者的混合物，在30～120℃条件下，搅拌1-20小时。反应结束后，将反应液倒入冰水中，静置、收集沉淀，重结晶。其中硫酸或发烟硫酸或二者的混合物的用量，最好为黄芩苷原料量的3～30倍。本发明所述的式(I)化合物，与常规的药用辅剂如赋形剂、崩解剂、黏合剂、润滑剂、抗氧化剂、包衣剂、着色剂、芳香剂、表面活性剂等混合，可将其制成颗粒剂、胶囊剂、片剂的等固体口服制剂。由于磺酸基黄酮具有良好的水溶性，式(I)化合物也特别适用于按照采用常规制剂技术制备成注射液、糖浆液等液体制剂。实施例1：称取黄芩苷粉末50g，加入250ml发烟硫酸和浓硫酸混合物(1∶3)，在40℃的恒温硅油浴中反应1小时。反应结束后，将所得产物倒入冰水中，静置12小时。过滤、取沉淀，重结晶，得黄色针状结晶(甲醇)。TOF-MS：m/s269[M-H-SO32-]-、349[M-H]-；核磁共振氢谱和碳谱数据见表7表7.1H-NMRand13C-NMRspectraldataof8-sulfatebaicaleininDMSO-d6(300MHz)以上化学数据证明，所得产物为8-磺酸基黄芩素，纯度高于98％。实施例2：8-磺酸基黄芩素口服液：将50000mg8-磺酸基黄芩素，溶于2000ml水中，制成2.5％浓度的水溶液，调节pH至5.5～6.5，加热溶解，混合均匀，装入10ml药瓶中，封口、消毒。服用方法：口服，每日服用250-1500mg。实施例33’-磺酸基黄芩素的制备称取10g黄芩苷粉末，加入50ml发烟硫酸，在50℃的恒温硅油浴中反应1.5小时。反应结束后，将反应液倒入冰水中，静置12小时后，过滤、取沉淀、重结晶，得黄色针状结晶(甲醇)。TOF-MS：349[M-H]-；核磁共振氢谱和碳谱数据见表8表81H-NMRand13C-NMRspectmldataof3'-sulfatebaicaleininDMSO-d6(300MHz)以上化学数据证明，所得产物为3’-磺酸基黄芩素，纯度高于98％。实施例43′-磺酸基黄芩素注射液：取3′-磺酸基黄芩素5000mg，溶于500ml水中，制成水溶液，调节pH至5.5～6.5，加热溶解，混合均匀，分装成100mg/10ml/支的注射液，蒸汽流通灭菌30分钟。用法用量：肌注或静脉注射，每次100-1000mg。实施例58，3′-二磺酸基黄芩素的制备：黄芩苷200克，溶于1升发烟硫酸中，在85℃搅拌7小时，反应结束后，将所得产物倒入冰水中，静置12小时。过滤、取沉淀，重结晶，得黄色针状结晶180克(甲醇)。该产品的化学结构鉴定数据如下：质谱：ESI-MS(负离子模式)：m/z429[M-H]-，分子量：MW＝430，分子式为C15H10O11S2。核磁共振氢谱和碳谱数据见表9表91H-NMR(400MHz)和13C-NMR(100MHz)数据(DMSO-d6)No.δHδC2162.636.86(1H，s)103.94182.05147.16129.07150.68110.09146.610103.81’130.22’8.21(1H，s)123.03’148.94’7.80(1H，dt，J＝7.6，1.2Hz)128.95’7.58(1H，t，J＝8.0Hz)128.76’8.35(1H，dt，J＝8.0，1.2Hz)127.25-OH12.85(1H，s)6-OH8.65(1H，s)7-OH12.54(1H，s)经上述波谱学方法鉴定，该产品为8，3′-二磺酸基黄芩素，纯度高于98％。实施例6：8，3′-二磺酸基黄芩素片剂：取8，3′-二磺酸基黄芩素2000g，按公知片剂制备方法，加入淀粉，糊精、硬酯酸镁等，混合制成湿粒，机器冲压成片，每片含8，3′-二磺酸基黄酮250mg。用法用量：口服，每日2-3次，每次250mg-1500mg。本发明的药物剂型也完全不限于此，还可以制备成更多的剂型，如滴丸、胶囊剂、软胶囊剂、缓控释制剂、粉针剂等。当前第1页1 2 3