htrA基因缺失的减毒沙门氏菌突变株及其构建方法以及在提高黑色素瘤靶向性中的应用与流程

文档序号:12097009阅读:来源:国知局

技术特征:

1.一种新的减毒沙门氏菌突变株,其特征在于,所述菌株是将减毒沙门氏菌VNP20009的基因组中序列为SEQ ID N0:1的多核苷酸片段敲除缺失,并替换成序列为SEQ ID N0:2的多核苷酸片段。

2.如权利要求1所述的一种新的减毒沙门氏菌突变株,其特征在于,与减毒沙门氏菌VNP20009相比,其形态:包括长度和宽度,体外生长速率,在B16F10小鼠黑色素瘤细胞中的生长,及对RAW264.7巨噬细胞的侵染能力均没有显著性差异。

3.如权利要求1所述的一种新的减毒沙门氏菌突变株,其特征在于与减毒沙门氏菌VNP20009相比,其在巨噬细胞中的增殖能力明显降低。

4.如权利要求1所述的一种新的减毒沙门氏菌突变株的构建方法,包括下列步骤:

1)以减毒沙门氏菌VNP20009为出发菌株,将质粒pKD46转化到减毒沙门氏菌VNP20009的感受态细胞,并诱导其表达λred同源重组蛋白系统;

2)根据减毒沙门氏菌VNP20009的htrA基因的上下游DNA序列,设计基因敲除鉴定PCR引物;根据质粒PKD4分子序列,设计打靶片段的引物;

3)将线性基因打靶片段转化到步骤1)所得减毒沙门氏菌VNP20009的感受态细胞,筛选具有卡纳抗性的减毒沙门氏菌菌落,PCR测序鉴定,获得卡纳抗性基因取代htrA基因的重组菌株;

4)将步骤3)所得重组菌株筛选,得到消除质粒pKD46的重组菌株;

5)将表达FLP重组酶的质粒pCP20电转化入步骤4)所得的重组菌株,经筛选、培养,诱导卡纳抗性基因和温敏型质粒pCP20的消除;

6)对步骤5)所得的重组菌株进行氨苄青霉素和卡纳霉素敏感性检测,筛选对氨苄青霉素和卡纳霉素均敏感的重组菌株菌落,经PCR产物电泳和测序鉴定证实基因htrA被彻底敲除,即得到减毒沙门氏菌VNP20009的htrA基因敲除突变株△htrA。

5.如权利要求4所述一种新的减毒沙门氏菌突变株的构建方法,其特征在于,步骤1)中,采用Red同源重组法,将减毒沙门氏菌VNP20009中序列为SEQ ID NO:1的多核苷酸片段替换成序列为SEQ ID NO:2的多核苷酸片段。

6.如权利要求5所述的一种新的减毒沙门氏菌突变株的构建方法,其特征在于:步骤2)中所述打靶上游引物序列是SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列,打靶下游引物序列是SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列。

7.如权利要求6所述的一种新的减毒沙门氏菌突变株的构建方法,其特征在于:步骤2)中所述基因鉴定上游引物序列是SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列,鉴定下游引物序列是SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列。

8.如权利要求1-3任意一项所述的一种新的减毒沙门氏菌突变株,其特征为:所述减毒沙门氏菌突变株的安全性高;所述减毒沙门氏菌突变株的对黑色素瘤的靶向性高,能够在黑色素瘤中靶向性富集。

9.一种降低减毒沙门氏菌VNP20009在巨噬细胞内增殖能力的方法,其特征为:将减毒沙门氏菌VNP20009的基因组中的序列为SEQ ID N0:1的多核苷酸片段敲除缺失,并替换成序列为SEQ ID N0:2的多核苷酸片段;具体步骤如下:

1)以减毒沙门氏菌VNP20009为出发菌株,将质粒pKD46转化到减毒沙门氏菌VNP20009的感受态细胞,并诱导其表达λred同源重组蛋白系统;

2)根据减毒沙门氏菌VNP20009的htrA基因的上下游DNA序列,设计基因敲除鉴定PCR引物;根据质粒PKD4分子序列,设计打靶片段的引物;

3)将线性基因打靶片段转化到步骤1)所得减毒沙门氏菌VNP20009的感受态细胞,筛选具有卡纳抗性的减毒沙门氏菌菌落,PCR测序鉴定,获得卡纳抗性基因取代htrA基因的重组菌株;

4)将步骤3)所得重组菌株筛选,得到消除质粒pKD46的重组菌株;

5)将表达FLP重组酶的质粒pCP20电转化入步骤4)所得的重组菌株,经筛选、培养,诱导卡纳抗性基因和温敏型质粒pCP20的消除;

6)对步骤5)所得的重组菌株进行氨苄青霉素和卡纳霉素敏感性检测,筛选对氨苄青霉素和卡纳霉素均敏感的重组菌株菌落,经PCR产物电泳和测序鉴定证实基因htrA被彻底敲除,即得到减毒沙门氏菌VNP20009的htrA基因敲除突变株△htrA;

其中步骤1)中,采用Red同源重组法,将减毒沙门氏菌VNP20009中序列为SEQ ID NO:1的多核苷酸片段替换成序列为SEQ ID NO:2的多核苷酸片段;

其中步骤2)中所述打靶上游引物序列是SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列,打靶下游引物序列是SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列;

其中步骤2)中所述基因鉴定上游引物序列是SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列,鉴定下游引物序列是SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列。

10.一种提高减毒沙门氏菌VNP20009对黑色素瘤靶向性的方法,其特征为:将减毒沙门氏菌VNP20009的基因组中的序列为SEQ ID N0:1的多核苷酸片段敲除缺失,并替换成序列为SEQ ID N0:2的多核苷酸片段;具体步骤如下:

1)以减毒沙门氏菌VNP20009为出发菌株,将质粒pKD46转化到减毒沙门氏菌VNP20009的感受态细胞,并诱导其表达λred同源重组蛋白系统;

2)根据减毒沙门氏菌VNP20009的htrA基因的上下游DNA序列,设计基因敲除鉴定PCR引物;根据质粒PKD4分子序列,设计打靶片段的引物;

3)将线性基因打靶片段转化到步骤1)所得减毒沙门氏菌VNP20009的感受态细胞,筛选具有卡纳抗性的减毒沙门氏菌菌落,PCR测序鉴定,获得卡纳抗性基因取代htrA基因的重组菌株;

4)将步骤3)所得重组菌株筛选,得到消除质粒pKD46的重组菌株;

5)将表达FLP重组酶的质粒pCP20电转化入步骤4)所得的重组菌株,经筛选、培养,诱导卡纳抗性基因和温敏型质粒pCP20的消除;

6)对步骤5)所得的重组菌株进行氨苄青霉素和卡纳霉素敏感性检测,筛选对氨苄青霉素和卡纳霉素均敏感的重组菌株菌落,经PCR产物电泳和测序鉴定证实基因htrA被彻底敲除,即得到减毒沙门氏菌VNP20009的htrA基因敲除突变株△htrA;

其中步骤1)中,采用Red同源重组法,将减毒沙门氏菌VNP20009中序列为SEQ ID NO:1的多核苷酸片段替换成序列为SEQ ID NO:2的多核苷酸片段;

其中步骤2)中所述打靶上游引物序列是SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列,打靶下游引物序列是SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列;

其中步骤2)中所述基因鉴定上游引物序列是SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列,鉴定下游引物序列是SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列。

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