一种奶牛乳房炎检测试剂盒的制作方法

本发明涉及检测
技术领域：
，特别涉及一种奶牛乳房炎检测试剂盒。
背景技术：
：奶牛乳房炎(Mastitis)是奶牛乳腺受到物理、化学、微生物等因素刺激所引起的奶牛乳房的炎症，表现为乳汁发生理化性质及细胞学性质的变化、乳腺组织发生病理学变化，是奶牛的常发病之一。根据乳房和乳汁有无临床可见的变化将乳房炎分为临床型乳房炎(ClinicalMastitis)和隐性型乳房炎(SubclinicalMastitis)。隐性乳房炎表现为患牛的乳房和乳汁肉眼观察无异常，需要通过体细胞计数或借助其他诊断方法才能发现的乳房炎症。据国际奶牛联合会统计，20世纪70年代，奶牛临床型乳房炎患病率约2％，隐性乳房炎病牛高达50％；美国饲养的1100万头奶牛中，半数患有各种类型乳房炎；日本全国平均乳房炎患病率为45.1％。我国乳房炎的发生率更高，一般在20％-70％。中国农科院中兽医研究所对西北、华北、东北、华南地区22个城市32个奶牛场1037头成年泌乳牛进行临床型乳房炎病因及发病情况调查，并对其中5个地区20个奶牛场3384头泌乳牛用兰州乳房炎实验进行隐性乳房炎调查，结果表明临床型乳房炎发病率为33.41％，隐性乳房炎奶牛头阳性率为73.91％，阳性乳区检出率为44.74％。据报道，北京和天津地区的隐性乳房炎阳性率为50％-80.9％；兰州和太原的隐性乳房炎的发病率为50％左右。青海省某奶牛场隐性乳房炎的乳头患病率和乳区患病率分别为54.08％和25.89％。综上所述，奶牛乳房炎在世界范围内感染率都很高，在我国奶牛乳房炎的感染情况也相当严重，乳房炎感染类型主要以隐性型为主。乳房炎对奶牛养殖业、牛奶的营养价值和食品安全带来巨大的危害。首先乳房炎引起严重的经济损失，国外对奶牛乳房炎引起的经济损失的传统估计是根据奶产量的降低、奶的丢失、药费开支、兽医费用和劳动力费用等的增加来统计。据报道，英国每年治疗奶牛乳房炎的平均花费为每头奶牛187英镑，美国每年用于每头奶牛乳房炎的花费为177-182美元，芬兰、挪威、瑞典每年因乳房炎问题淘汰的奶牛占淘汰奶牛的35％、19％和22％，可见乳房炎的发生给奶牛养殖业带来的经济损失巨大。在这些经济损失中，由于产奶量的降低引起的损失占70％，由于患病而使奶牛提早淘汰占14％，废弃乳汁占7％，治疗及兽医费用占8％等，而且经济损失主要来自于隐性乳房炎，其造成的损失占母牛每年总生产能力的10-11％。其次，乳房炎使乳的品质大大下降，乳中含有丰富的蛋白质、脂肪和糖类，在乳房炎疾病期间，致病菌损害乳腺的分泌细胞，引起乳腺组织损伤，某些营养成分丢失，使营养成分不全而降低牛奶的保健作用。隐性乳房炎乳汁中氨基酸总量也由平均2.2387g/100mL降低了21％，其中蛋氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸5种必需氨基酸及组氨酸、精氨酸显著降低；乳糖、酪蛋白、脂肪、Ca2+、P3-、K+等有益成分的含量均降低或明显降低；而免疫球蛋白、酯酶、炎性因子、致病菌及其产生的毒素等有害成分的含量则增加，热稳定性降低。此外，奶牛患有乳房炎疾病后所产的乳汁中含有大量的炎性因子、致病菌及其产生的毒素，如果饮用了消毒不严或搀杂了含有致病菌的牛奶，则会使人感到身体不适，严重者可诱发疾病。在治疗乳房炎疾病过程中出现滥用抗生素，有些经营者不淘汰治疗期间的患牛乳汁，造成抗生素在牛奶中残留，引起食用者发生过敏反应，尤其对老年人和婴幼儿危害会更大。因此，及时地、准确地对奶牛乳房炎疾病做出诊断极为重要。临床型奶牛乳房炎主要通过临床症状来进行诊断，隐性乳房炎则主要通过辅助诊断方法进行监测。乳房炎的发病率非常高，尤其隐性乳房炎，养牛场要随时监测，及时作出诊断，以便整群预防。根据奶牛患乳房炎有乳汁中细胞增多的特征而建立了直接检测法和间接检测法。直接检测法主要有体细胞直接计数法、电子计数法、荧光电子细胞计数法等，在国内目前最常采用的为体细胞直接计数法。病理学研究证实，乳房感染发炎后，大量白细胞进入乳腺，部分上皮细胞脱落，使乳汁中体细胞数显著升高。根据这一原理，计算每毫升乳汁中的体细胞数，此法检测结果最为准确，这是诊断隐性乳房炎的基准，也是其他诊断方法作对照的标准。间接法是目前临床上最常用的方法，其分为化学检测法和物理检测法，其中目前在临床上以化学检测法最为常用。化学检测法是间接测定乳汁细胞数和乳汁pH值的方法。房炎发生时，乳汁的pH值上升，通过测定乳汁pH值便可以达到判定的目的。但这些检测方法均需要专门的检测仪器，操作复杂，对操作人员要求高。因此，需要提供一种操作简单、快速准确的奶牛乳房炎检测方法。技术实现要素：有鉴于此，本发明提供了一种奶牛乳房炎检测试剂盒。该奶牛乳房炎检测试剂盒可快速准确检测奶牛乳房炎，不需要借助特殊仪器，肉眼就可以直接判断结果，技术人员很容易掌握，同时可以批量检测。为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：本发明提供了一种奶牛乳房炎检测试剂盒，包括：革兰氏阴性菌显色培养基、革兰氏阳性菌显色培养基和肠球菌金色葡萄球菌共显色培养基；革兰氏阴性菌显色培养基包括第一基础培养基和第一牛肉粉基；第一基础培养基为法国科玛嘉革兰氏阴性菌培养基；革兰氏阳性菌显色培养基包括第二基础培养基、第二牛肉粉和氯化钠；第二基础培养基为法国科玛嘉革兰氏阳性菌培养基；肠球菌金色葡萄球菌共显色培养基包括肠球菌基础培养基和金黄色葡萄球菌基础培养基。作为优选，革兰氏阴性菌显色培养基中，第一基础培养基的浓度为10～20g/L，第一牛肉粉的浓度为2～4g/L；革兰氏阳性菌显色培养基中，第二基础培养基的浓度为10～20g/L，第二牛肉粉的浓度为1～3g/L，氯化钠的浓度为1～2g/L。优选地，革兰氏阴性菌显色培养基中，第一基础培养基的浓度为15g/L，第一牛肉粉的浓度为3g/L；革兰氏阳性菌显色培养基中，第二基础培养基的浓度为15g/L，第二牛肉粉的浓度为2g/L，氯化钠的浓度为1.5g/L。作为优选，革兰氏阴性菌显色培养基的pH值为7.0±0.2。作为优选，革兰氏阳性菌显色培养基的pH值为6.9±0.2。作为优选，肠球菌金色葡萄球菌共显色培养基的pH值为7.0±0.2。在本发明提供的实施例中，以重量份计，第一基础培养基中：琼脂15份，蛋白胨7份，酵母粉10份，色素1.2份。在本发明提供的实施例中，以重量份计，第二基础培养基中：琼脂15份，蛋白胨8份，酵母粉12份，盐类5份，色素4.4份，增补剂2.0份。在本发明提供的实施例中，以重量份计，肠球菌基础培养基包括：营养物质40.1份，吐温801份，显色剂0.25份，琼脂15份。该培养基购买于青岛海博生物肠球菌显色培养基。在本发明提供的实施例中，以重量份计，金黄色葡萄球菌基础培养基包括：营养物质25份，吐温801份，显色物质40.3份，琼脂15份，抑菌成分6份。该培养基购买于青岛海博生物肠球菌显色培养基。作为优选，肠球菌基础培养基与金黄色葡萄球菌基础培养基的质量比为(10～15)：(1～5)。优选地，肠球菌基础培养基与金黄色葡萄球菌基础培养基的质量比为(11～12)：(4～5)。作为优选，奶牛乳房炎检测试剂盒还包括三分格培养皿。本发明提供了一种奶牛乳房炎检测试剂盒。该奶牛乳房炎检测试剂盒包括：革兰氏阴性菌显色培养基、革兰氏阳性菌显色培养基和肠球菌金色葡萄球菌共显色培养基；革兰氏阴性菌显色培养基包括第一基础培养基和第一牛肉粉基；革兰氏阳性菌显色培养基包括第二基础培养基、第二牛肉粉和氯化钠；肠球菌金色葡萄球菌共显色培养基包括肠球菌基础培养基和金黄色葡萄球菌基础培养基。本发明具有如下有益效果：1、本发明提供的奶牛乳房炎检测试剂盒可快速准确检测隐性型奶牛乳房炎，不需要借助特殊仪器，肉眼就可以直接判断结果，技术人员很容易掌握，操作简便，18h～24h内可出结果，同时可以批量检测，成本低；2、本发明提供的奶牛乳房炎检测试剂盒中，革兰氏阴性菌显色培养基和革兰氏阳性菌显色培养基经过改良后，可显著促进细菌的生长，可缩短检测时间；3、肠球菌金色葡萄球菌共显色培养基中，肠球菌基础培养基与金黄色葡萄球菌基础培养基按特定比例组合后，可同时检测肠球菌和金黄色葡萄球菌。附图说明图1示本发明制备的包括乳腺炎革兰氏阴性菌显色培养基、乳腺炎革兰氏阳性菌显色培养基和肠球菌金黄色葡萄球共显色培养基的三分格培养皿；图2示采用本发明培养基对奶牛乳房炎的病菌检测结果；图3示采用本发明培养基检测飞鹤乳液牧场采集的乳液的检测结果；图4示本发明革兰氏阴性菌显色培养基与改良前的检测效果的比较；图5示本发明革兰氏阳性菌显色培养基与改良前的检测效果的比较；图6示本发明肠球菌和金色葡萄球菌共显色培养基的检测效果。具体实施方式本发明公开了一种奶牛乳房炎检测试剂盒，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本
发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。术语解释：1、奶牛乳房炎奶牛乳房在产乳过程中受到机械性刺激、病原微生物浸入及化学物理性损伤所引起的乳房病理变化，分为浆液性乳房炎、纤维素性卡他乳房炎、化脓性乳房炎、出血性乳房炎、坏疽性乳房炎和隐性乳房炎。2、病原体感染由寄生虫或微生物引起的感染，目前为止，人们已从奶牛乳腺组织中分离出了150种病原微生物，最常见的有23种，其中细菌14种，支原体2种，真菌和病毒7种。其中发病率最高的是金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、链球菌，近年来支原体、真菌引起的乳房炎发病率逐年上升。3、微生物培养基供微生物生长繁殖的营养基质。分为液体培养基和固体培养基。一般，在液体培养基加入琼脂来制得琼脂固体培养基。培养基有不同的配方一般都含有碳源、氮源和无机盐。本发明提供的奶牛乳房炎检测试剂盒中所用培养基原料均可由市场购得。下面结合实施例，进一步阐述本发明：实施例11.乳腺炎革兰氏阴性菌显色培养基配制本发明改良后的革兰氏阴性菌显色培养基配方为：15g/L基础培养基+3g/L牛肉粉。其中，基础培养基：琼脂15.0g/L，蛋白胨7g/L，酵母粉10g/L，色素1.2g/L，pH值7.0±0.2，购买于法国科玛嘉革兰氏阴性菌培养基。制备方法如下：(1)按上述配方称取基础培养基和牛肉粉，溶于1000mL去离子水的洁净三角瓶中。也可根据需要按照比例扩大或缩小制备培养基的量。(2)加热至100℃，不停搅拌，使其完全溶解。切勿加热超过100℃。若使用微波炉加热，应将培养基加热沸腾，立即移出，轻轻摇匀，再放入微波炉加热，观察小气泡变为大气泡，直至完全溶解即可。切勿使培养基溢出。(3)将溶解好的培养基冷却至45℃～50℃，轻轻混匀，倾注平皿，使其凝固，晾干备用。2.乳腺炎革兰氏阳性菌显色培养基配制本发明改良后的革兰氏阳性菌显色培养基配方为：15g/L基础培养基+2g/L牛肉粉+1.5g/L氯化钠。其中，基础培养基：琼脂15.0g/L，蛋白胨8g/L和酵母粉12g/L，盐类5.0g/L，色素4.4g/L；增补剂：2.0g/L；pH值6.9±0.2，购买于法国科玛嘉革兰氏阳性菌培养基。制备方法如下：(1)按上述配方称取基础培养基、牛肉粉和氯化钠，溶于1000mL去离子水的洁净三角瓶中，充分搅拌混匀。也可根据需要按照比例扩大或缩小制备培养基的量。(2)加热至100℃，不停搅拌，使其完全溶解。切勿加热超过100℃。若使用微波炉加热，应将培养基加热沸腾，立即移出，轻轻摇匀，再放入微波炉加热，观察小气泡变为大气泡，直至完全溶解即可。切勿使培养基溢出。(3)将溶解好的培养基冷却至45℃～50℃，轻轻混匀，倾注平皿，使其凝固，晾干备用。3.肠球菌和金色葡萄球菌共显色培养基配制(1)肠球菌基础培养基：营养物质40.1g/L；吐温801.0g/L；显色剂0.25g/L；琼脂15.0g/L；pH值7.0±0.2，购买于青岛海博生物肠球菌显色培养基。(2)金黄色葡萄球菌基础培养基：营养物质25g/L；吐温801.0g/L；显色物质40.3g/L；琼脂15.0g/L；抑菌成分6.0g/L；pH值7.0±0.2，购买于青岛海博生物肠球菌显色培养基。(3)肠球菌和金色葡萄球菌共显色培养基配制：250mL培养基：肠球菌培养基11.28g+4.315金黄色葡萄培养基。(2)称取培养基，水浴加热溶解于250mL蒸馏水，冷至45-50℃时，倾入无菌平皿，备用。4.制备奶牛乳房炎检测培养皿将乳腺炎革兰氏阴性菌显色培养基、乳腺炎革兰氏阳性菌显色培养基和肠球菌金黄色葡萄球共显色培养基分别倒在90mm的三分格培养皿中，并且标记(图1)。将制备好的检测皿用封口膜封好，避光低温保存(4-8℃)。5.奶牛乳房炎检测步骤(1)用无菌采乳杯子采集乳液；(2)用无菌棉花棒将乳液均匀涂在培养皿中的培养基上；(3)倒扣培养皿，37℃培养24小时；(4)菌种判断(参照表1)。表1不同区菌种判断颜色1区菌种颜色大肠杆菌红色克雷伯氏菌深蓝色变形杆菌棕色晕环假单胞菌奶油状，半透明白色念珠菌白色，不透明，小菌落2区菌种颜色无乳链球菌蓝绿色乳房链球菌深蓝色金黄色葡萄球菌淡紫色带有淡紫色晕环3区菌种颜色肠球菌红色至紫色菌落金黄色葡萄球菌淡蓝色至蓝色(5)图2为检测结果。通过本方法检测到6种引起奶牛乳房炎的病菌。分别是大肠杆菌(红色)、克雷伯氏菌(深蓝)、变形杆菌(棕色晕环)、无乳链球菌(蓝绿)、乳房链球菌(深蓝)、肠球菌(紫色)。(6)本方法与体细胞计数仪比较从飞鹤乳液牧场采集乳液进行检测。试验结果如下：体细胞检测仪显示奶液中细胞数量为60万个/mL，奶牛有乳房炎感染。本方法检测，经过乳液涂板，培养，检测到细菌4种(图3)。克雷伯氏菌(深蓝)、无乳链球菌(蓝绿)、乳房链球菌(深蓝)、肠球菌(紫色)。通过比较发现，本方法能简便、快捷的检测出奶牛乳房炎引起的致病菌类型，为精确治疗乳房炎奠定了基础。(7)本方法革兰氏阴性菌显色培养基与改良前比较将采集新鲜牛奶均匀涂在两种培养板上，倒置于37℃培养箱中，培养24小时。一种培养板采用改良前的基础培养基(琼脂15.0g/L，蛋白胨和酵母粉17.0g/L，色素1.2g/L，pH值7.0±0.2)，另一种培养板采用本发明改良后的革兰氏阴性菌培养基。试验结果见图4、表2。通过上述试验结果可以看出，革兰氏阴性菌区域改良后，红色大肠杆菌生长明显。表2改良前后革兰氏阴性菌显色培养基的比较(8)本方法革兰氏阳性菌显色培养基与改良前比较将采集新鲜牛奶均匀涂在两种培养板上，倒置于37℃培养箱中，培养24小时。一种培养板采用改良前的基础培养基(琼脂15.0g/L，蛋白胨和酵母粉20.0g/L，盐类5.0g/L，色素4.4g/L；增补剂：2.0g/L；pH值6.9±0.2)，另一种培养板采用本发明改良后的革兰氏阳性菌培养基。试验结果见图5、表3。通过上述试验结果可以看出，革兰氏阳性菌区域改良后，淡紫色金色葡萄球菌生长明显。表3改良前后革兰氏阳性菌显色培养基的比较(9)肠球菌和金色葡萄球菌共显色培养基的检测效果将采集新鲜牛奶均匀涂在培养板(本发明肠球菌和金色葡萄球菌共显色培养基)上，倒置于37℃培养箱中，培养24小时。试验结果如图6。由图6可以看出，本发明肠球菌和金色葡萄球菌共显色培养基可同时检测肠球菌和金黄色葡萄球菌，其中，淡紫色菌落为肠球菌，淡蓝色或蓝色菌落为金黄色葡萄球菌。注意事项：保证涂板使用棉花棒为无菌。请在光线明亮地方判断菌落颜色。请将产品低温(4℃)避光保存。实施例21.乳腺炎革兰氏阴性菌显色培养基配制本发明改良后的革兰氏阴性菌显色培养基配方为：10g/L基础培养基+4g/L牛肉粉。其中，基础培养基与实施例1革兰氏阴性菌显色培养基中的基础培养基相同。制备方法同实施例1。2.乳腺炎革兰氏阳性菌显色培养基配制本发明改良后的革兰氏阳性菌显色培养基配方为：10g/L基础培养基+3g/L牛肉粉+1g/L氯化钠。其中，基础培养基与实施例1革兰氏阳性菌显色培养基中的基础培养基相同。制备方法同实施例1。3.肠球菌和金色葡萄球菌共显色培养基配制配方与制备方法同实施例1。4.制备奶牛乳房炎检测培养皿将乳腺炎革兰氏阴性菌显色培养基、乳腺炎革兰氏阳性菌显色培养基和肠球菌金黄色葡萄球共显色培养基分别倒在90mm的三分格培养皿中，并且标记。将制备好的检测皿用封口膜封好，避光低温保存(4-8℃)。5.奶牛乳房炎检测步骤(1)用无菌采乳杯子采集乳液；(2)用无菌棉花棒将乳液均匀涂在培养皿中的培养基上；(3)倒扣培养皿，37℃培养24小时；(4)菌种判断(参照表1)。(5)试验结果见表4、5。表4本发明革兰氏阴性菌显色培养基检测结果表5本发明革兰氏阳性菌显色培养基检测结果试验结果显示，本实施例革兰氏阴性菌显色培养基上红色大肠杆菌生长明显，本实施例革兰氏阳性菌显色培养基上淡紫色金色葡萄球菌生长明显。实施例31.乳腺炎革兰氏阴性菌显色培养基配制本发明改良后的革兰氏阴性菌显色培养基配方为：20g/L基础培养基+2g/L牛肉粉。其中，基础培养基与实施例1革兰氏阴性菌显色培养基中的基础培养基相同。制备方法同实施例1。2.乳腺炎革兰氏阳性菌显色培养基配制本发明改良后的革兰氏阳性菌显色培养基配方为：20g/L基础培养基+1g/L牛肉粉+2g/L氯化钠。其中，基础培养基与实施例1革兰氏阳性菌显色培养基中的基础培养基相同。制备方法同实施例1。3.肠球菌和金色葡萄球菌共显色培养基配制配方与制备方法同实施例1。4.制备奶牛乳房炎检测培养皿将乳腺炎革兰氏阴性菌显色培养基、乳腺炎革兰氏阳性菌显色培养基和肠球菌金黄色葡萄球共显色培养基分别倒在90mm的三分格培养皿中，并且标记。将制备好的检测皿用封口膜封好，避光低温保存(4-8℃)。5.奶牛乳房炎检测步骤(1)用无菌采乳杯子采集乳液；(2)用无菌棉花棒将乳液均匀涂在培养皿中的培养基上；(3)倒扣培养皿，37℃培养24小时；(4)菌种判断(参照表1)。(5)试验结果见表6、7。表6本发明革兰氏阴性菌显色培养基检测结果表7本发明革兰氏阳性菌显色培养基检测结果试验结果显示，本实施例革兰氏阴性菌显色培养基上红色大肠杆菌生长明显，本实施例革兰氏阳性菌显色培养基上淡紫色金色葡萄球菌生长明显。以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本
技术领域：
的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。当前第1页1 2 3