一种比较断奶仔猪肠道免疫发育能力的引物对和方法与流程

技术特征：

1.一种比较断奶仔猪肠道免疫发育能力的标记引物，其特征在于：该引物对包括FUT1、LYZ、TAP1、SLA-DQB、TLR4；其中，

引物对FUT1，正向引物序列如SEQ ID NO.1所示，反向引物序列如SEQ ID NO.2所示；

引物对LYZ，正向引物序列如SEQ ID NO.3所示，反向引物序列如SEQ ID NO.4所示；

引物对TAP1，正向引物序列如SEQ ID NO.5所示，反向引物序列如SEQ ID NO.6所示；

引物对SLA-DQB，正向引物序列如SEQ ID NO.7所示，反向引物序列如SEQ ID NO.8所示；

引物对TLR4，正向引物序列如SEQ ID NO.9所示，反向引物序列如SEQ ID NO.10所示。

2.一种比较断奶仔猪免疫生化指标差异的方法，其特征在于：所述免疫生化指标为血清T-AOC含量及肠黏膜SIgA含量；该方法以与血清T-AOC含量及肠黏膜SIgA含量呈高度负相关的候选基因FUT1和TLR4的表达水平，与血清T-AOC含量及肠黏膜SIgA含量呈高度正相关的候选基因LYZ、SLA-DQB、TAP1的表达水平比较不同断奶仔猪个体免疫生化指标血清T-AOC含量及肠黏膜SIgA含量差异。

3.一种比较断奶仔猪肠道免疫发育能力的方法，其特征在于：该方法以与断奶仔猪肠道免疫发育相关联的免疫生化指标血清T-AOC含量及肠黏膜SIgA含量为对象，通过分析与T-AOC、SIgA呈负相关的候选基因FUT1和TLR4的表达水平，呈正相关的候选基因LYZ、SLA-DQB、TAP1的表达水平，判断断奶仔猪肠道免疫发育状况，标记基因FUT1和TLR4表达水平低、LYZ、SLA-DQB、TAP1表达水平高的断奶仔猪肠道免疫发育更良好。

4.权利要求3所述的比较断奶仔猪肠道免疫发育能力的方法，其特征在于：该方法具体包括如下步骤：(1)断奶仔猪小肠各段包括十二指肠、空肠、回肠总RNA提取；(2)引物设计：分别设计候选基因FUT1的反转录引物对FUT1、候选基因TLR4的反转录引物对TLR4、候选基因LYZ的反转录引物对LYZ、候选基因SLA-DQB的反转录引物对SLA-DQB、候选基因TAP1的反转录引物对TAP1；(3)反转录合成cDNA：使用反转录试剂盒对步骤(1)得到的总RNA合成cDNA；(4)采用步骤(2)设计的引物通过q-RT-PCR方法测定候选基因FUT1、TLR4、LYZ、SLA-DQB、TAP1在断奶仔猪个体小肠各段中的表达量；(5)根据各候选基因在不同断奶仔猪个体小肠各段的表达量的差异确定不同断奶仔猪肠道发育状况；

其中，引物对FUT1，正向引物序列如SEQ ID NO.1所示，反向引物序列如SEQ ID NO.2所示；

引物对LYZ，正向引物序列如SEQ ID NO.3所示，反向引物序列如SEQ ID NO.4所示；

引物对TAP1，正向引物序列如SEQ ID NO.5所示，反向引物序列如SEQ ID NO.6所示；

引物对SLA-DQB，正向引物序列如SEQ ID NO.7所示，反向引物序列如SEQ ID NO.8所示；

引物对TLR4，正向引物序列如SEQ ID NO.9所示，反向引物序列如SEQ ID NO.10所示。

5.权利要求4所述的比较断奶仔猪肠道免疫发育能力的方法，其特征在于，步骤(4)所述q-RT-PCR方法具体包括如下步骤：

(1)标准品制备及条件优化：每个待测RNA的反转录产物取等量混合，将cDNA混合样按梯度稀释，用RT-PCR的反应体系，对每个目的基因作标准曲线来优化整个反应条件；

(2)q-RT-PCR标准曲线的建立和扩增曲线：采用RT-PCR方法作目的基因FUTl、LYZ、TAP1、SLA-DQB、TLR4的标准曲线，得到各个目的基因及β-Actin基因的标准曲线，对结果相关数据进行分析，当标准曲线的相关系数及扩增效率均等于或接近于1.000时，表明实验数据误差较小，可信度较高，实验所得的Ct值可准确地测定起始cDNA的拷贝数；目的基因和看家基因标准曲线的斜率小于0.1，表明两个基因的标准曲线的斜率基本一致，在后续实验中可以使用分析Comparative Delta-delta Ct法进行相对定量分析；

(3)相关候选基因的q-RT-PCR反应：采用q-RT-PCR法检测猪FUT1、LYZ、TAP1、SLA-DQB、TLR4基因及内参基因β-Actin在断奶仔猪小肠各段的表达量；

(4)数据分析：目的基因mRNA表达丰度采用2^-ΔΔCT法对有效数据进行统计分析，计算出每个样本目的基因的相对表达水平，通过内参基因β-Actin校正；

其中，内参基因β-Actin的扩增引物对β-antin上游序列如SEQ ID NO.11所示，下游引物序列如SEQ ID NO.12所示。

6.权利要求5所述的比较断奶仔猪肠道免疫发育能力的方法，其特征在于，步骤(4)q-RT-PCR反应体系为20μL，包括：SYBR绿色荧光染料10μL，上游引物1μL，下游引物1μL，cDNA1μL，超纯水7μL；反应条件为：95℃预变性30s；95℃变性10s，退火温度下退火30s，40个循环，于65℃5s至95℃5s时搜集荧光值。

7.权利要求4所述的比较断奶仔猪肠道免疫发育能力的方法，其特征在于，步骤(3)反转录合成cDNA具体包括如下步骤：(1)基因组DNA除去反应：体系包括：5×gDNA Eraser缓冲液2.0μL，gDNA Eraser1.0μL，总RNA1μg，加超纯水至10μL；反应条件为：42℃反应2min，4℃保存，得反应液I；(2)反转录反应：体系包括：反应液I 10μL，5×Buffer 2 4.0μL；RT酶混合液I 1.0μL，RT Primer Mix 1.0μL；加超纯水至20μL；反应条件为：程序37℃反应15min，85℃反应5sec，4℃保存。得反转录样品cDNA，检测后置于-20℃条件下备用。

8.权利要求3-7任一项所述的比较断奶仔猪肠道免疫发育能力的方法，其特征在于：所述断奶仔猪品种为安徽地方品种安庆六白猪。

9.权利要求3-7任一项所述方法在断奶仔猪抗应激生理反应能力比较中的应用，其特征在于：该方法比较FUT1、LYZ、TAP1、SLA-DQB、TLR4的表达水平，FUT1、LYZ基因表达水平越低，TAPl、SLA-DQB、TLR4表达水平越高说明血清T-AOC及肠黏膜SIgA含量越高，小猪断奶抗应激能力越强。

10.权利要求9所述方法在断奶仔猪抗应激生理反应能力比较中的应用，其特征在于：所述断奶仔猪品种为安徽地方品种安庆六白猪。