本发明属于食品健康领域，特别涉及一种对食品中大豆过敏原P34蛋白基因进行定量的检测方法。
背景技术：
大豆是一种常见的食品过敏原，被称为八大类食品过敏原之一，美国、欧盟等都要求在食品标签中强制性标识。大豆具有较高的营养价值，可作为食品原料广泛用于各类食品的制作大豆蛋白、大豆卵磷脂等，也常作为重要的食品添加剂(乳化剂、稳定剂、发泡剂、凝固剂等)广泛应用于食品工业，如婴儿配方食品、肉类产品、面包点心、乳制品和各种可食用产品。大豆作为配料中的组成成分，可能在标签标识中不能体现，但它是一种潜在的过敏原，其危害性不容忽视。为确保消费者尤其是食品过敏人群的健康安全，近年来一些国家和国际组织相继出台了食品过敏原标识的法律法规，如食品法典委员会《预包装食品标识法典通用准则》，美国《食品过敏原标签及消费者保护法》、欧盟2003/89/EC指令、2006/142/EC指令等对食品标签过敏原标识都作了严格规定。美国、欧盟、加拿大、澳大利亚、新西兰等国家要求在食品标签中强制性标识大豆、花生、奶、蛋等过敏原。大豆P34蛋白是大豆的主要过敏蛋白，也被称为Gly m Bd 30k蛋白或30K，P34蛋白广泛存在于所有大豆品种中，有研究结果表明65％的大豆过敏症状都是由P34蛋白引起的。
基于以上的分析和目前迫切的需求，本领域技术人员致力于开发一种能够简单、快速、准确鉴定食品中大豆过敏原的技术。以便能够为保护消费者健康和知情权及食品标签过敏原标识提供技术保障，对保障出口企业国际贸易的顺利进行等。
技术实现要素：
有鉴于现有技术的上述缺陷，本发明所要解决的技术问题是提供一种对食品中大豆过敏原P34蛋白基因(NC_016095.2)进行定量的检测方法。
本发明的第一方面，提供了一种试剂盒，所述试剂盒用于对大豆过敏原P34蛋白基因进行鉴定，并且所述试剂盒中包括引物对：
上游引物：5’-ATATAGGAAGCGGTTGGGCG-3’(SEQ ID NO.1)；和
下游引物：5’-CTTTTCCCACCAAAATTGACCG-3’(SEQ ID NO.2)。
进一步地，所述试剂盒还包括DNA提取试剂。
进一步的，所述DNA提取试剂选自下组的一种或多种：
CTAB缓冲液，蛋白酶K，水饱和酚、三氯甲烷和异戊醇的混合溶液(体积比为25:24:1)，异丙醇，TE缓冲液，RNA酶溶液，三氯甲烷和异戊醇混合溶液(体积比为24:1)，70％(v/v)乙醇。
进一步地，所述试剂盒还包括用于实时荧光定量PCR的试剂。
进一步地，所述用于实时荧光定量PCR的试剂包括：
探针：5’-(FAM)ACATGGTGGGATTGCCACTGATG-Eclipse-3’(SEQ ID NO.3)。
进一步地，所述试剂盒还包括用于扩增18S rRNA基因的引物，优选地，所述引物序列如下：
上游引物：:5’-TCTGCC CTATCA ACTTTCGATGGTA-3’(SEQ ID NO.4)
下游引物：5’-AATTTGCGCGCCTGCTGCCTTCCTT-3’(SEQ ID NO.5)。
本发明的第二方面，提供了一种对食品中大豆过敏原P34蛋白基因进行定量的方法，所述方法包括步骤：
1)DNA提取
提供待测样品，并自所述待测样品中提取DNA，作为后续PCR扩增的模板；
2)实时荧光定量PCR
使用如下引物对，对步骤1)获得的DNA进行实时荧光定量PCR：
上游引物：5’-ATATAGGAAGCGGTTGGGCG-3’(SEQ ID NO.1)；和
下游引物：5’-CTTTTCCCACCAAAATTGACCG-3’(SEQ ID NO.2)。
进一步地，所述步骤2)中，实时荧光定量PCR中使用的探针序列为：
5’-(FAM)ACATGGTGGGATTGCCACTGATG-Eclipse-3’(SEQ ID NO.3)。
进一步地，所述步骤1)包括步骤：
将大豆样品研磨成粉状，称取100mg制备好的样品于2mL离心管中，加入600L CTAB缓冲液和10L蛋白酶K，振荡混匀，65℃30min，期间每隔10min振荡混匀；加入500L水饱和酚、三氯甲烷和异戊醇的混合液，体积比为25:24:1；剧烈振荡，12 000g离心15min；吸取上清液至一新离心管中，加入等体积异丙醇，振荡均匀，12 000g离心10min；弃去上清液，用预热至65℃的TE缓冲液溶解DNA；加入5L RNA酶溶液，37℃，30min；加入200μL三氯甲烷:异戊醇(体积比24:1)，剧烈振荡，12 000g离心15min；吸取上清液至一新离心管中，加入等体积异丙醇，振荡均匀，12 000g离心10min；弃去上清液，70％乙醇洗涤一次，12 000g离心1min；弃上清液，晾干；加入50L TE缓冲液，溶解DNA沉淀。
进一步地，所述步骤2)中，PCR扩增体系包括：
实时荧光PCR混合液12.5μL，上游引物、下游引物(10M)各1L，探针(5M，5’-(FAM)ACATGGTGGGATTGCCACTGATG-Eclipse-3’(SEQ ID NO.3))0.5L，模板DNA 100ng，水补足至25L。
进一步地，所述步骤2)中，实时荧光PCR反应循环参数为:
50℃，2min；95℃，10min；95℃，15s，60℃，1min，40个循环。
进一步地，所述步骤2)中，还包括步骤：对18S rRNA基因进行PCR扩增。通过对18S rRNA基因进行监测，能够对上样量进行定量。
进一步地，所述步骤2)中，对18S rRNA基因进行PCR扩增的PCR反应体系为:PCR预混合液12.5L，引物(5M，上游引物为5’-TCTGCC CTATCA ACTTTCGAT GGTA-3’(SEQ ID NO.4)；下游引物为5’-AATTTGCGCGCCTGCTGCCTTCCT T-3’(SEQ ID NO.5))各0.5L，模板100ng，反应体积为25L。
进一步地，所述步骤2)中，对18S rRNA基因进行PCR扩增的扩增条件为94℃，3min；94℃，20s，54℃，40s，72℃，40s，40个循环；72℃，5min。
进一步地，所述方法还包括步骤：DNA浓度测定及配制
用核酸蛋白浓度分析仪测定步骤1)获得的样品DNA的浓度，用ddH2O将抽提的DNA溶液(100ng/L)稀释成10ng/L。对DNA浓度测定及配制用来制作标准曲线，用于Ct值与大豆过敏原含量的换算。
进一步地，所述方法还包括步骤，3)结果鉴定：
观察步骤2)荧光定量PCR的扩增曲线、Ct值及电泳结果，如CT值在18.26-28.71区间，则认定结果为阳性，样品含有食品过敏原P34；如无目标片段，则认定结果为阴性，样品不含有大豆过敏原。
本发明的有益效果在于：本发明设计的引物对只是针对大豆物种的P34基因序列进行特异性扩增，其他物种不能扩增出来，采用普通PCR即可进行大豆过敏原的鉴定，不需要进行酶切和测序。配合本发明的探针，可以进行荧光定量PCR检测，不仅检测的稳定性好，而且检测灵敏度极高。本发明操作方便，检测时间短，具有很好的应用前景，满足于市场监督检测。
以下将结合附图对本发明的构思、具体结构及产生的技术效果作进一步说明，以充分地了解本发明的目的、特征和效果。
附图说明
图1是根据获得是实时荧光定量PCR检测获得的CT值与过敏原大豆成分比例换算曲线。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。
本发明中针对大豆过敏原P34蛋白基因，设计了数十对的引物和探针进行测试，其中有些引物对虽然特异性较好，但是扩增不稳定，结果准确率较低，容易造成假阴性的结果；有些引物对稳定性较好，但是灵敏度较低。经过大量测试，最终获得了特异性好，扩增稳定，灵敏度高的扩增引物对：上游引物5’-ATATAGGAAGCGGTTGGGCG-3’(SEQ ID NO.1)和下游引物5’-CTTTTCCCACCAAAATTGACCG-3’(SEQ ID NO.2)，配合探针序列5’-(FAM)ACATGGTGGGATTGCCACTGATG-Eclipse-3’(SEQ ID NO.3)，对大豆制品样品进行检测，检测灵敏度可以达到0.001％(w/w)。
实施例1
为了便于直观理解本发明的技术方案，在上海市各区菜场采集小麦和大豆样品2份，按照上述方法进行检测。
步骤一：DNA提取
用冷冻研磨机将大豆样品研磨成粉状。称取100mg已制备好的样品于2mL离心管中，加入600L CTAB缓冲液和10L蛋白酶K，振荡混匀，65℃30min，期间每隔10min振荡混匀；加入500L水饱和酚、三氯甲烷和异戊醇的混合液，体积比为25:24:1；剧烈振荡，12 000g离心15min；吸取上清液至一新离心管中，加入等体积异丙醇，振荡均匀，12 000g离心10min；弃去上清液，用预热至65℃的TE缓冲液溶解DNA；加入5L RNA酶溶液，37℃，30min；加入200μL三氯甲烷:异戊醇(24:1)，剧烈振荡，12 000g离心15min；吸取上清液至一新离心管中，加入等体积异丙醇，振荡均匀，12 000g离心10min；弃去上清液，70％乙醇洗涤一次，12 000g离心1min；弃上清液，晾干；加入50L TE缓冲液，溶解DNA沉淀。
步骤二：DNA浓度测定及配制
用德国Eppendorf Biophotometer型核酸蛋白浓度分析仪测定抽提样品DNA的浓度。用ddH2O将抽提的大豆DNA溶液(100ng/L)稀释成10，1，0.1，0.01，0.001，0.0001和0.00001ng/L混合液。
步骤三：实时荧光定量PCR
反应体系为:实时荧光PCR混合液12.5μL，正、反向引物(10M)各1L，探针(5M，5’-(FAM)ACATGGTGGGATTGCCACTGATG-Eclipse-3’(SEQ ID NO.3))0.5 L，模板DNA 100ng，水补足至25L。实时荧光PCR反应循环参数:50℃，2min；95℃，10min；95℃，15s，60℃，1min，40个循环。
18S rRNA基因引物PCR反应体系:PCR预混合液12.5L，引物(5M，上游引物为5’-TCTGCC CTATCA ACTTTCGAT GGTA-3’(SEQ ID NO.4)；下游引物为5’-AATTTGCGCGCCTGCTGCCTTCCT T-3’(SEQ ID NO.5))各0.5L，模板100ng，反应体积为25L。
扩增条件为:94℃，3min；94℃，20s，54℃，40s，72℃，40s，40个循环；72℃，5min。
步骤四、结果鉴定
观察Ct值电泳结果，使用过敏原大豆成分引物对10，1，0.1，0.01，0.001和0.0001％大豆粉含量(W/W)的样品DNA进行检测。10，1，0.1，0.01，0.001％大豆粉在3次检测中均出现扩增曲线，而0.0001％大豆粉在3次检测中均未出现扩增曲线，根据稀释比例和获得的Ct值进行统计，获得换算曲线(图1)。实验表明，在重量百分比水平上，该方法的检测灵敏度为0.001％大豆粉(w/w)。
实施例2
为了便于直观理解本发明的技术方案，在市场上采购10个国内市场流通的市售食品进行检测，按照上述方法进行检测。
步骤一：DNA提取
用冷冻研磨机将样品研磨成粉状。称取100mg已制备好的样品于2mL离心管中，加入600L CTAB缓冲液和10L蛋白酶K，振荡混匀，65℃30min，期间每隔10min振荡混匀；加入500L水饱和酚、三氯甲烷和异戊醇的混合液，体积比为25:24:1；剧烈振荡，12 000g离心15min；吸取上清液至一新离心管中，加入等体积异丙醇，振荡均匀，12 000g离心10min；弃去上清液，用预热至65℃的TE缓冲液溶解DNA；加入5L RNA酶溶液，37℃，30min；加入200μL三氯甲烷:异戊醇(24:1)，剧烈振荡，12 000g离心15min；吸取上清液至一新离心管中，加入等体积异丙醇，振荡均匀，12 000g离心10min；弃去上清液，70％乙醇洗涤一次，12 000g离心1min；弃上清液，晾干；加入50L TE缓冲液，溶解DNA沉淀。
步骤二：DNA浓度测定及配制
用德国Eppendorf Biophotometer型核酸蛋白浓度分析仪测定抽提样品DNA的浓度。用ddH2O将抽提的DNA溶液(100ng/L)稀释成10，1，0.1，0.01，0.001，0.0001和0.00001ng/L混合液。
步骤三、实时荧光定量PCR
反应体系为:实时荧光PCR混合液12.5μL，正反向引物(10M)各1L，探针(5M)0.5L，模板DNA 100ng，水补足至25L。实时荧光PCR反应循环参数:50℃，2min；95℃，10min；95℃，15s，60℃，1min，40个循环。
18S rRNA基因引物PCR反应体系:PCR预混合液12.5L，引物(5M)各0.5L，模板100ng，反应体积为25L。扩增条件为:94℃，3min；94℃，20s，54℃，40s，72℃，40s，40个循环；72℃，5min。
步骤四、结果鉴定
在10个市售食品中，有2个样品检测结果与食品标签不符；在1个未标识大豆成分的饼干中检出大豆过敏原成分；在1份标识大豆成分的香肠中未检出大豆过敏原成分(表1)。
表1.10份市场来源食品大豆过敏原成分检测结果。
以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术人员无需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。
序列表
<110> 河南省产品质量监督检验院
<120> 一种对食品中大豆过敏原P34蛋白基因进行定量的检测方法
<130> 0002
<160> 5
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
atataggaag cggttgggcg 20
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
cttttcccac caaaattgac cg 22
<210> 3
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
acatggtggg attgccactg atg 23
<210> 4
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
tctgccctat caactttcga tggta 25
<210> 5
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
aatttgcgcg cctgctgcct tcctt 25