一种比较断奶仔猪肠道免疫发育能力的引物对和方法与流程

本发明属于分子生物技术领域，涉及一种比较断奶仔猪肠道免疫发育能力的引物对和方法。

背景技术：

仔猪断奶后，短时间内免疫力下降，由于肠道结构和功能受损，容易引起疾病的发生。腹泻和水肿病是仔猪断奶后最常见的急性、致死性传染病。4～12周龄仔猪因此病原菌感染的发病率为30％～40％，发病仔猪死亡率为40％，有时甚至高达90％，这给养猪业中造成了巨大的经济损失。目前研究发现，腹泻和水肿病是由肠毒素型大肠杆菌(ETEC)的特定抗原F18黏附在猪的小肠黏膜上皮细胞刷状缘并在上面产生肠毒素引起的一种传染病。大肠杆菌进入猪肠道以后，依靠其菌毛在敏感猪肠上皮细胞刷状缘黏附，产生类肠毒素，通过渗透、引起组织胺的释放，导致血管壁损伤，水分大量渗出而引起水肿和腹泻病，是大肠杆菌F抗原致病的原因之一。目前有研究显示，西方猪种在抗ETECF18大肠杆菌病的育种工作比中国地方猪种更有优势，中国地方猪种不具备抵抗ETECF 18大肠杆菌的某个SNP标记位点。但是，在养猪生产实践中，中国地方品种猪抗腹泻和水肿病能力的确普遍比西方猪种和含外血的杂种猪强，说明中国地方品种猪在抵抗ETECF18大肠杆菌病的遗传基础上与西方猪种确实存在差异。

技术实现要素：

本发明的目的在于以安徽地方优良品种安庆六白猪和国外引进品种长白猪为研究对象，研究两个猪种在断奶应激期免疫生化指标血清T-AOC含量及肠黏膜SIgA含量变化。探讨品种间抗逆性和抗病力的差异，旨在找出安徽地方优良品种候选基因与肠道免疫的内在联系，筛选影响仔猪抗断奶应激能力及肠道粘膜免疫发育的相关候选基因，为今后品种选育和新品系的建立提供参考。

1.本发明提供一种比较断奶仔猪肠道免疫发育能力的标记引物，该引物对包括FUT1、LYZ、TAP1、SLA-DQB、TLR4；其中，

引物对FUT1，正向引物序列如SEQ ID NO.1所示，反向引物序列如SEQ ID NO.2所示；

引物对LYZ，正向引物序列如SEQ ID NO.3所示，反向引物序列如SEQ ID NO.4所示；

引物对TAP1，正向引物序列如SEQ ID NO.5所示，反向引物序列如SEQ ID NO.6所示；

引物对SLA-DQB，正向引物序列如SEQ ID NO.7所示，反向引物序列如SEQ ID NO.8所示；

引物对TLR4，正向引物序列如SEQ ID NO.9所示，反向引物序列如SEQ ID NO.10所示。

2.本发明还一种比较断奶仔猪免疫生化指标差异的方法，所述免疫生化指标为血清T-AOC含量及肠黏膜SIgA含量；该方法以与血清T-AOC含量及肠黏膜SIgA含量呈高度负相关的候选基因FUTl和TLR4的表达水平，与血清T-AOC含量及肠黏膜SIgA含量呈高度正相关的候选基因LYZ、SLA-DQB、TAPl的表达水平比较不同断奶仔猪个体免疫生化指标血清T-AOC含量及肠黏膜SIgA含量差异。

3.本发明还提供一种比较断奶仔猪肠道免疫发育能力的方法，该方法以与断奶仔猪肠道免疫发育相关联的免疫生化指标血清T-AOC含量及肠黏膜SIgA含量为对象，通过分析与T-AOC、SIgA呈负相关的候选基因FUT1和TLR4的表达水平，呈正相关的候选基因LYZ、SLA-DQB、TAP1的表达水平，判断断奶仔猪肠道免疫发育状况，标记基因FUT1和TLR4表达水平低、LYZ、SLA-DQB、TAPl表达水平高的断奶仔猪肠道免疫发育更良好。

4.上述3提供的比较断奶仔猪肠道免疫发育能力的方法，其中，该方法具体包括如下步骤：(1)断奶仔猪肠道总RNA提取；(2)引物设计：分别设计候选基因FUT1的反转录引物对FUT1、候选基因TLR4的反转录引物对TLR4、候选基因LYZ的反转录引物对LYZ、候选基因SLA-DQB的反转录引物对SLA-DQB、候选基因TAP1的反转录引物对TAP1；(3)反转录合成cDNA：使用反转录试剂盒对步骤(1)得到的总RNA合成cDNA；(4)采用步骤(2)设计的引物通过q-RT-PCR方法测定候选基因FUT1、TLR4、LYZ、SLA-DQB、TAP1在断奶仔猪个体中的表达量；(5)根据各候选基因在不同断奶仔猪个体的表达量的差异确定不同断奶仔猪肠道发育状况；

其中，引物对FUT1，正向引物序列如SEQ ID NO.1所示，反向引物序列如SEQ ID NO.2所示；

引物对LYZ，正向引物序列如SEQ ID NO.3所示，反向引物序列如SEQ ID NO.4所示；

引物对TAP1，正向引物序列如SEQ ID NO.5所示，反向引物序列如SEQ ID NO.6所示；

引物对SLA-DQB，正向引物序列如SEQ ID NO.7所示，反向引物序列如SEQ ID NO.8所示；

引物对TLR4，正向引物序列如SEQ ID NO.9所示，反向引物序列如SEQ ID NO.10所示。

5.上述4提供的比较断奶仔猪肠道免疫发育能力的方法，其中，步骤(4)所述q-RT-PCR方法具体包括如下步骤：

(1)标准品制备及条件优化：每个待测RNA的反转录产物取等量混合，将cDNA混合样按梯度稀释，用RT-PCR的反应体系，对每个目的基因作标准曲线来优化整个反应条件；

(2)q-RT-PCR标准曲线的建立和扩增曲线：采用RT-PCR方法作目的基因FUTl、LYZ、TAPl、SLA-DQB、TLR4的标准曲线，得到各个目的基因及β-Actin基因的标准曲线，对结果相关数据进行分析，当标准曲线的相关系数及扩增效率均等于或接近于1.000时，表明实验数据误差较小，可信度较高，实验所得的Ct值可准确地测定起始cDNA的拷贝数；目的基因和看家基因标准曲线的斜率小于0.1，表明两个基因的标准曲线的斜率基本一致，在后续实验中可以使用分析Comparative Delta-delta Ct法进行相对定量分析；

(3)相关候选基因的q-RT-PCR反应：采用RT-PCR法检测猪FUT1、LYZ、TAP1、SLA-DQB、TLR4基因及内参基因β-Actin在断奶仔猪小肠各段的表达量；

(4)数据分析：目的基因mRNA表达丰度采用2^-ΔΔCT法对有效数据进行统计分析，计算出每个样本目的基因的相对表达水平，通过内参基因β-Actin校正；

其中，内参基因β-Actin的扩增引物对β-antin上游序列如SEQ ID NO.11所示，下游引物序列如SEQ ID NO.12所示。

6.上述5提供的比较断奶仔猪肠道免疫发育能力的方法，其中，步骤(4)q-RT-PCR反应体系为20μL，包括：SYBR绿色荧光染料10μL，上游引物1μL，下游引物1μL，cDNA1μL，超纯水7μL；反应条件为：95℃30s；95℃变性10s，退火30s，40个循环，于65℃5s至95℃5s时搜集荧光值。

7.上述4提供的比较断奶仔猪肠道免疫发育能力的方法，其中，步骤(3)反转录合成cDNA具体包括如下步骤：(1)基因组DNA除去反应：体系包括：5×gDNA Eraser缓冲液2.0μL，gDNA Eraser1.0μL，总RNA1μg，加超纯水至10μL；反应条件为：42℃反应2min，4℃保存，得反应液I；(2)反转录反应：体系包括：反应液I 10μL，Buffer2 4.0μL；RT酶混合液I 1.0μL，RT Primer Mix 1.0μL；加超纯水至20μL；反应条件为：程序37℃反应15min，85℃反应5sec，4℃保存。得反转录样品cDNA，检测后置于-20℃条件下备用。

8.上述3-7任一项提供的比较断奶仔猪肠道免疫发育能力的方法，其中，所述断奶仔猪为安徽地方品种安庆六白猪

9.上述3-7任一项提供方法在断奶仔猪抗应激生理反应能力比较中的应用，其中：该方法比较FUT1、LYZ、TAP1、SLA-DQB、TLR4的表达水平，FUT1、LYZ基因表达水平越低，TAP1、SLA-DQB、TLR4表达水平越高说明T-AOC及肠黏膜SIgA含量越高，小猪断奶抗应激能力越强。

10.上述9所述的方法在断奶仔猪抗应激生理反应能力比较中的应用，其中，断奶小猪品种为安徽地方品种安庆六白猪。

本申请提供的“比较”概念是个体间的比较，根据不同个体间生化指标血清T-AOC含量及肠黏膜SIgA含量的大小，可以确定相同个体间肠道发育以及抗应激生理反应能力大小。“高”“低”通过个体之间数据比较获得，是一个相对的概念。

本发明具有如下优点：

1.本申请获得了断奶仔猪尤其是安徽地方品种安庆六白猪断奶仔猪肠道粘膜免疫发育与候选基因表达差异之间的关系，填补了现有技术的空白，由此得出断奶仔猪抗应激生理反应能力与候选基因表达差异之间的差异，为今后品种选育和新品系的建立提供参考。

2.本发明以仔猪抗应激生化指标免疫生化指标为血清T-AOC含量及肠黏膜SIgA含量为参照，在大量基因中寻找到与免疫生化指标为血清T-AOC含量及肠黏膜SIgA含量呈高度相关的候选基因，从而根据候选基因表达情况可以快速获得断奶仔猪尤其是安徽地方品种安庆六白猪的断奶仔猪肠道粘膜免疫发育以及断奶抗应激能力的高低，减少选育过程中的复杂性，避免断奶仔猪因为受到刺激等因素导致生化指标急剧变化而与实际不符，保证了结果的准确性。

附图说明

图1部分RNA电泳图

图2部分cDNA电泳图；其中，β-Actin条带114bp

图3 SLA-DQB基因的RT-PCR曲线；其中，图A为标准曲线；图B为扩增曲线；图C为溶解曲线

图4 FUT1基因的RT-PCR曲线；其中，图A为标准曲线；图B为扩增曲线；图C为溶解曲线

图5 LYZ基因的RT-PCR曲线；其中，图A为标准曲线；图B为扩增曲线；图C为溶解曲线

图6 TAP1基因RT-PCR曲线；其中，图A为标准曲线；图B为扩增曲线；图C为溶解曲线

图7 TLR4基因RT-PCR曲线；其中，图A为标准曲线；图B为扩增曲线；图C为溶解曲线

图8 33日龄和39日龄安庆六白猪和长白猪各肠段黏膜FUT1基因表达情况

图9 33日龄和39日龄安庆六白猪和长白猪各肠段黏膜LYZ基因表达情况

图10 33日龄和39日龄安庆六白猪和长白猪各肠段黏膜SLA-DQB基因表达情况

图11 33日龄和39日龄安庆六白猪和长白猪各肠段黏膜TAP1基因表达情况

图12 33日龄和39日龄安庆六白猪和长白猪各肠段黏膜TLR4基因表达情况

其中，图8-12中Δ表示不同品种同一日龄仔猪同一肠段差异显著(P＜0.05)，ΔΔ表示不同品种同一日龄仔猪同一肠段差异极显著(P＜0.01)；*表示同一品种不同日龄仔猪同一肠段差异显著(P＜0.05)，**表示同一品种不同日龄仔猪同一肠段差异极显著(P＜0.01)；不同小写字母表示单一品种单一日龄仔猪各肠段间差异显著(P＜0.05)，不同大写字母表示单一品种单一日龄仔猪各肠段间差异极显著(P＜0.01)。A：安庆六白猪，L：长白猪。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行具体阐述。

实施例1：

一、试验方法

1.1试验动物及样品采集

从安徽农业大学试验基地选择健康状态良好的长白猪和安庆六白猪28日龄断奶仔猪各20头，分别于33日龄、39日龄各取10头屠宰。前腔静脉采血，制备血清，置-20℃冰箱保存，用于血清生化指标检测。取小肠十二指肠、空肠、回肠各肠段8cm，迅速放入备有4％多聚甲醛的固定液中，待做组织切片；另从小肠截取8cm，用1％PBS溶液将肠段彻底冲洗干净，刮取肠黏膜无菌的冻存管中，并迅速放入液氮中保存，样品放入-80℃条件下保存至使用。试验所需仪器和试剂如果没有特别说明，均属于本领域普通技术人员通过常规渠道均可以获得。

1.2血清指标测定

从仔猪前腔静脉采血，4度冰箱静置一夜后，3000r/r/min离心15min分离制备血清。采用武汉新启迪公司的相应ELISA试剂盒，采用双抗体夹心酶联免疫法测定血清IgG、IgM、IgA、LYZ、GSH-Px、SOD、T-AOC。

1.3小肠黏膜SIgA含量测定

取0.2g各肠段黏膜放于1mL 1％的PBS缓冲液中研磨，制备匀浆液。采用武汉新启迪公司的分泌型免疫球蛋白A(SIgA)ELISA试剂盒测定肠黏膜上SIgA含量，方法和操作按说明书进行。

1.4实时荧光定量RT-PCR测定各个基因的表达水平

1.4.1十二指肠、空肠、回肠中总RNA提取

按Total RNA Kit II(50)(Omega)说明书提取总RNA，步骤如下：

(1)1.5mL无RNA酶离心管中加入1mL RNA-SOW Reagent裂解液，取约100mg的十二指肠组织(-80℃冰箱保存)于研钵中，边加液氮边研磨至粉末状，迅速转入含裂解液的1.5mL无RNA酶离心管中，充分震荡摇匀于室温下静置2～3min。

(2)静置后向里加入0.2mL氯仿，摇匀，剧烈振荡15-20s，随后放在冰上孵化10min。

(3)4℃，12000rmp离心15min后，混合物分离成3层，中间层和上层为水相RNA保存在上层水相中，下层为苯酚-氯仿相。

(4)将80％的水相转入新的EP管中，并向里加入三分之一体积的无水乙醇，最大速度漩涡震荡15s，接下来的步骤的离心操作均在室温条件下进行。

(5)将离心柱置于2mL收集管中，将步骤5中的液体转入离心柱中，10000rmp离心30～60s，弃流出液。

(6)将离心柱放入新的2mL收集管中，并加入300μl RNA Wash Buffer I，10000rmp离心30～60s，弃流出液。

(7)向离心柱中加入400μL RNAWash Buffer II，10000rmp离心30～60s，弃流出液。

(8)将离心柱放入新的2mL收集管中，向里加入500μLRNAWash Buffer II，10000rmp离心30～60s，弃流出液。

(9)重复步骤8，13000rmp离心2min，丢掉流出液，超净台内干燥离心柱5min。

(10)洗脱RNA，将离心柱转入1.5mL无RNA酶离心管中，向离心柱中加入300μLDEPC水，室温孵化2min，13000rmp离心1min，弃离心柱，保留流出液，即RNA，置于-80℃冰箱中保存。空肠、回肠中的总RNA提取同上述方法。

1.4.2RNA提取质量的检测

(1)使用紫外分光光度计测定RNA的OD260值、OD280值及浓度。OD260/

OD280值在1.8-2.0之间的RNA为合格品。

(2)甲醛变性胶检测RNA质量。取RNA样5μL与1μL的5×Loading buffer混匀，置于70℃水浴锅内加热10min，后置于冰上骤冷以消除RNA的二级结构。用1.2％甲醛变性凝胶电泳检测RNA质量，电压为100v。凝胶成像系统下观察条带，通常可以看到3条带，一般为28s、18s、5s，其中28s、18s较亮，5s较暗，且28s的亮度是18s的两倍的RNA质量比较好(见图1)，留下符合要求的RNA样。

(3)选择符合上述两个条件的RNA样稀释至1μg/μL分装于无RNA酶离心管内，于-80℃条件下保存以供反转录。

1.4.3组织提取的总RNA质量检测结果

提取安庆六白猪和长白猪十二指肠、空肠及回肠中的RNA并用甲醛变性胶进行电泳检测，电泳图中的18S、5S及28S三条条带清晰可见。因此，总RNA的质量符合实验要求，可进行反转录合成cDNA(图1)。

1.4.4引物设计与合成

根据GenBank中猪GLS、EGFR、IGF-1、IGF-1R的序列，设计引物序列，引物由上海生工生物公司合成。引物序列和PCR参数如表1所示。

表1.用于Real-time quantitative PCR的引物序列及PCR参数

1.4.5反转录合成cDNA

使用反转录试剂盒PrimeScript^TM RT reagent Kit with gDNA Eraser(TAKARA)，反应体系及反应条件如下，见表2、3。

表2.反转录第一步基因组DNA除去反应

反应条件：使用普通PCR仪设置程序42℃反应2min，4℃保存，得反应液I。

表3.反转录反应

反应条件：使用普通PCR仪设置程序37℃反应15min，85℃反应5sec，4℃保存。得反转录样品cDNA，检测后置于-20℃条件下备用。

1.4.6cDNA纯度检测

反应体系及反应条件如下，反应完成后取6μLPCR产物在1％琼脂糖凝胶上以120V电压电泳15min，凝胶成像系统下观察条带以鉴定cDNA纯度(β-Actin为例)。

表4.常规PCR反应

1.4.7cDNA纯度鉴定结果

将提取的总RNA按照相关反转录试剂盒说明合成cDNA。按照常规PCR反应体系添加反应物，引物为β-Actin基因，质粒为cDNA。采用琼脂糖凝胶电泳实验检测扩增的产物，在电泳图上可看到样品得到很好的β-Actin电泳条带。从电泳图片结果看，PCR扩增的产物条带清晰，且无杂带，说明该引物可特异性地扩增出目的产物。

1.4.8q-RT-PCR

(1)标准品制备及条件优化

每个待测RNA的反转录产物取等量混合，将cDNA混合样按梯度稀释，用RT-PCR的反应体系，对每个目的基因作标准曲线来优化整个反应条件。用标准曲线验证目的基因和内参基因的引物有效性、最佳退火温度、使用浓度及RT-PCR反应中的试剂，以评估每个目的基因和内参基因RT-PCR反应的最佳条件。RT-PCR反应体系及条件如下(表5)，每个样品重复3次，并设阴性对照。

(2)q-RT-PCR标准曲线的建立和扩增曲线

采用RT-PCR方法作目的基因FUT1、LYZ、TAP1、SLA-DQB、TLR4的标准曲线，得到各个目的基因及β-Actin基因的标准曲线，对结果相关数据进行分析，当标准曲线的相关系数及扩增效率均等于或接近于1.000时，表明实验数据误差较小，可信度较高，实验所得的Ct值可准确地测定起始cDNA的拷贝数。目的基因和看家基因标准曲线的斜率小于0.1，表明两个基因的标准曲线的斜率基本一致，在后续实验中可以使用分析Comparative Delta-delta Ct法进行相对定量分析。根据熔解曲线确认扩增产物的特异性需要，当熔解曲线的特异性扩增产物只有一个峰值，且无非特异性峰存在，说明引物的特异性良好，可以在后续实验中使用。根据上述要求进行试验，从而得到所有样品扩增曲线，见图3-7。

(3)相关候选基因的q-RT-PCR反应

采用RT-PCR法检测猪FUT1、LYZ、TAP1、SLA-DQB、TLR4基因及内参基因β-Actin在断奶仔猪小肠各段的表达量。反应体系及反应条件如下(表5)，反应体系为20μL。基因表达量分析：目的基因mRNA表达丰度采用2^-ΔΔCT法对有效数据进行统计分析^[60]，计算出每个样本目的基因的相对表达水平，通过内参基因β-Actin校正。

表5.q-RT-PCR反应体系及反应条件

1.6数据分析

试验数据用平均数±标准差(mean±SD)表示，采用SPSS20.0软件对结果中的数据进行分析，品种间同一日龄的均值差异、品种内不同日龄的均值差异、品种内种不同日龄同一肠段的均值差异均采用独立样本T检验统计分析，单一品种单一日龄小肠各段的均值差异采用One-WayANOVA统计分析，显著性差异水平为P＜0.05，极显著性差异水平为P＜0.01。采用Bivariate correlation进行数据相关性分析。

(二)数据分析

2.1小肠黏膜FUT1、LYZ、TAP1、SLA-DQB、TLR4mRNA的相对表达水平

2.1.1FUT1 mRNA的相对表达水平

33日龄时，长白猪小肠各段FUT1 mRNA表达水平均极显著高于安庆六白猪(P＜0.01)。39日龄时，长白猪小肠各段FUTl mRNA表达水高于安庆六白猪，其中空肠段达极显著水平(P＜0.01)。同一猪种39日龄断奶仔猪小肠各段FUT1 mRNA表达水平与33日龄断奶仔猪比较发现，安庆六白猪小肠各段表现出下降的趋势，长白猪小肠各段FUT1 mRNA表达水平极显著下降(P＜0.01)。

33日龄和39日龄时，两猪种小肠各段FUT1 mRNA的表达水平依次均是回肠最高，空肠次之，十二指肠最低。33日龄时，两猪种均是回肠FUTl mRNA的表达水平极显著高于十二指肠和空肠(P＜0.01)，空肠显著高于十二指肠(P＜0.05)。39日龄时，安庆六白猪回肠FUTl mRNA的表达水平极显著高于十二指肠和空肠(P＜0.01)，十二指肠与空肠无显著差异；长白猪回肠FUT1 mRNA的表达水平极显著高于十二指肠和空肠(P＜0.01)，空肠显著高于十二指肠(P＜0.05)(见图4)。

2.1.2LYZ mRNA的相对表达水平

33日龄时，安庆六白猪十二指肠和空肠LYZ mRNA表达水平均极显著高于长白猪(P＜0.01)，回肠与长白猪差异不显著。39日龄时，安庆六白猪小肠各段LYZmRNA表达水平与长白猪差异不显著。同一猪种39日龄小肠各段LYZmRNA表达水平与33日龄比较发现，长白猪十二指肠LYZ mRNA表达水平极显著下降(P＜0.01)，空肠及回肠变化不显著；安庆六白猪十二指肠和空肠LYZ mRNA表达水平均极显著下降(P＜0.01)，回肠变化不显著。

33日龄和39日龄时，两猪种小肠各段LYZ mRNA的表达水平依次均是十二肠最高，空肠次之，回肠最低。33日龄时，安庆六白猪十二指肠及空肠LYZmRNA的表达水平均极显著高于回肠(P＜0.01)，十二指肠与空肠无显著差异；长白猪十二指肠LYZ mRNA的表达水平极显著高于空肠和回肠(P＜0.01)，而空肠和回肠之间无显著差异。39日龄时，安庆六白猪和长白猪小肠各段LYZmRNA的表达水平均无显著差异(见图5)。

2.1.3SLA-DQBmRNA的相对表达水平

33日龄和39日龄时，安庆六白猪十二指肠和回肠SLA-DQBmRNA表达水平均显著高于长白猪(P＜0.05)，空肠极显著高于长白猪(P＜0.01)。同一猪种39日龄小肠各段SLA-DQBmRNA表达水平与33日龄比较发现，安庆六白猪回肠SLA-DQBmRNA表达水平显著提高(P＜0.05)，其他组变化不显著。

33日龄和39日龄时，两猪种小肠各段SLA-DQBmRNA的表达水平依次均是空肠最高，回肠次之，十二指肠最低。33日龄时，安庆六白猪空肠SLA-DQBmRNA的表达水平极显著高于十二指肠和回肠(P＜0.01)，十二指肠与回肠差异不显著；长白猪十二指肠SLA-DQBmRNA的表达水平极显著低于空肠(P＜0.01)，显著低于回肠(P＜0.05)，空肠与回肠无显著差异。39日龄时，安庆六白猪空肠SLA-DQBmRNA的表达水平极显著高于十二指肠和回肠(P＜0.01)，十二指肠和回肠之间无显著差异；长白猪空肠和回肠SLA-DQBmRNA的表达水平极显著高于十二指肠(P＜0.01)，空肠和回肠差异不显著(见图6)。

2.1.4TAPl mRNA的相对表达水平

除安庆六白猪33日龄空肠和39日龄回肠TAP1 mRNA表达显著高于长白猪外(P＜0.05)，33日龄和39日龄时，安庆六白猪小肠TAP1 mRNA表达水平与长白猪无显著差异。同一猪种39日龄小肠各段TAP1 mRNA表达水平与33日龄比较发现，安庆六白猪空肠TAP1 mRNA表达水平显著下降(P＜0.05)；长白猪空肠和回肠、十二指肠TAP1 mRNA表达水平均极显著、显著下降(P＜0.01，P＜0.05)。两猪种不同日龄小肠各段TAPl mRNA表达模式相同，均表现为空肠最高，十二指肠次之，回肠最低，且除33日龄安庆六白猪空肠TAP1 mRNA表达量显著高于回肠外(P＜0.05)，其他组小肠各段差异不显著(见图7)。

2.1.5TLR4 mRNA的相对表达水平

33日龄时，长白猪十二指肠TLR4 mRNA表达水平极显著高于安庆六白猪(P＜0.01)，空肠及回肠TLR4 mRNA表达水平与安庆六白猪差异不显著。39日龄时，安庆六白猪小肠各段TLR4 mRNA表达水平与长白猪差异不显著。同一猪种39日龄小肠各段TLR4 mRNA表达水平与33日龄比较发现，安庆六白猪肠道各段TLR4 mRNA表达水平均有所提高；长白猪十二指肠TLR4 mRNA表达水平显著降低了(P＜0.01)，空肠和回肠表现出下降的趋势。两猪种不同日龄小肠TLR4 mRNA表达模式均是十二指肠最高，回肠次之，空肠最低，各肠段差异不显著(见图8)。

2.2.相关性

2.2.1小肠免疫发育相关基因表达量与血清T-AOC含量的相关性

33日龄和39日龄时，两猪种FUT1、TLR4基因表达量与血清T-AOC含量呈负相关，且33日龄安庆六白猪空肠段及长白猪十二指肠段FUT1、两猪种十二指肠段TLR4基因表达量与血清T-AOC含量显著负相关(P＜0.05)。33日龄和39日龄两猪种LYZ、SLA-DQB、TAPl基因表达量与血清T-AOC含量呈正相关，且33日龄两猪种十二指肠SLA-DQB基因表达量与血清T-AOC含量达显著相关(P＜0.05)、33日龄安庆六白猪空肠及长白猪十二指肠TAP1基因表达量与血清T-AOC含量达极显著相关(P＜0.05)(见表6)。

表6.FUTl、LYZ、SLA-DQB、TAPl、TLR4 mRNA与血清T-AOC含量的相关性

2.2.2小肠免疫发育相关基因表达量与小肠黏膜SIgA含量的相关性

33和39日龄时，两猪种小肠各段FUT1、TLR4基因表达量与小肠黏膜SIgA含量均负相关，且33日龄安庆六白猪十二指肠FUT1基因、空肠TLR4基因表达量与小肠黏膜SIgA含量显著、极显著负相关(P＜0.05，0.01)。33和39日龄时，两猪种小肠各段LYZ、SLA-DQB、TAP1基因表达量与小肠黏膜SIgA含量呈正相关，且33日龄安庆六白猪空肠LYZ基因、十二指肠及空肠SLA-DQB、TAP1基因与小肠黏膜SIgA含量显著、极显著正相关(P＜0.05，0.01)(见表7)。

表7.FUT1、LYZ、SLA-DQB、TAP1、TLR4 mRNA与小肠黏膜SIgA含量的相关性

2.3结论

小肠黏膜免疫发育相关基因FUT1及TLR4基因在小肠各段的表达与仔猪免疫生化指标血清T-AOC含量及肠黏膜SIgA含量达高度负相关，且应激高峰期在长白猪小肠各段显著高于安庆六白猪；LYZ、SLA-DQB、TAPl基因在小肠各段的表达与仔猪免疫生化指标血清T-AOC含量及肠黏膜SIgA含量达高度正相关，且应激高峰期在安庆六白猪小肠各段的表达显著高于长白猪。说明断奶仔猪安庆六白猪比断奶仔猪长白猪的的免疫生化指标血清T-AOC含量及肠黏膜SIgA含量更高，安庆六白猪断奶仔猪小肠黏膜免疫发育更好，在断奶应激期肠道抗病力更强。

可以知道，上述实施例仅为了说明发明原理而采用的示例性实施方式，然而本发明不仅限于此，本领域技术人员在不脱离本发明实质情况下，可以做出各种改进和变更，这些改进和变更也属于本发明的保护范围。

<110>安徽农业大学

<120>一种比较断奶仔猪肠道免疫发育能力的引物对和方法

<160>12

<210>1

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>上游引物序列FUT1 -F

<400>1

CGATTTACCA AACGCCACTT 20

<210>2

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>下游引物序列FUT1-R

<400>2

TTCAGAGCCT TCCATTCCTG 20

<210>3

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>上游引物序列LYZ -F

<400>3

GGCGAACTGG GTGTGTTT 18

<210>4

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>下游引物序列LYZ -R

<400>4

TGGGTGTCTT GCCATCATTA 20

<210>5

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>上游引物序列TAP1 -F

<400> 5

GCCTTCACGC AGAACCTAAC 20

<210>6

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>下游引物序列TAP1 -R

<400>6

CAGGACAGAC CGAAACACCT 20

<210>7

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>上游引物序列SLA-DQB -F

<400>7

TAAACCACCA CAACCTGCTG 20

<210>8

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>下游引物序列SLA-DQB -R

<400> 8

GGTCCAGTCT CCGTTCCTAA T 21

<210>9

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>下游引物序列TLR4 -R

<400>9

GCCTTTCTCT CCTGCCTGAG 20

<210>10

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>下游引物序列TLR4 -R

<400>10

AGCTCCATGC ATTGGTAACT AATG 24

<210>11

<211> 20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>下游引物序列β-antin-F

<400>11

CTCGATCATG AAGTGCGACG 20

<210>12

<211> 23

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>下游引物序列β-antin -R

<400>12

GTGATCTCCT TCTGCATCCT GTC 23