本发明涉及医学技术领域，尤其涉及一种山牡荆抗肿瘤化合物的研究方法。
背景技术：
恶性肿瘤是一种严重危害人类健康和生命的疾病，也是世界医学界的重大难题。2008年，全球恶性肿瘤患者1270万人，死亡人数高达760万。世界范围内因恶性肿瘤死亡的人数，比艾滋病、疟疾和结核病加起来还要多。如果不采取有效措施，预计到2030年，每年将出现2600万新增恶性肿瘤病例，死亡人数将达到1700万。我国每年恶性肿瘤的发病人数约为200万，死亡人数超过140万，并有逐年上升的趋势。攻克恶性肿瘤难关已成为医药工作者和化学工作者当务之急的任务。
近年来中药及其有效成分抗肿瘤研究工作取得了一系列的成果，从植物中得到的抗肿瘤成分主要包括生物碱类、萜类、黄酮类、植物多糖类、多酚类、有机酸类和木脂素类等化合物。当今国际上常用的抗肿瘤植物药和辅助化疗的中药主要包括紫杉醇、喜树碱、长春花碱、白藜芦醇、鬼臼毒素等。这些植物药基本上已用于所有种类的癌症的治疗或辅助治疗，如紫杉醇已用于喉癌、卵巢癌，黄芪等用于肝癌、五加多糖用于胃癌，魔芋用于腹水肿瘤，山豆根等用于治疗消化道癌等。
目前，世界上对抗肿瘤药用植物的研究工作已经涉及300余科植物，从植物中筛选出的抗癌活性成分已达617万种。美国国立癌症研究所自1957年以来，每年筛选出1500-5000中植物提取物的抗癌活性成分。中国的中医药具有2500多年的历史，它们在治疗各种疑难杂症中显现出了神奇的疗效。但我国对植物有效成分的提取分离工作开展较晚，目前约对3000余种(占我国植物总数的10％左右)植物进行了有效成分的研究工作，发现不足300种植物有效成分具有抗癌活性，研究较多的有200余种。因此，我们必须加大对中医药的研究力度和深度，力争从植物中获得毒性低而抗肿瘤作用显著的新衍生物。
牡荆属植物Vitex是马鞭草科乔木或灌木，全世界约250种，主要分布于热带和温带地区。我国有14种，7变种，3变型，主要分布在长江以南地区，少数种类在西北、东北、华北等地也有分布。牡荆属植物含有多种化学成分，迄今从该属植物中获得的天然产物类型有黄酮类、二帖类、甾类、环烯醚萜类、三萜类、苯丙素类、倍半萜类等。现代药理研究表明，本属植物所含成分具有多种药理活性，如抗肿瘤、调节内分泌、解热镇痛、抗炎作用、保肝作用、抗氧化作用、抗菌作用、杀虫作用以及呼吸系统活性等。国内外许多研究机构对牡荆属的抗肿瘤作用具有浓厚的兴趣，抗肿瘤活性成为该属植物目前研究的热点之一。该属植物提取物可以通过多种途径抑制肿瘤增殖和诱导肿瘤细胞的凋亡，发挥抗肿瘤活性。
技术实现要素：
本发明的目的是为了解决现有技术中存在的缺点，而提出的一种山牡荆抗肿瘤化合物的研究方法。
一种山牡荆抗肿瘤化合物的研究方法，包括以下步骤；
S1：探索山牡荆有效成分的最佳提取方法，应用传统提取方法、超声波提取方法、微波提取方法和超临界流体萃取提取方法分别对山牡荆有效成分进行提取，选取最佳的提取方法；
S2：对山牡荆中的有效成分进行分离和纯化，采用有效的分离方法对山牡荆中的有效成分进行分离制备；
S3：将分离出的山牡荆有效成分进行结构鉴定，利用化学手段和现代仪器技术对分离得到的山牡荆各成分进行鉴定；
S4：筛选对山牡荆最敏感的肿瘤细胞和有效的抗肿瘤药物浓度，并进行抗肿瘤细胞实验，配制不同浓度的山牡荆提取物，进行山牡荆体外抗肿瘤活性实验，筛选对山牡荆和单叶蔓荆最为敏感的肿瘤细胞和有效的抗肿瘤药物浓度，并用最敏感的肿瘤细胞进行有效成分抗肿瘤细胞实验，确定抗肿瘤活性成分的抗肿瘤效果；
S5：进行活体抗肿瘤实验；
S6：对化合物进行结构改造，发掘山牡荆抗肿瘤化合物，以活性较好的化合物作为先导化合物，通过进一步的结构简化，考察分子中各结构片段对抗肿瘤活性的影响，并利用化学手段，结合计算机辅助药物设计及构效关系研究，对其进行结构改造，合成大量化合物，结合活性评价，发掘抗肿瘤效果好的山牡荆化合物。
优选的，所述山牡荆中有效成分的分离方法采用色谱分离法，所述色谱分离法包括高效液相制备色谱、中压制备液相色谱和逆流色谱。
优选的，所述活体抗肿瘤实验的具体方法为：选用对山牡荆抗肿瘤成分最敏感的肿瘤细胞构建小鼠肿瘤模型，将山牡荆和单叶蔓荆抗肿瘤成分的高、中、低三个剂量设为实验组，以生理盐水为空白组进行体内抗肿瘤实验，定期监测小鼠皮下瘤体生长情况并对动物进行生存观察，观察结束后，处死小鼠并取动物肿瘤及相关脏器组织进行HE、免疫组化及凋亡染色，分析动物有无系统性损害。
本发明提出的一种山牡荆抗肿瘤化合物的研究方法，能够对山牡荆的有效成分进行提取和分离，系统的研究山牡荆活性成分的化学多样性，探索山牡荆的抗肿瘤活性成分，发掘山牡荆抗肿瘤化合物，并为研究新型抗肿瘤药物提供科学依据和理论基础。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步解说。
本发明提出的一种山牡荆抗肿瘤化合物的研究方法，包括以下步骤；
S1：探索山牡荆有效成分的最佳提取方法，应用传统提取方法、超声波提取方法、微波提取方法和超临界流体萃取提取方法分别对山牡荆有效成分进行提取，选取最佳的提取方法；
S2：对山牡荆中的有效成分进行分离和纯化，采用有效的分离方法对山牡荆中的有效成分进行分离制备；
S3：将分离出的山牡荆有效成分进行结构鉴定，利用化学手段和现代仪器技术对分离得到的山牡荆各成分进行鉴定；
S4：筛选对山牡荆最敏感的肿瘤细胞和有效的抗肿瘤药物浓度，并进行抗肿瘤细胞实验，配制不同浓度的山牡荆提取物，进行山牡荆体外抗肿瘤活性实验，筛选对山牡荆和单叶蔓荆最为敏感的肿瘤细胞和有效的抗肿瘤药物浓度，并用最敏感的肿瘤细胞进行有效成分抗肿瘤细胞实验，确定抗肿瘤活性成分的抗肿瘤效果；
S5：进行活体抗肿瘤实验；
S6：对化合物进行结构改造，发掘山牡荆抗肿瘤化合物，以活性较好的化合物作为先导化合物，通过进一步的结构简化，考察分子中各结构片段对抗肿瘤活性的影响，并利用化学手段，结合计算机辅助药物设计及构效关系研究，对其进行结构改造，合成大量化合物，结合活性评价，发掘抗肿瘤效果好的山牡荆化合物。
本发明中，所述山牡荆中有效成分的分离方法采用色谱分离法，所述色谱分离法包括高效液相制备色谱、中压制备液相色谱和逆流色谱。
本发明中，所述活体抗肿瘤实验的具体方法为：选用对山牡荆抗肿瘤成分最敏感的肿瘤细胞构建小鼠肿瘤模型，将山牡荆和单叶蔓荆抗肿瘤成分的高、中、低三个剂量设为实验组，以生理盐水为空白组进行体内抗肿瘤实验，定期监测小鼠皮下瘤体生长情况并对动物进行生存观察，观察结束后，处死小鼠并取动物肿瘤及相关脏器组织进行HE、免疫组化及凋亡染色，分析动物有无系统性损害。
按照本发明提出的方法对山牡荆进行提取和分离，得到二十多个单体化合物，其中主要有以下几种：
其中，1为紫花牡荆素；
2为β-谷甾醇；
3为胡萝卜甾醇；
4为ro tundifuran；
5为3,5-O-双咖啡酰基奎宁酸；
6为3-羟基-9-苯丁酮-4-氧-葡萄糖苷；
7为7-羟基-1-(4-羟基-3-甲氧基苯基)-2-羟甲基-6-甲氧基-1,2二氢-3-萘甲醛；
8为vitrofolal C；
9为木犀草素；
10为mussaenosidic acid；
11为turkesterone；
12为vitexifolin E；
13为4,5,7,3’,4’,5’-六羟基-6,8-二甲氧基二氢黄酮醇。
对以上化合物进行初步活性测试，测试结果表明：紫花牡荆素对人胃癌SGC27901细胞和人肝癌Hep G2细胞生长有明显的抑制作用(0.15μg/ml浓度时，抑制率分别为75％和60％)，ro tundifuran和木犀草素对人宫颈癌Hela细胞有明显的抑制作用(0.30μg/ml浓度时，抑制率分别为80％和65％)，3,5-O-双咖啡酰基奎宁酸对人肝癌Hep G2细胞生长有一定的抑制作用(0.50μg/ml浓度时，抑制率为55％)。
本发明提出的一种山牡荆抗肿瘤化合物的研究方法，能够对山牡荆的有效成分进行提取和分离，系统的研究山牡荆活性成分的化学多样性，探索山牡荆的抗肿瘤活性成分，发掘山牡荆抗肿瘤化合物，并为研究新型抗肿瘤药物提供科学依据和理论基础。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。