1.转基因水稻Bt63的微滴式数字PCR检测方法,包括以下步骤:
(1)获得引物和探针,所述引物和探针包括:
抗虫转基因水稻Bt63的内源引物和探针:
PLD-Forward:TGGTGAGCGTTTTGCAGTC
PLD-Reverse:CTGATCCACTAGCAGGAGGTC
PLD-Probe:FAM-TGTTGTGCTGCCAATGTGGCCT-TAMRA
抗虫转基因水稻Bt63品系的特异性引物和探针:
Bt63-Forward:AGAGACTGGTGATTTCAGCGG
Bt63-Reverse:GCGTCCAGAAGGAAAAGGAAT
Bt63-Probe:FAM-ATCTGCCCCAGCACTCGTCC-BHQ1;
(2)提取待测样品、阳性对照、阴性对照的DNA;
(3)将步骤(2)所得DNA进行数字微滴式PCR扩增,获得反应液;
(4)对步骤(3)反应液进行检测与分析。
2.根据权利要求1所述的检测方法,其特征是,所述数字微滴式PCR扩增反应体系包括:2×ddPCR TM Supermix for Probe 10μl,上游引物和下游引物各1.8μl,探针0.5μl,浓度为10~50ng/μl DNA模板2μl,补水至反应体系为20μl;得待测样品反应体系、阳性对照反应体系、阴性对照反应体系。
3.根据权利要求1所述的检测方法,其特征是,步骤(3)还包括将步骤(1)所得的引物和探针用DEPC处理水进行溶解稀释,引物稀释至浓度为900nM,探针稀释至浓度250nM。
4.根据权利要求2所述的检测方法,其特征是,所述待测样品反应体系、阳性对照反应体系、阴性对照反应体系分别进行以下操作:将反应体系加入微滴发生板的样品孔中,在相应微滴发生油孔中加入70μL微滴发生油,装好胶条,置于微滴发生器中形成微滴;之后,将发生好的微滴用8道移液器转移至0.2mL PCR反应管中,用配套铝箔封口后,置于PCR仪上进行PCR反应,PCR反应参数为:95℃/10min;94℃/30s,57℃/30s,40个循环;98℃/10min。Ramp rate 2℃/s,从而分别得待测样品反应液、阳性对照反应液、阴性对照反应液。
5.根据权利要求1所述的检测方法,其特征是,所述步骤(4)包括将步骤(3)所得的反应液放入微滴式数字PCR仪的微滴分析器中,并在软件QuantaSoft上设定检测模式为ABS,检测FAM的荧光信号,仪器会自动分析每个微滴中荧光信号,然后,由QuantaSoft计算各样品相关基因拷贝数浓度。
6.根据权利要求1中所述的检测方法,其特征是,所述步骤(2)中选用CTAB分步离心法、或者DNA提取试剂盒进行DNA的提取。
7.根据权利要求1中所述的检测方法,其特征是,以米或米制品为待测样品,以转基因稻米Bt63为阳性对照,以非转基因稻米或者非Bt63的转基因稻米为阴性对照。
8.转基因水稻Bt63的微滴式数字PCR检测试剂盒,其特征是,包括:
抗虫转基因水稻Bt63的内源引物和探针:
PLD-Forward:TGGTGAGCGTTTTGCAGTC
PLD-Reverse:CTGATCCACTAGCAGGAGGTC
PLD-Probe:FAM-TGTTGTGCTGCCAATGTGGCCT-TAMRA
抗虫转基因水稻Bt63品系的特异性引物和探针:
Bt63-Forward:AGAGACTGGTGATTTCAGCGG
Bt63-Reverse:GCGTCCAGAAGGAAAAGGAAT
Bt63-Probe:FAM-ATCTGCCCCAGCACTCGTCC-BHQ1。
9.根据权利要求8所述检测试剂盒,其特征是,还包括2×ddPCR TM Supermix for Probes。