一种四溴双酚A衍生物TBBPA‑DHEE半抗原合成方法及用途与流程

本发明属于四溴双酚A衍生物TBBPA-DHEE半抗原技术领域，尤其涉及一种四溴双酚A衍生物TBBPA-DHEE两个苯环中间的支链改造(两个苯环中间的支链进行衍生化)，使之具备耦合用羧基的合成方法，并对其用途进行研究。

背景技术：

四溴双酚A(TBBPA)及其衍生物是一类在全球广泛使用的溴代阻燃剂，研究表明，TBBPA具有强甲状腺激素干扰活性以及弱雌激素活性，会通过干扰甲状腺动态平衡而对机体产生危害。TBBPA-DHEE即为其中一种，是一种重要的添加型阻燃剂。目前，TBBPA及其衍生物在生产过程中的使用、泄露等使其进入环境，可在多介质环境中残留、积累，并造成潜在危害。

因此，开展四溴双酚A及其衍生物的分析测定具有重要的现实意义。目前，检测四溴双酚A及其衍生物的方法均基于仪器分析方法，具有准确性好、灵敏度高的优点，但是由于所用仪器极其昂贵，而且存在测试成本高、分析时间长、检测所需样品量大及前处理步骤繁琐等不足，无法在较大范围内系统、全面、快速分析环境中TBBPA及其衍生物的含量，因此，建立一种快速简便的四溴双酚A检测方法是具有重要意义的。

和其他传统检测方法相比，生物分析方法是基于抗体(或其它具有识别功能的生物大分子)特异性反应的一种分析方法，已广泛应用于食品与环境中小分子污染物的分析检测。该方法具有灵敏度高、方便快捷、高通量、低成本等优势。而建立此方法的前提是相应抗体的研制。

由于TBBPA-DHEE是小分子物质，小分子化合物因其分子量小，缺乏免疫原性，在免疫动物时，很难诱导产生特异性细胞及体液免疫反应。为此，需要将小分子物质与大分子载体蛋白偶联，使其成为完全抗原。小分子化合物的抗体，是通过半抗原作为抗原决定簇免疫动物而获得，所以设计并合成合理的半抗原是制备亲和性好、灵敏度高的抗体的关键。其原则是设计合成与待测物结构类似的半抗原，并尽量保持与待测物共有的结构作为母核。

对于半抗原结构的选择，如果待测物本身含有-NH₂，-COOH，-OH，-SH等功能基团，可直接活化后联入载体蛋白，便可合成人工完全抗原。但大部分待测物分子并不含有功能基团，或功能基团对待测物的特异性和极性影响较大，因此，需要对小分子化合物进行结构改造，使其具有能共价结合到载体蛋白上的一种功能基团(如氨基、羧基、羟基和巯基等)。

本发明基于以上原则，设计了四溴双酚A衍生物TBBPA-DHEE半抗原合成方法，以双酚酸为原料，通过4步反应得到四溴双酚A衍生物TBBPA-DHEE的半抗原，为后续建立四溴双酚A衍生物TBBPA-DHEE的生物分析方法提供了有利条件，该抗原目前尚无文献报道。

技术实现要素：

本发明目的是克服现有技术的不足之处，提供了一种四溴双酚A衍生物TBBPA-DHEE(4,4-双(3,5-二溴-4-(2-羟基乙氧基)苯基)戊酸)半抗原的合成方法。

本发明的技术方案：一种四溴双酚A衍生物TBBPA-DHEE半抗原，其结构简式如下所示：

所述四溴双酚A衍生物衍生物TBBPA-DHEE半抗原的合成方法，以双酚酸为原料，通过4步反应得到半抗原。反应过程如下所示：

一种四溴双酚A衍生物TBBPA-DHEE半抗原合成方法，合成步骤如下：

步骤1、以4,4-双(4-羟苯基)戊酸为原料与甲醇发生酯化反应生成4,4-双(4-羟基苯基)戊酸甲酯(a)，步骤如下：

称取原料4,4-双(4-羟苯基)戊酸装入圆底烧瓶内，加入甲醇，回流反应得到化合物4,4-双(4-羟基苯基)戊酸甲酯；

步骤2、通过化合物a与液溴发生取代反应生成4,4-双(3,5-二溴-4-羟苯基)戊酸甲酯(b)，合成步骤如下：

把溶有Br₂的冰醋酸A慢慢加入到溶有4,4-双(4-羟基苯基)戊酸甲酯的冰醋酸B中，持续搅拌；搅拌完成后，将得到的混合物倒入亚硫酸氢钠的饱和水溶液除去未反应的Br₂；再将所得的产物通过过滤分离，并用冷水洗涤；产物干燥后，重新溶解在甲醇中搅拌均匀，滤除不溶物，滤液在真空下蒸发，得到粗产物，将其通过硅胶柱色谱法纯化得到4,4-双(3,5-二溴-4-羟苯基)戊酸甲酯；

步骤3、4,4-双(3,5-二溴-4-羟基苯基)戊酸甲酯通过与2-溴乙醇发生取代反应，得到半抗原4,4-双(3,5-二溴-4-(2-羟基乙氧基)苯基)戊酸甲酯(c)，合成步骤如下：

在二颈瓶中加入4,4-双(3,5-二溴-4-羟基苯基)戊酸甲酯，碳酸钾，2-溴乙醇，二甲基甲酰胺，恒温反应，旋干二甲基甲酰胺，通过硅胶柱色谱法纯化得到化合物4,4-双(3,5-二溴-4-(2-羟基乙氧基)苯基)戊酸甲酯1.1g；

步骤4、化合物c通过与氢氧化钠发生皂化反应，盐酸酸化，得到半抗原4,4-双(3,5-二溴-4-(2-羟基乙氧基)苯基)戊酸，合成步骤如下：

将4,4-双(3,5-二溴-4-(2-羟基乙氧基)苯基)戊酸甲酯、氢氧化钠混合，加入甲醇/水混合溶液，恒温反应，反应完毕后，加盐酸调节pH＝4～5，用二氯甲烷提取反应液三次，浓缩，通过硅胶柱色谱法纯化得化合物4,4-双(3,5-二溴-4-(2-羟基乙氧基)苯基)戊酸。

步骤1中，所述4,4-双(4-羟苯基)戊酸、甲醇的用量比为2.86g：20mL，所述回流反应温度为60℃，回流反应时间为2h。

步骤2中，所述冰醋酸A中，Br₂的浓度为16mol/L；所述冰醋酸B中，4,4-双(4-羟基苯基)戊酸甲酯的浓度为0.24mol/L；所使用的冰醋酸A与冰醋酸B的体积比为1:4；所述持续搅拌的时间为5h。

步骤3中，所述4,4-双(3,5-二溴-4-羟基苯基)戊酸甲酯、碳酸钾、2-溴乙醇、二甲基甲酰胺的用量比为1.2g:0.552g:350μL:7mL；所述恒温反应的温度为100℃，恒温反应时间为10h。

步骤4中，所述4,4-双(3,5-二溴-4-(2-羟基乙氧基)苯基)戊酸甲酯、氢氧化钠、甲醇/水混合溶液的用量比为1.1g:0.3g:25mL，所述甲醇/水混合溶液中，甲醇与水的体积比为1:1；所加入的盐酸浓度为1mol/L；所述恒温反应的温度为60℃，恒温反应时间为4h。

所制备的4,4-双(3,5-二溴-4-(2-羟基乙氧基)苯基)戊酸用于载体蛋白BSA相偶联，制备四溴双酚A衍生物TBBPA-DHEE人工免疫抗原。

本发明的有益效果：本发明经过反复试验成功的设计并合成了一种四溴双酚A衍生物TBBPA-DHEE的半抗原，是一种新型的四溴双酚A衍生物TBBPA-DHEE半抗原的合成方法，该方法不仅简单、安全、可行，而且所得半抗原能与载体蛋白成功结合得到四溴双酚A衍生物TBBPA-DHEE的人工抗原，使用该免疫原免疫动物，获得了能特异性识别四溴双酚A衍生物TBBPA-DHEE的单克隆和多克隆抗体，抗体效价高，特异性强，可广泛用于四溴双酚A衍生物TBBPA-DHEE的免疫分析研究。

附图说明

图1本发明制备的4,4-双(3,5-二溴-4-(2-羟基乙氧基)苯基)戊酸的核磁共振氢谱图；

图2为本发明制备的4,4-双(3,5-二溴-4-(2-羟基乙氧基)苯基)戊酸的质谱图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例1

(1)以4,4-双(4-羟苯基)戊酸为原料与甲醇发生酯化反应生成4,4-双(4-羟基苯基)戊酸甲酯(a)，步骤如下：

称取原料4,4-双(4-羟苯基)戊酸2.86g装入圆底烧瓶内，加入甲醇20ml，60℃回流2h得到化合物4,4-双(4-羟基苯基)戊酸甲酯2.9g。产率96％。

(2)通过化合物a与液溴发生取代反应生成4,4-双(3,5-二溴-4-羟苯基)戊酸甲酯(b)，合成步骤如下：

把10mL溶有25.7g,0.16mol Br₂的冰醋酸慢慢加入到40mL溶有2.9g，9.6mmol4,4-双(4-羟基苯基)戊酸甲酯的冰醋酸中，持续搅拌5小时。将混合物倒入亚硫酸氢钠的饱和水溶液除去未反应的Br₂。将所得的产物通过过滤分离，并用冷水洗涤。干燥后，将所得产物重新溶解在100mL甲醇中，搅拌30分钟。不溶物通过过滤除去，滤液在真空下蒸发，得到粗产物，将其通过硅胶柱色谱法纯化得到4,4-双(3,5-二溴-4-羟苯基)戊酸甲酯(4.2g)。产率70％。

(3)4,4-双(3,5-二溴-4-羟基苯基)戊酸甲酯通过与2-溴乙醇发生取代反应，得到半抗原4,4-双(3,5-二溴-4-(2-羟基乙氧基)苯基)戊酸甲酯(c),合成步骤如下：

在二颈瓶中加入4,4-双(3,5-二溴-4-羟基苯基)戊酸甲酯1.2g，加入碳酸钾552mg，2-溴乙醇350μL，二甲基甲酰胺7ml，在100℃下反应10h，旋干二甲基甲酰胺,通过硅胶柱色谱法纯化得到化合物4,4-双(3,5-二溴-4-(2-羟基乙氧基)苯基)戊酸甲酯1.1g,产率80％。

(4)化合物c通过与氢氧化钠发生皂化反应，盐酸酸化，得到半抗原4,4-双(3,5-二溴-4-(2-羟基乙氧基)苯基)戊酸(D₃)，合成步骤如下：

将1.1g 4,4-双(3,5-二溴-4-(2-羟基乙氧基)苯基)戊酸甲酯、氢氧化钠300mg混合，加入甲醇和水(1:1，25ml)，在60℃下反应4h结束，加1mol/L盐酸调pH至4-5，用二氯甲烷提取反应液三次，浓缩，通过硅胶柱色谱法得化合物4,4-双(3,5-二溴-4-(2-羟基乙氧基)苯基)戊酸(D₃)0.95g，产率85％。

所制备的4,4-双(3,5-二溴-4-(2-羟基乙氧基)苯基)戊酸的表征见图1、图2，其中核磁共振氢谱如下：¹H NMR(CDCl3,400MHz)δ(ppm):1.56(s,3H),1.95(m,2H),2.32(m,2H),3.76(q,J＝5.6Hz,4H),3.97(t,J＝5.6Hz,4H),4.90(t,J＝5.6Hz,2H),7.45(s,4H),12.17(s,1H)。质谱结果如下：calculated for C21H22Br4O6:690.01；found:689.08([M-H+])。

实施例2

利用碳化二亚胺法将合成的四溴双酚A衍生物TBBPA-DHEE半抗原D₃与载体蛋白BSA相偶联，制备四溴双酚A衍生物TBBPA-DHEE人工免疫抗原：

称取400mg EDC·HCl和15mg BSA溶于2mL 0.01mol/L pH＝7.4的PBS溶液中，于磁力搅拌器上搅拌30min。称取45mg半抗原D₃溶于1mL 0.01mol/L pH＝7.4的PBS溶液中，逐滴滴加到上述混合溶液中，室温下搅拌1h，4℃放置过夜。将反应终液置于0.01mol/L pH＝7.4的PBS溶液中4℃透析，每4-12小时换透析一次液，共透析3天。透析结束后将透析袋中的蛋白溶液，即为四溴双酚A人工抗原D₃-BSA分成若干等份分装于1mL离心管中，于-20℃冰箱中存放备用。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。