高效表达米黑根毛霉脂肪酶的方法与流程

本发明涉及高效表达米黑根毛霉脂肪酶的方法。

背景技术：

脂肪酶(lipaseec3..1.1.3)即三酰基甘油酰基水解酶，它催化天然底物油脂水解生成脂肪酸、甘油和甘油单酯或二酯，广泛应用于油脂加工、食品、医药、日化等工业，是重要的工业酶制剂之一。其催化活性仅仅取决于它的蛋白质结构，因而不同来源的脂肪酶具有不同的催化特性和催化活力。

目前，已知大约有2％的微生物产脂肪酶，能产脂肪酶的微生物至少包括65个属，其中细菌28个属、放线菌4个属、酵母菌10个属、其它真菌23个属(hasan，2006)。其中米黑根毛霉脂肪酶因具有较强sn-1,3选择性以及高活力的特性，已被广泛用于结构脂质(structuredlipids)的酶法合成，如sos、opo、dag的合成，处理鱼油富集dha等多不饱和脂肪酸(pedersen，1995)，以及手性医药中间体及某些生物材料的制备(fujikih，2009)等。

天然的米黑根毛霉脂肪酸产量低、成分不稳定，提取困难等存在较大的缺陷，使得其无法工业化生产。因此，针对rml的研究主要集中在其酶学性质、应用范围以及在基因工程菌中的高效表达。有关rml的报道中，诺维信(novo)公司研究最为详实。1977年(moskowitz，1977)，novo公司研究员对天然rml进行了深入研究，结果表明：rml是一种糖蛋白，可广泛水解动物脂肪和植物油，在ph4-9范围内，室温下一定时间内保持稳定，其中ph6.0时最为稳定。1987年，novo的huge-jensen报道天然的米黑根毛霉发酵液中存在rml-a和rml-b两种具有高度免疫原性一致的酶，并阐明二者关系及一级结构。1988年(boel，1988)，novo公司boel和huge-jensen找到了编码rml的cdna序列，并确定rml前体蛋白是由rml、70个氨基酸残基的前体肽链及24个氨基酸残基的信号肽构成，通过酶切割酶原蛋白的met-ser之间的肽键而得到269个氨基酸残基的rml。1989年，huge-jensen将rml的前体蛋白基因插入至米曲霉的载体中，利用α-淀粉酶基因的启动子和糖化酶的终止子进行表达得到胞外分泌的rrml。利用该表达载体得到的rrml中有70％的n-端氨基酸序列与天然酶一致，而另外的30％的重组酶比天然酶少一个丝苏氨酸残基。此外，重组酶的等电点为4.3与rml一致，含糖量为1.2％，免疫性质也与天然酶高度相似。目前novo公司市场上销售的rml也是利用基因工程技术以米曲霉为载体表达的基因改性脂肪酶，液体酶商品名为20000l，固定化酶商品名为lipozymermim。尽管真菌米曲霉不失为一种优良的表达载体，但其自身会分泌各种非目标蛋白，如：novo的lipozymerm酶液中非目的蛋白淀粉酶的含量远高于目的蛋白rml脂肪酶，另外，还有很多其他杂蛋白如：蛋白酶等，导致其应用受到很大限制。目前，尽管novo将rml液体经过再次提纯，获得商品名为388的rml，但因价格昂贵，进一步限制了其在工业中的应用。

技术实现要素：

本发明第一方面提供一种米黑根毛霉脂肪酶的编码序列，所述序列选自：

(1)seqidno:1第229～1035位核苷酸序列所示的序列；和

(2)(1)所述序列的互补序列。

本发明第二方面提供一种多核苷酸序列，所述多核苷酸序列选自：

(1)编码下式i所示的多肽序列的多核苷酸序列：

a-l1-b-l2-rml(式i)

式中，

a可存在或不存在，当存在时，为米黑根毛霉脂肪酶前导肽；

l1在a存在时存在，为蛋白酶kex2和ste13的酶切位点；

b为米黑根毛霉脂肪酶前导肽；

l2为蛋白酶kex2和ste13的酶切位点；和

rml表示米黑根毛霉脂肪酶的成熟肽序列；和

(2)(1)所述序列的互补序列。

在一个或多个实施方案中，所述式i所示的多肽序列存在a和l1。

在一个或多个实施方案中，所述米黑根毛霉脂肪酶前导肽编码序列如seqidno:1第1～210位所示。

在一个或多个实施方案中，所述米黑根毛霉脂肪酶成熟肽编码序列如seqidno:1第229～1035位所示。

在一个或多个实施方案中，所述l1和l2的核苷酸序列各自独立如seqidno:1第211～228位所示，或如seqidno:3第211～234位所示。

在一个或多个实施方案中，所述米黑根毛霉脂肪酶前导肽如seqidno:2第1～70位所示。

在一个或多个实施方案中，所述米黑根毛霉脂肪酶成熟肽如seqidno:2第77～345位所示。

在一个或多个实施方案中，所述l1和l2的氨基酸序列各自独立如seqidno:2第71～76位所示，或如seqidno:4第71～78位所示。

在一个或多个实施方案中，式i所示的多肽序列如seqidno:2或4所示。

在一个或多个实施方案中，所述多核苷酸序列选自：

(i)seqidno:1或3所示的多核苷酸序列；和

(ii)(i)所述多核苷酸序列的互补序列。

本发明第三方面提供一种核酸构建物，该核酸构建物含有本发明所述的多核苷酸序列。

在一个或多个实施方案中，所述核酸构建物含有本发明第一方面所述的多核苷酸序列。

在一个或多个实施方案中，所述核酸构建物含有本发明第二方面所述的多核苷酸序列。

在一个或多个实施方案中，所述核酸构建物是克隆载体或表达载体。

在一个或多个实施方案中，所述表达载体为适用于毕赤酵母中表达的载体，包括但不限于ppic、ppicz、pao、pgap和pgapz。

在一个或多个实施方案中，所述表达载体以pao815质粒为骨架。

本发明第四方面提供一种遗传工程化的宿主细胞，其含有本发明所述的多核苷酸序列或核酸构建物。

在一个或多个实施方案中，所述细胞为酵母。

在一个或多个实施方案中，所述酵母为毕赤酵母。

本发明第五方面提供一种制备米黑根毛霉脂肪酶的方法，该方法包括构建含本发明所述多核苷酸序列的表达载体，将其转入宿主细胞中，以及培养所述宿主细胞以表达所述脂肪酶的步骤。

本发明第五方面提供一种构建能提高米黑根毛霉脂肪酶表达量的表达载体的方法，所述方法包括将在米黑根毛霉脂肪酶前导肽编码序列和成熟肽编码序列之间插入了蛋白酶kex2和ste13的酶切位点的基因序列插入表达载体中的步骤。

在一个或多个实施方案中，所插入的基因序列中，在所述米黑根毛霉脂肪酶前导肽编码序列之前还包括一个拷贝的米黑根毛霉脂肪酶前导肽编码序列及蛋白酶kex2和ste13的酶切位点。

在一个或多个实施方案中，所述基因序列已按照毕赤酵母密码子的偏爱性进行优化。

在一个或多个实施方案中，所述表达载体适于在酵母中表达。

在一个或多个实施方案中，所述表达载体适于在毕赤酵母中表达。

在一个或多个实施方案中，所述表达载体以pao815质粒为骨架。

在一个或多个实施方案中，所述米黑根毛霉脂肪酶前导肽编码序列如seqidno:1第1～210位所示。

在一个或多个实施方案中，所述米黑根毛霉脂肪酶成熟肽编码序列如seqidno:1第229～1035位所示。

在一个或多个实施方案中，所述蛋白酶kex2和ste13的酶切位点的核苷酸序列如seqidno:1第211～228位所示或如seqidno:3第211～234位所示。

在一个或多个实施方案中，所述米黑根毛霉脂肪酶前导肽如seqidno:2第1～70位所示。

在一个或多个实施方案中，所述米黑根毛霉脂肪酶成熟肽如seqidno:2第77～345位所示。

在一个或多个实施方案中，所述蛋白酶kex2和ste13的酶切位点的氨基酸序列如seqidno:2第71～76位所示或如seqidno:4第71～78位所示。

在一个或多个实施方案中，所述基因序列编码如seqidno:2或4所示的氨基酸序列。

在一个或多个实施方案中，所述基因序列选自：

(i)seqidno:1或3所示的多核苷酸序列；和

(ii)(i)所述多核苷酸序列的互补序列。

本发明第六方面提供一种米黑根毛霉脂肪酶制备方法，所述方法包括发酵本发明宿主细胞的步骤。

附图说明

图1：pro/rml和2pro/rml的发酵酶活。

图2：pro/rml-1与2pro/rml-1的sds-page电泳，1号泳道为2pro/rml-1；2号泳道为pro/rml-2。

具体实施方式

本发明将带前导肽的米黑根毛霉基因按照毕赤酵母密码子的偏爱性进行优化，并且在前导肽和成熟肽之间增加蛋白酶kex2和ste13的酶切位点，将该基因克隆至毕赤酵母表达载体如pao815中，得到相应的表达载体，转化毕赤酵母菌株，得到的阳性克隆进行摇瓶发酵，测得其酶活为311u/ml。本发明还将2拷贝的米黑根毛霉脂肪酶基因的前导肽与成熟肽进行连接，并且在两个前导肽之间和第二个前导肽和成熟肽之间增加蛋白酶kex2和ste13的酶切位点，将该基因克隆至毕赤酵母表达载体如paom-plc中，得到相应的表达载体，转化毕赤酵母菌株，得到的阳性克隆进行摇瓶发酵，测得其酶活为464u/ml，rml的产量相比于单前导肽的表达方式提高了50％。

因此，本发明提供一种高效表达米黑根毛霉脂肪酶的方法，以及高效表达米黑根毛霉脂肪酶的毕赤酵母。

本发明中，米黑根毛霉脂肪酶可以是本领域周知的各种来自米黑根毛霉的脂肪酶，包括野生型米黑根毛霉脂肪酶的各种突变体，只要该突变体所述的脂肪酶酶活，具有工业应用价值。通常，本发明所述的米黑根毛霉脂肪酶指的是成熟肽。在某些实施方案中，本发明的方法用于表达seqidno:2第77～345位氨基酸序列所示的米黑根毛霉脂肪酶。

本发明通过在表达米黑根毛霉脂肪酶的载体编码米黑根毛霉脂肪酶前导肽和成熟肽的编码序列之间插入蛋白酶kex2和ste13的酶切位点，从而可实现米黑根毛霉脂肪酶经由所述表达载体在宿主细胞中的高表达。可插入数个(例如1～3个)kex2蛋白酶酶切位点和数个(例如1～3个)stel3蛋白酶酶切位点。在某些实施方案中，蛋白酶kex2和ste13的酶切位点的氨基酸序列可如seqidno:2第71～76位所示。在某些实施方案中，可插入1个kex2和2个stel3酶切位点。在这些实施方案中，示例性的酶切位点的氨基酸序列如seqidno:4第71～78位所示。

以下将对本发明的各方面进行详细描述。

多核苷酸序列

本发明的多核苷酸序列选自：

(1)编码下式i所示的多肽序列的多核苷酸序列：

a-l1-b-l2-rml(式i)

式中，

a可存在或不存在，当存在时，为米黑根毛霉脂肪酶前导肽；

l1在a存在时存在，为蛋白酶kex2和ste13的酶切位点；

b为米黑根毛霉脂肪酶前导肽；

l2为蛋白酶kex2和ste13的酶切位点；和

rml表示米黑根毛霉脂肪酶的成熟肽序列；和

(2)(1)所述序列的互补序列。

本发明中，米黑根毛霉脂肪酶前导肽可以是获自米黑根毛霉的脂肪酶的各种前导肽。在某些实施方案中，所述前导肽的序列如seqidno:2第1～70位所示。

本发明中，蛋白酶kex2和ste13的酶切位点通常指如seqidno:2第71～76位所示的氨基酸序列。在某些实施方案中，可插入1个kex2和2个stel3酶切位点。在这些实施方案中，示例性的酶切位点的氨基酸序列如seqidno:4第71～78位所示。

因此，本发明的l1和l2可各自独立为seqidno:2第71～76位所示的氨基酸序列或seqidno:4第71～78位所示的氨基酸序列。

本发明某些实施方案中，所述核苷酸序列编码的式i所示的多肽序列存在a和l1。

作为具体实施例，式i所示的多肽序列可如seqidno:2或4所示。作为多核苷酸序列的具体实施例，本发明提供seqidno:1或3所示的多核苷酸序列，也包括seqidno:1和3的互补序列。

本申请还包括编码本发明式i多肽的核苷酸序列的简并变异体。如本文所用，“简并变异体”在本发明中是指编码相同的氨基酸序列，但核苷酸序列有差别的核苷酸序列。

在优选的实施方案中，本发明的多核苷酸序列，尤其是米黑根毛霉脂肪酶的成熟肽的编码序列，已按照毕赤酵母密码子的偏爱性进行优化。例如，在某些实施方案中，所述成熟肽的编码序列如seqidno:1第77～345位核苷酸所示。

因此，在某些实施方案中，本发明也提供一种米黑根毛霉脂肪酶的成熟肽的编码序列，选自：

(1)seqidno:1第229～1035位核苷酸序列所示的序列；和

(2)(1)所述序列的互补序列。

本发明的多核苷酸序列通常可以用pcr扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于pcr扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cdna库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cdna库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次pcr扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。

核酸构建物

本发明也涉及包括与本发明所述多核苷酸序列可操作性连接的一个或多个调控序列的核酸构建物。

本文中，“可操作性连接”或类似描述指元件的排列，其中所述成分被排成一定的形状，以便执行它们所需的功能。因而，可操作性连接于编码序列的给定的启动子，在正确的转录因子等存在时，能使该编码序列有效表达。该启动子不需要与该编码序列邻接，只要它起到指导该序列表达的功能即可。因此，例如不参与翻译但转录的序列可存在于启动子序列和编码序列之间，与可转录的内含子一样；并且仍可认为该启动子序列“可操作性连接”于该编码序列。

编码本发明多肽的多核苷酸可以多种方式被操作以保证该多肽的表达。在其插入载体之前该多核苷酸序列的操作可能根据该表达载体而是合乎需要或必需的。利用重组dna方法来改变多核苷酸序列的技术是本领域已知的。

调控序列可以是合适的启动子序列，是用于表达编码本发明式i所示多肽的多核苷酸的宿主细胞所识别的核苷酸序列。启动子序列包含接到多肽表达的转录调控序列。启动子可以是在所选择的宿主细胞中显示转录活性的任何核苷酸序列，包括突变的、截短的和杂合启动子，并且可以从编码与该宿主细胞同源或异源的胞外或胞内多肽的基因获得。

在酵母宿主中，有用的启动子可获得自酿酒酵母烯醇酶(eno-1)、酿酒酵母半乳糖激酶(gal1)、酿酒酵母乙醇脱氢酶、3-磷酸甘油醛脱氢酶、酿酒酵母磷酸丙糖异构酶、酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶的基因、巴斯德毕赤酵母醇氧化酶基因。用于酵母宿主细胞的其它有用启动子由romanosetal.，1992，yeast8:423-488描述。

调控序列也可以是合适的转录终止子序列，由宿主细胞识别以终止转录的序列。终止子序列与编码该多肽的核苷酸序列的3′末端可操作连接。在选择的宿主细胞中有功能的任何终止子都可用于本发明。

用于酵母宿主细胞的优选终止子获得自酿酒酵母烯醇酶、酿酒酵母细胞色素c、酿酒酵母甘油醛-3-磷酸脱氢酶、巴斯德毕赤酵母醇氧化酶基因等。

载体

本发明也涉及包括本发明多核苷酸序列的载体，包括但不限于表达载体和克隆载体。例如，在某些实施方案中，本发明所述的核酸构建物为表达载体或克隆载体。

表达载体中，各种核酸和调控序列可被连接在一起以产生可能包括一个或多个容许在这种位点插入或取代该编码多肽的核苷酸序列的方便限制性位点的重组表达载体。备选地，本发明的核苷酸序列可通过插入核苷酸序列或包括进入适当表达载体的序列的核酸构建物而被表达。在制造表达载体时，编码序列位于载体中以使得该编码序列可操作地连接用于表达适当调控序列。

重组表达载体可以使能够方便地经受重组dna方法并且可导致感兴趣的核苷酸序列表达的任何载体(如质粒或病毒)。载体的选择一般取决于载体与其中被导入该载体的宿主细胞的相容性。该载体可以是线性或闭合的环形质粒。

载体可以是自主复制的载体，即作为染色体外实体存在，其复制不依赖于染色体复制的载体，例如质粒、染色体外元件、微型染色体或人工染色体。载体可包含用于保证自我复制的任何方式。备选地，载体可以是当被导入宿主细胞时，整合到基因组中并且与其已经被整合进入的染色体一起复制的载体。此外，可使用一起包含将被导入宿主细胞基因组的总dna的单个载体或质粒或两个或多个载体或质粒，或转座子。

本发明的载体优选包含一个或多个容许容易选择转化、转染、转导等细胞的可选择标记。可选择的标记是基因，其产物提供对抗生素或病毒的抗性、对重金属的抗性、原养型至营养缺陷型等。

本发明的载体优选包含容许该载体整合进入宿主细胞基因组或该载体在细胞中独立于基因组自主个复制的元件。

一个以上拷贝的本发明的多核苷酸可被插入宿主细胞以增加该基因产物的产量。多核苷酸拷贝数的增加可通过将至少一个附加拷贝的序列整合进入宿主细胞基因组或通过包括可扩增的选择标记基因和该多核苷酸来获得，其中包含扩增拷贝的选择标记基因并且由此包含附加拷贝多核苷酸的细胞可通过在存在适当的选择剂时培养该细胞来筛选。

本发明的表达载体更为优选地选择可用于毕赤酵母中表达的载体。本发明的载体优选商品化的毕赤酵母中使用的载体如ppic、ppicz、pao、pgap或pgapz等一系列的载体。

含有本发明多核苷酸序列的克隆载体可用于复制足够多的目标质粒。因此，本发明的克隆载体带有较强的自我复制元件，如复制起始位点等。通常，本发明的克隆载体不具有表达元件。

宿主细胞

本发明也涉及包括被用于重组生产多肽的本发明多核苷酸的重组宿主细胞。包括本发明多核苷酸的载体被导入宿主细胞以使得该载体如早先说明的作为染色体的组成部分或作为染色体外的自我复制载体来维持。宿主细胞的选择很大程度上取决于编码多肽的基因及其来源。

优选的，适用于本发明的宿主细胞是子囊菌门的细胞，如酵母属(saccharomyces)、毕赤酵母属(pichia)、耶氏酵母属(yarrowia)、假丝酵母属(candida)以及komagataella属等。

在最优选的方面，宿主细胞是巴斯德毕赤酵母(pichiapastoris)、酿酒酵母(saccharomycescerevisiae)、解脂耶氏酵母(yarrowialipolytica)等。在另外最优选方面，宿主细胞是巴斯德毕赤酵母(pichiapastoris)细胞。

生产方法

在获得多肽的编码序列后，可采用如下方法生产本发明多肽，该方法包括：(a)在有助于生产多肽的条件下培养含表达该多肽的表达载体的宿主细胞；以及(b)回收该多肽。

本发明的生产方法中，细胞可以利用本领域已知的方法在适于生产多肽的培养基中培养。例如，细胞可通过在实验室或工业发酵罐中进行的摇瓶培养和小规模或大规模的发酵(包括连续的、分批的、分批补料或固态发酵)，在合适的培养基和容许该多肽表达和/或分离的条件下进行培养。培养发生在利用本领域已知的方法包括碳源和氮源和无机盐的合适培养基中。合适的培养基可获得自商业供应者或可根据公开的组合物来制备。如果该多肽分泌进入培养基，该多肽可从培养基直接回收。如果该多肽不分泌进入培养基，它可从细胞裂解物回收。

在某些实施方案中，本发明的宿主细胞是酵母，优选是毕赤酵母。因此，可按常规的酵母发酵方法进行多肽的生产。例如，作为发酵的一个具体实施例，可在获得本发明的酵母细胞后，先在液体ypd中活化该酵母细胞，然后再接种于bmgy中，30℃、220rpm过夜培养后，转接至bmmy培养基中，初始od600为6，初始用2％的甲醇进行诱导，24h和32h后各补加1％，48h和56h后各补加1％。

本发明所描述的多肽可利用本领域已知的方法来回收。例如，多肽可通过常规方法，包括但不限于离心、过滤、超滤、萃取、层析、喷雾干燥、冷冻干燥、蒸发或沉淀等从培养基回收。

本发明的多肽可通过本领域已知的多种方法来纯化，包括但不限于色谱法(如离子交换、亲和性、疏水性、色谱聚焦、分子排阻)，电泳法(例如等电聚焦)、差异溶解度(如盐析沉淀)、sds-page或萃取法以获得基本上纯的多肽。

下文将以具体实施例的方式阐述本发明。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如sambrook等，《分子克隆：实验室指南》(美国纽约州：冷泉港实验室出版社(coldspringharborlaboratorypress)，1989)所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件进行。对于试剂的用法和用量，除非另有说明，否则按照常规的用法和用量使用。

实验材料

1.实验菌株和质粒

菌株：毕赤酵母gs115(invitrogen，货号c175-00)，大肠杆菌dh5a(takara：catalog#.d9057a)。

质粒：pao815质粒(invitrogen，货号v180-20)。

2.培养基和溶液

除非另有说明，本申请中所用的化学试剂均购自生工(上海)生物工程有限公司。

lb液体培养基：0.5％酵母提取物，1％胰化蛋白胨，1％nacl，ph7.0。

lb固体培养基：在lb液体培养基中加入琼脂浓度1.5％。

ypd液体培养基：1％酵母提取物，2％蛋白胨，2％葡萄糖。

ypd固体培养基：在lb液体培养基中加入琼脂浓度2％。

mgys固体培养基：1.34％酵母氮源碱(ynb)含硫酸铵不含氨基酸，1％甘油，1m山梨醇，4×10^-5％d-生物素，2％琼脂。

bmmy-橄榄油筛选培养基：a组分：1％酵母提取物，2％蛋白胨，1.34％酵母氮源碱(ynb)含硫酸铵不含氨基酸，4×10^-5％d-生物素，0.5％甲醇(灭菌后加入)，0.1m柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液ph6.6，2％琼脂。b组分：组分b橄榄油底物溶液：量取4％pva溶液150ml，加橄榄油50ml，用高速匀浆机8000rpm乳化3min，暂停1min后再乳化3min，制备底物溶液。灭菌的100mla组分与12mlb组分混合，加入1ml0.1％罗丹明b。

bmgy液体培养基：1％酵母提取物，2％蛋白胨，1.34％酵母氮源碱(ynb)含硫酸铵不含氨基酸，1％甘油，4×10^-5％d-生物素，0.1m柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液ph6.6。

bmmy液体培养基：1％酵母提取物，2％蛋白胨，1.34％酵母氮源碱(ynb)含硫酸铵不含氨基酸，0.5％甲醇(灭菌后加入)，4×10^-5％d-生物素(灭菌后加入)，0.1m柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液ph6.6。

改良型bradford法蛋白浓度测定试剂盒(购自上海生工生物工程有限公司)

限制性内切酶hindiii，ecori，avrii(购自纽英伦生物技术(北京)有限公司)

pcr酶：takarataq，primehsdnapolymerase(购自宝生物工程(大连)有限公司)

t4dna连接酶(购自富酶泰斯有限公司)

实施例1：带前导肽及蛋白酶切点的米黑根毛霉脂肪酶基因毕赤酵母表达菌株构建

根据米黑根毛霉脂肪酶基因的氨基酸序列(genbank：a02536.1)以及毕赤酵母密码子偏爱性，设计得到pro/rml的dna序列，并且在前导肽(其编码序列如seqidno:1第1－210位碱基所示)和成熟肽(其编码序列如seqidno:1第229－1035位碱基所示)之间增加了蛋白酶kex2和ste13的酶切位点(其编码序列如seqidno:1第211－228位碱基所示)。该dna序列如sqeidno:1所示，编码的氨基酸序列如seqidno:2所示。

将sqeidno:1序列提供给上海生工生物有限公司，进行全基因合成并直接克隆至pao815表达载体中，得到含sqeidno:1序列的毕赤酵母表达载体pao-pro/rml。

将pao-pro/rml用sali线性化，利用liac法制备毕赤酵母gs115菌株的感受态细胞，再通过电转化将线性化的pao-pro/rml片段转化gs115感受态细胞，转化物涂布于mgys平板上，30℃培养3天，将大量平板上的单克隆挑于bmmy-橄榄油筛选平板上，从中挑取活力表现最好的阳性克隆，命名为pro/rml-1。

同时将如sqeidno:5所示的米黑根毛霉脂肪酶基因原始基因序列提供给上海生工生物有限公司，进行全基因合成并直接克隆至pao815表达载体中。得到含sqeidno:5序列的毕赤酵母表达载体pao-pro/nop-rml(编码的pro/nop-rml的氨基酸序列如seqidno:6所示)。将pao-pro/nop-rml用sali线性化，利用liac法制备毕赤酵母gs115菌株的感受态细胞，再通过电转化将线性化的pao-pro/nop-rml片段转化gs115感受态细胞，转化物涂布于mgys平板上，30℃培养3天，将大量平板上的单克隆挑于bmmy-橄榄油筛选平板上，从中挑取活力表现最好的阳性克隆，命名为pro/nop-rml-1。

实施例2：带2拷贝前导肽及蛋白酶切点的米黑根毛霉脂肪酶基因毕赤酵母表达菌株构建

取米黑根毛霉脂肪酶基因的氨基酸序列(genbank：a02536.1)的前导肽序列，根据毕赤酵母密码子偏爱性，设计得到两拷贝串联的米黑根毛霉脂肪酶基因前导肽序列的dna序列2rmlpro，在两个前导肽的末端都增加了蛋白酶kex2和2个ste13的酶切位点，如sqeidno:3所示，编码的氨基酸序列如seqidno:4所示。

将sqeidno:3序列提供上海生工生物有限公司进行全基因合成，得到puc57-2pro载体。

将pao-prorml用hindiii和ecori将rml的成熟肽序列切下，与用hindiii和ecori酶切的pmao-plc载体(构建方法详见cn201510946696.1实施例1中描述。)连接，得到paomu-rml载体。用avrii和hindiii将puc57-2pro载体上的两拷贝前导肽2pro序列切下，与用avrii和hindiii酶切的pmao-rml载体连接，得到pmao-2pro/rml载体。将paomu-2pro/rml用sali线性化，利用liac法制备毕赤酵母gs115菌株的感受态细胞，再通过电转化将线性化的pmao-2pro/rml片段转化gs115感受态细胞，转化物涂布于mgys平板上，30℃培养3天，将大量平板上的单克隆挑于bmmy-橄榄油筛选平板上，从中挑取活力表现最好的阳性克隆，命名为2pro/rml-1。

实施例3：米黑根毛霉脂肪酶基因毕赤酵母表达菌株摇瓶发酵

取pro/nop-rml-1，pro/rml-1和2pro/rml-1菌株，先在液体ypd中活化，接于bmgy中，30℃，220rpm过夜培养，再转接至bmmy培养基中，初始od600为6，初始用2％的甲醇进行诱导，24h和32h后各补加1％，48h和56h后各补加1％，72h取样，用橄榄油作为底物，进行脂肪酶活力检测。

发酵酶活如图1所示。图1中，pro/nop-rml-1的发酵酶活为229±11u/ml，pro/rml-1的发酵酶活为310±35u/ml，2pro/rml-1的发酵酶活为464±4u/ml。

pro/rml-1和2pro/rml-1发酵液的蛋白电泳如图2所示，箭头所指为rml目的蛋白。图2显示，2pro/rml-1的目的蛋白量明显高于pro/rml-1，提高了约50％。

序列表

<110>丰益（上海）生物技术研发中心有限公司

<120>高效表达米黑根毛霉脂肪酶的方法

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<160>6

<170>patentinversion3.3

<210>1

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<212>dna

<213>人工序列

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<212>prt

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354045

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505560

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100105110

thrtrpaspcysilehiscysaspalathrgluaspleulysileile

115120125

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130135140

glyaspserglulysthriletyrilevalpheargglyserserser

145150155160

ileargasntrpilealaaspleuthrphevalprovalsertyrpro

165170175

provalserglythrlysvalhislysglypheleuaspsertyrgly

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tyrprosertyrlysvalalavalthrglyhisserleuglyglyala

210215220

thralaleuleucysalaleuglyleutyrglnargglugluglyleu

225230235240

serserserasnleupheleutyrthrglnglyglnproargvalgly

245250255

aspproalaphealaasntyrvalvalserthrglyileprotyrarg

260265270

argthrvalasngluargaspilevalprohisleuproproalaala

275280285

pheglypheleuhisalaglygluglutyrtrpilethraspasnser

290295300

progluthrvalglnvalcysthrseraspleugluthrseraspcys

305310315320

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