用于增强在痘病毒中的表达的启动子的制作方法

文档序号：14185901阅读：300来源：国知局

发明领域

本发明涉及蛋白质在痘病毒，尤其禽痘病毒，诸如鸡痘病毒和金丝雀痘病毒中的表达的一种或多种新颖启动子。本发明进一步涉及包含所述启动子的多核苷酸，特别是包含所述启动子和所要表达的核酸的多核苷酸；包含所述物质的载体；包含以上构建体的宿主细胞；以及包含以上各项中的任一种的组合物。另外，本发明涉及可操作地连接至一种或多种启动子的一种或多种新颖多肽。更特定而言，一种或多种新颖多肽与短尾畸形蛋白有关。

发明背景

重组痘病毒已用作用于感染性有机体并且最近用于肿瘤的疫苗。mastrangelo等人jclininvest.2000；105(8):1031-1034。这些痘病毒组中的两种，禽痘病毒和正痘病毒，已显示有效对抗肿瘤并且已与潜在癌症治疗相联系。id.

一种示例性禽痘病毒种类，鸡痘，已显示为用于人类施用的安全媒介物，因为鸡痘病毒进入哺乳动物细胞并且表达蛋白质，但复制失败。skinner等人expertrevvaccines.2005feb；4(1):63-76。另外，在针对癌症、疟疾、结核病、艾滋病以及ebola的疫苗的许多临床试验中正在评估鸡痘病毒作为用于表达的媒介物的用途。id.

已使用重组痘病毒(诸如鸡痘)来表达广泛范围的插入基因，包括若干传染性疾病和肿瘤相关基因，诸如p97、her-2/neu、p53以及eta(paoletti等人,1993)。最近研究的一种示例性肿瘤抗原为短尾畸形(brachyury)(也称为“t”)。

在小鼠中短尾畸形被识别为主导短尾突变体，所述主导短尾突变体也是隐性致死的；纯合t/t胚胎在妊娠中期归因于后侧中胚层形成失败而死亡(chesley,j.exp.zool.,70:429-459,1935)。已克隆鼠短尾畸形基因(herrmann等人,nature(lond.),343:617-622,1990)以及诸如人类等其他物种中的同源物。通过rt-pcr检测到小鼠短尾畸形的人类同系物在14-15周妊娠的人类流产胎的脊索剩余物、髓核中的表达(edwards等人,genomeres.,6:226-233,1996)。

brachyury短尾畸形总体上被证明是一种有价值的用于识别中胚层分化的标记物(herrmann等人,trendsgenet.,10:280-286,1994)。举例来说，除了在胚胎本身中表达，已报道短尾畸形在体外沿中胚层谱系分化的某些鼠类ec和es细胞系的分化期间被活化(参见例如bain等人,biochem.biophys.res.commun.,223:691-694,1996)。在人类中，已证实短尾畸形在畸胎癌瘤(gokhele等人,cellgrowthanddifferentiation11:157-62,2000)、脊索瘤(vujovic等人,j.pathol.2:157-65,2006)以及成血管细胞瘤(glasker等人,cancerres.66:4167-4172,2006)中表达。

最近，已描述表达短尾畸形的痘病毒可有效作为针对肿瘤的活性免疫治疗剂。(参见wo2014/043535)。

对改善传染性疾病和癌症治疗，包括活性免疫疗法和疫苗明显存在基本未满足的医学需要。基于以上内容，本领域中对改善活性免疫疗法中所用的如短尾畸形等抗原的表达存在需要。本发明满足了此需要。

发明概要

本发明提供与作为痘病毒的一部分而合并的编码序列和抗原的表达增强相关的一种或多种启动子、核酸、表达盒、重组肽以及重组痘病毒。

在本发明的一个方面中，存在一种表达盒，所述表达盒包含：

a.启动子，所述启动子包含与seqidno:1-10和77中的任一个具有至少70％同一性的核酸序列；以及

b.编码序列，所述编码序列可操作地连接至所述启动子；

其中所述编码序列的表达受所述启动子控制。

在本发明的其他方面中，可合并表达盒作为诸如病毒或质粒等载体的一部分，用于增强编码序列在其中的表达。优选地，表达盒为诸如但不限于正痘病毒和禽痘病毒的痘病毒的一部分。更优选地，表达盒为禽痘病毒，诸如鸡痘病毒。在其他方面中，表达盒不为天然存在于痘病毒的基因组中的表达盒。

在其他方面中，存在包含以下各项或由其组成的一种或多种启动子：a)选自由以下组成的组的核酸序列：seqidno:1-10、b)seqidno:1-10和77中的任一个的子序列，或c)seqidno:1-10和77中的任一个的衍生序列，其中所述衍生序列具有一个或多个取代、缺失和/或插入，并且其中所述衍生序列具有作为痘病毒启动子的活性和/或在痘病毒感染细胞中具活性。

在其他方面中，本发明包括一种或多种编码选自由以下组成的组的一种或多种新颖短尾畸形蛋白的核酸序列：seqidno:18-19、22-23、26-27、30-31、34-35、38-39、42-43、46-47、50-51、54-55、58-59、62-63、66-67、70以及71。在其他方面中，本发明包括一种或多种选自由以下组成的组的新颖核酸序列：16-17、20-21、24-25、28-29、32-33、36-37、40-41、44-45、48-49、52-53、56-57、60-61、64-65、68以及69。

在其他方面中，本发明包括一种表达盒，所述表达盒包含：

a.启动子，所述启动子包含与seqidno:1-10和77中的任一个具有至少70％同一性的核酸序列；以及

b.编码序列，所述编码序列可操作地连接至所述启动子，其中所述编码序列包括i)编码选自由以下组成的组的短尾畸形蛋白的核酸：seqidno:11、13、18-19、22-23、26-27、30-31、34-35、38-39、42-43、46-47、50-51、54-55、58-59、62-63、66-67、70以及71；或ii)包含与选自由以下组成的组的核酸中的任一个具有至少70％同一性的核酸或由其组成：seqidno:12、14-17、20-21、24-25、28-29、32-33、36-37、40-41、44-45、48-49、52-53、56-57、60-61、64-65、68以及69；

其中所述编码序列的表达受所述启动子控制。

在下面的描述中将部分阐述本发明的额外目标和优点，并且其由所述描述部分将显而易见或可通过实践本发明而被了解。借助于随附权利要求书中特别指出的元素和组合将实现和达到本发明的目标和优点。

应了解，前述总体描述与以下详细描述仅为示例性和说明性的，并且不限制如所要求的本发明。

附图简述

图1说明短尾畸形蛋白在感染非重组病毒fpv-wt或重组病毒fpv-mbn343a、fpv-mbn344a或fpv-mbn345a的人类树突细胞(dc)中的表达。使用如实施例1中详细描述的兔单克隆抗短尾畸形抗体进行西方墨点分析(westernblotanalysis)。

图2说明短尾畸形蛋白在感染非重组病毒mva-wt或fpv-wt或重组病毒mva-短尾畸形-tricom、fpv-mbn249b、fpv-mbn281a克隆32、fpv-mbn281a克隆35、fpv-mbn343a、fpv-mbn344a、fpv-mbn345a、fpv-mbn354a或fpv-mbn355a的人类树突细胞(dc)中的表达。使用如实施例2中详细描述的兔单克隆抗短尾畸形抗体进行西方墨点分析。

图3展示由如实施例2中详细描述的感染非重组病毒mva-wt或fpv-wt或重组病毒mva-短尾畸形-tricom、fpv-mbn249b、fpv-mbn281a克隆32、fpv-mbn281a克隆35、fpv-mbn343a、fpv-mbn344a、fpv-mbn345a、fpv-mbn354a或fpv-mbn355a的人类树突细胞(dc)的西方墨点分析来看，短尾畸形蛋白与gapdh相比的相对表达。

图4说明如实施例3中所描述使用对每种蛋白质具特异性的荧光标记抗体通过流式细胞术评估的短尾畸形和tricom蛋白在感染重组病毒mva-短尾畸形-tricom、fpv-mbn249b、fpv-mbn343a或fpv-mbn345a的cmmt细胞(恒河猴乳房肿瘤细胞系)中的表达。

图5展示如实施例3中所描述通过流式细胞术评估的短尾畸形蛋白在感染重组病毒mva-短尾畸形-tricom、fpv-mbn249b、fpv-mbn343a或fpv-mbn345a的cmmt细胞(恒河猴乳房肿瘤细胞系)中的中值表达水平。

图6展示如实施例4中所描述通过流式细胞术评估的短尾畸形和tricom蛋白在感染重组病毒fpv-mbn345b的cmmt细胞(恒河猴乳房肿瘤细胞系)中的表达。

详细说明

本发明是基于令人惊讶地确定了如seqidno:1-10和77中所列的启动子序列使肿瘤抗原短尾畸形的表达增强。图1-6中示出并且本文中更详细地描述了当使用本发明的启动子时短尾畸形抗原的表达增强。当使用启动子和短尾畸形抗原作为重组痘病毒的一部分时表达进一步增强。

在至少一个方面中，由于使用已知痘苗启动子(诸如prs和牛痘病毒40k(vv-40k))的短尾畸形蛋白的不充分表达水平形成了本公开的各种实施方案。在设法提高短尾畸形表达水平时，本发明人分析了各种痘苗启动子和相关蛋白质(例如vv-40k、i3等)以及fpv中的任何可能的同系物。本发明人认识到先前发现了一些fpv同源序列。参见例如zantinge,jgenvirol.1996年4月；77(pt4):603-14及在ncbi参考序列：np_039051.1处的基因fpv088,afonso,c.l等人,j.virol.74(8),3815-3831(2000)。

在起初试图增强短尾畸形表达时，本发明人用短尾畸形构建在ncbi参考序列：np_039051.1处的基因fpv088的可能的启动子区并且进行测试，产生不希望的结果(参见例如图1和2的mbn344a处)启动子。本发明人以添加来自基因fpv088的orf的核苷酸形成了后续启动子，这类似地产生不希望的结果。(参见例如图1和2的mbn354a处)。本发明人使用来自基因fpv088的orf的额外核苷酸形成了其他构建体，其如本文中所描述和说明，增强肿瘤抗原短尾畸形的表达。

因此，在各种实施方案中，本发明是关于一种或多种核酸序列、一种或多种包含所述核酸序列的启动子、一种或多种包含所述核酸的表达盒、一种或多种肽和/或肽序列，用于增强编码序列和/或核酸在诸如但不限于质粒、重组病毒等的表达载体中的表达。在其他实施方案中，本发明是关于一种或多种重组痘病毒，所述一种或多种重组痘病毒包含本文所描述的核酸序列、启动子、表达盒和/或肽和/或肽序列中的一种或多种。

另外，在本发明的各种实施方案中，存在一种或多种编码短尾畸形多肽的核酸序列。在一个实施方案中，一种或多种核酸编码选自由以下组成的组的短尾畸形抗原：seqidno:11、13、18-19、22-23、26-27、30-31、34-35、38-39、42-43、46-47、50-51、54-55、58-59、62-63、66-67、70以及71。根据本发明的编码短尾畸形多肽的核苷酸序列选自由以下组成的组：seqidno:12、14-17、20-21、24-25、28-29、32-33、36-37、40-41、44-45、48-49、52-53、56-57、60-61、64-65、68以及69。

定义

必须指出，除非上下文另外明确指出，否则如本文所用，单数形式“一个(或一种)(a/an)”和“所述”包括复数参考物。因此，举例来说，提到“一个表位”包括一个或多个表位，并且提到“所述方法”包括提到本领域一般技术人员已知可改进或替换本文所描述的方法的等效步骤和方法。

除非另外指出，否则位于一系列元素前面的术语“至少”应理解为涉及所述系列中的每一个元素。本领域技术人员将认识到或能够仅仅使用常规实验确定本文所描述的本发明特定实施方案的许多等效物。此类等效物意在由本发明涵盖。

在本说明书和接下来的权利要求书通篇中，除非上下文另外要求，否则词语“包含(comprise)”和诸如“包含(comprises)”和“包含着(comprising)”等变化形式应理解为暗示包括所陈述的整体或步骤或整体或步骤的组，但不排除任何其他整体或步骤或整体或步骤的组。当用于本文中时，术语“包含”可用术语“含有”或“包括”取代或有时当用于本文中时用术语“具有”取代。上述术语(包含、含有、包括、具有)中的任一种虽然较不优选，但无论何时在本发明的一个方面或实施方案的情形中用于本文中时都可用术语“由……组成”取代。当在本文中使用时，“由……组成”排除要求元素中未规定的任何元素、步骤或成分。当在本文中使用时，“基本上由……组成”不排除不实质上影响权利要求的基本和新颖特征的材料或步骤。

如本文所用，多个所叙述元素之间的连接术语“和/或”被理解为涵盖个别与组合选择两者。举例来说，在两个元素通过“和/或”连接的情况下，第一选择指第一元素在不存在第二元素情况下的适用性。第二选择指第二元素在不存在第一元素情况下的适用性。第三选择指第一和第二元素一起的适用性。这些选择中的任一种应理解为属于所述含义内，并且因此满足如本文所用的术语“和/或”的要求。超过一种选择的同时适用性也应被理解为在所述含义内，并且因此满足术语“和/或”的要求。

如本文所用，术语“启动子”表示核酸(通常为dna)的定位于所要表达的核酸的序列上游的调控区，其含有特定dna序列元件，所述特定dna序列元件例如由蛋白质转录因子以及负责由所促进的基因的编码区合成rna的聚合酶识别和结合。因为启动子典型地与所讨论的基因直接相邻，所以启动子中的位置是相对于针对特定基因开始dna转录的转录起始位点来指定(即上游位置为从-1向后计数的负数，例如-100为上游的第100位的碱基对)。因此，启动子序列可包含直至位置-1的核苷酸。然而，从位置+1起的核苷酸不为启动子的一部分，即在此方面必须注意翻译起始密码子(atg或aug)不为启动子的一部分。因此，seqidno:1-10和77为包含本发明的启动子的多核苷酸。

如本文所用，当相对于编码序列、核酸、蛋白质和/或抗原的表达水平使用时，术语“增强(enhancing/enhanced)”係指编码序列、核酸、蛋白质和/或抗原当与本发明的一种或多种启动子、表达盒、核酸、蛋白质和/或载体相关和/或作为其一部分时的表达相对于编码序列、核酸、蛋白质和/或抗原当与本领域中已知的一种或多种启动子(诸如prs或vv-40k)相关和/或作为其一部分时的表达水平有所增加。

如本文所用，如通过产生的重组蛋白的量所测量，具有与seqidno:1-10以及77中所列的核苷酸序列“本质上相同的表达特征”的核苷酸序列将展现出seqidno:1-10以及77的至少70％、优选至少80％、甚至更优选至少90％的启动子活性。所讨论的启动子序列是否与seqidno:1-10和77中的任一个具有“本质上相同的表达特征”可由本领域一般技术人员使用本申请的实施例1-4中所阐述的方法轻易地确定。根据本发明的启动子优选具有作为痘病毒启动子(优选为禽痘病毒)的活性或在痘病毒感染细胞(优选为禽痘病毒感染细胞)中作为启动子的活性。禽痘病毒优选为鸡痘病毒。“作为痘病毒启动子的活性”意味着所述启动子能够引导与其可操作地连接的基因在细胞感染所述病毒之后在痘病毒中的表达。所述细胞优选为允许痘病毒的晚期和/或早期和/或早期/晚期表达的细胞。“在痘病毒感染细胞中的启动子活性”还包括启动子不为痘病毒基因组的一部分，例如质粒或线性多核苷酸或非痘病毒病毒基因组的一部分的情况；在此类情况下，如果包含启动子的细胞还包含痘病毒基因组，例如如果细胞感染了痘病毒，那么根据本发明的启动子具活性。在这些情况下，病毒rna聚合酶识别根据本发明的启动子，并且活化连接至所述启动子的基因/编码序列的表达。

如本文所用，术语“衍生自seqidno:1-10和77中所列的核酸”意味着将seqidno:1-10和77的核苷酸序列作为实现所规定的核苷酸修饰(例如至少一个核苷酸添加、缺失取代和/或倒位)的基础。术语“衍生”包括例如通过已知方法(例如易错pcr)实际上对对应于seqidno:1-10和77的物理序列进行修饰的可能性。术语“衍生”另外包括经由计算机模拟对seqidno:1-10和77的序列进行修饰并且然后合成因此确定的序列作为物理核酸的可能性。举例来说，术语“衍生”涵盖使用任何已知计算机程序就例如杂交稳定性对核酸序列进行分析的可能性以及在修饰seqidno:1-10和77的起始序列时的任何二级核酸结构的可能性。优选地，已相较于seqidno:1-10和77的核酸添加、缺失、取代和/或倒转不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个核苷酸。此外，至少一个核苷酸的添加、插入或缺失不会引起核酸的起始密码子被表达。

如本文所用，术语“表达(expressed/express/expression)”等表示相关序列的单独转录以及转录与翻译两者。因此，在提到以dna形式存在的核酸的表达时，由此表达产生的产物可为rna(由所要表达的序列的单独转录产生)或多肽序列(由所要表达的序列的转录与翻译两者产生)。因此，术语“表达”还包括rna与多肽产物两者由所述表达产生并且在相同共享环境中保持在一起的可能性。举例来说，当mrna在其翻译至多肽产品中之后仍然存在时就是这种情况。

如本文所用，术语“表达盒”定义为典型地用于克隆和/或转化的载体或重组病毒的一部分。表达盒典型地包含a)一个或多个编码序列(例如开放阅读框(orf)、基因、编码蛋白质和/或抗原的核酸)，以及b)控制一个或多个编码序列的表达的序列。另外，表达盒可包含3'未翻译区，所述3'未翻译区在真核生物中通常含有多腺苷酸化位点。

术语“重组”意味着半合成或合成来源的多核苷酸或多肽在自然界中不存在或以在自然界中不存在的排列连接至另一多核苷酸。

本发明的一个方面包括具有与seqidno:1-10和77具有至少70％、优选75％、80％、85％、90％或95％同一性以及与seqidno:1-10和77具有本质上相同的表达特征的核酸的启动子。

相对于本文所描述的核酸序列的“序列同源性或同一性百分比(％)”定义为在比对序列并且必要时引入空隙以实现最大序列同一性百分比之后，在候选序列中与参考序列(即衍生出它的核酸序列)中的核苷酸相同的核苷酸的百分比，而不将任何保守取代视为序列同一性的一部分。可以本领域技术内的各种方式，例如使用公共可获得的计算机软件，诸如blast、align或megalign(dnastar)软件来实现比对，以达到测定核苷酸序列同一性或同源性百分比的目的。本领域技术人员可确定用于测量比对的适当参数，包括在所比较的序列的整个长度上实现最大比对所需的任何算法。

举例来说，通过smith和waterman,(1981),advancesinappliedmathematics2:482-489的局部同源算法来提供核酸序列的适当比对。可通过使用由dayhoff,atlasofproteinsequencesandstructure,m.o.dayhoff编,5增刊3:353-358,nationalbiomedicalresearchfoundation,washington,d.c.,usa研发并且由gribskov(1986),nucl.acidsres.14(6):6745-6763校正的打分矩阵对氨基酸序列应用此算法。geneticscomputergroup(madison,wis.)在“bestfit”实用程序中提供了此算法用于测定序列的同一性百分比的示例性实现方式。wisconsinsequenceanalysispackageprogrammanual,版本8(1995)(可购自geneticscomputergroup,madison,wis.)中描述了此方法的缺省参数。在本发明的背景下建立同一性百分比的优选方法为使用由爱丁堡大学(universityofedinburgh)拥有版权、由johnf.collins和shanes.sturrok研发并且由intelligenetics,inc.(mountainview,calif)分销的mpsrch程序包。由此程序包套装可采用史密斯-沃特曼算法(smith-watermanalgorithm)，其中在记分表中使用缺省参数(例如空隙开口罚分为12、空隙延伸罚分为一并且空隙为六)。产生“匹配”值的数据反映“序列同一性”。其他适合用于计算序列之间的同一性或相似性百分比的程序通常为本领域中已知的，例如另一比对程序为在缺省参数情况下使用的blast。举例来说，可使用blastn和blastp，使用以下缺省参数：遗传密码＝标准；过滤器＝无；链＝两者；截止值＝60；预期＝10；矩阵＝blosum62；描述＝50个序列；排序依据＝高得分；数据库＝非重复，genbank+embl+ddbj+pdb+genbankcds翻译+swiss蛋白质+spupdate+pir。这些程序的细节可见于以下网址：http://http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/。

启动子和核酸序列

在一个实施方案中，本公开包括选自由以下组成的组的核酸序列：seqidno:1-10和77。

在另一实施方案中，本公开包括一种核酸序列，所述核酸序列与选自由以下组成的组的核酸具有至少70％同一性：seqidno:1-10和77，并且与选自由以下组成的组的核酸序列具有本质上相同的表达特征：seqidno:1-10和77。在其他实施方案中，存在一种核酸序列，所述核酸序列与选自由以下组成的组的核酸具有至少75％、80％、85％、90％或95％同一性：seqidno:1-10和77，并且与选自由以下组成的组的核酸序列具有本质上相同的表达特征：seqidno:1-10和77。

在另一实施方案中，存在一种核酸，所述核酸具有衍生自seqidno:1-10和77中所列的核酸的核苷酸序列，与seqidno:1-10和77的核苷酸序列相比包含至少一个核苷酸添加、缺失、取代和/或倒位并且与seqidno:1-10和77的核酸具有本质上相同的表达特征。

在另一实施方案中，存在一种核酸，所述核酸具有能够杂交至选自由以下组成的组的核酸序列的核苷酸序列：seqidno:1-10和77，并且与选自由以下组成的组的核酸序列具有本质上相同的表达特征：seqidno:1-10和77。

在本发明的一个方面中，存在一种用于增强编码和/或基因序列的表达的启动子，所述启动子选自由以下组成的组：

a)选自由以下组成的组的核酸序列：seqidno:1-10和77或其子序列；

b)具有衍生自(a)中所阐述的核酸的核苷酸序列、与(a)的核苷酸序列相比包含至少一个核苷酸添加、缺失、取代和/或倒位并且与(a)的核酸具有本质上相同的表达特征的核酸；

c)与(a)的核酸具有至少70％同一性并且与(a)的核酸具有本质上相同的表达特征的核酸序列；以及

d)能够杂交至(a)、(b)或(c)的核酸序列并且与(a)的核酸具有本质上相同的表达特征的核酸。

e)包含seqidno:3、4、5、6、7、8或9的核酸序列，其中所述核酸序列包括多达245个核苷酸。

本发明的另一方面涉及能够杂交至(a)、(b)或(c)的核酸序列并且与(a)的核酸具有本质上相同的表达特征的核酸。术语“能够杂交”意味在使(a)、(b)或(c)的核酸的任何部分能够杂交至另一dna序列以允许检测和分离与(a)的核酸具有本质上相同的表达特征的任何dna序列的条件下的杂交。在严格条件下进行杂交；条件越严格，越可能要迫使部分互补序列分开，即较高严格性降低杂交概率。在实践中，术语“严格条件”意味使用高温(例如65℃)和/或低盐浓度(例如0.1×ssc)的杂交条件。增加温度和/或降低盐浓度使严格性增加。在严格条件下，只有在序列之间存在至少70％或优选至少75、80、85、90或95％同一性时才会发生杂交。可如ausubel等人(2002)shortprotocolsinmolecularbiology第1卷第5版canada中所阐述进行杂交。

优选地，本发明的启动子和/或核酸的长度长达并且包括245或242个核苷酸。另外，本发明的启动子和/或核酸的长度长达并且包括232或215个核苷酸。更优选地，本发明的启动子的长度长达并且包括212、200或长度长达并且包括195个核苷酸，或长度长达并且包括183，或长度长达并且包括170或167个核苷酸。在一个实施方案中，如上文所阐述的(b)、(c)或(d)的核酸包含约50-250个核苷酸、约60-220个核苷酸、约70-200个核苷酸、约80-190个核苷酸或约90-180个核苷酸。

或者，使用这些启动子的衍生物在本发明范围内，所述衍生物可为如seqidno:1-10和77中的任一个中所定义的序列的子序列。术语“根据seqidno:1-10和77中的任一个的序列的子序列”是指seqidno:1至10和77中的任一个的较短片段，所述较短片段仍具有作为启动子，特别是在正痘病毒(诸如fpv)中作为启动子的活性，或在正痘病毒(诸如fpv)感染细胞中具活性。

在各种实施方案中，seqidno:9的示例性子序列是选自seqidno:2-8。在一个方面中，seqidno:4或5为seqidno:9的优选子序列。在其他方面中，seqidno:8的子序列包括seqidno:2-7，seqidno:7的子序列包括seqidno:2-6，seqidno:6的子序列包括seqidno:2-5，seqidno:5的子序列包括seqidno:2-4，seqidno:6的子序列包括seqidno:2-5，seqidno:5的子序列包括seqidno:2-4，seqidno:4的子序列包括seqidno:2-3，并且seqidno:3的子序列包括seqidno:2。

包含seqidno:1-10和77或其子序列中的任一个的核苷酸序列或由其组成的启动子衍生物还可为相对于seqidno:1-10和77的序列中的任一个具有一个或多个核苷酸取代、缺失和/或插入的序列。根据本发明的衍生物仍具有作为启动子，特别是在正痘病毒和/或禽痘病毒病毒感染细胞中作为正痘病毒和/或禽痘病毒启动子，更优选在禽痘病毒感染细胞中作为禽痘病毒启动子的活性。在根据本发明的衍生物中，可将缺失、取代以及插入组合在一个序列中。

优选地，如本文所描述，当与seqidno:1-10和77的序列或其子序列中的任一个相比时，衍生物具有至少40％、更优选至少60％、甚至更优选至少80％、最优选至少90％的同源性。

短尾畸形蛋白

在本发明的若干方面中，本发明人确定作为合成本文所描述的各种启动子的结果，本发明人形成了一种或多种重组短尾畸形蛋白。特别地，一种或多种重组短尾畸形蛋白为由本发明的启动子中的一种或多种与短尾畸形蛋白组合产生的融合蛋白。预期重组短尾畸形蛋白中的一种或多种可适合作为疫苗、药物或其他治疗剂组合物的一部分。

因此，在各个方面中，本发明包括一种或多种合成和新颖重组短尾畸形蛋白和/或编码重组短尾畸形蛋白的合成和新颖核酸。

在一个实施方案中，存在一种或多种与编码短尾畸形蛋白的核酸具有至少70％同一性的核酸序列，其中所述短尾畸形蛋白选自由以下组成的组：seqidno:18-19、22-23、26-27、30-31、34-35、38-39、42-43、46-47、50-51、54-55、58-59、62-63、66-67、70以及71。在其他实施方案中，存在一种或多种与编码短尾畸形蛋白的核酸具有至少75％、80％、85％、90％或95％同一性的核酸，其中所述短尾畸形蛋白选自由以下组成的组：seqidno:18-19、22-23、26-27、30-31、34-35、38-39、42-43、46-47、50-51、54-55、58-59、62-63、66-67、70以及71。

在本发明的各种其他实施方案中，存在一种或多种选自由以下组成的组的短尾畸形蛋白：seqidno:18-19、22-23、26-27、30-31、34-35、38-39、42-43、46-47、50-51、54-55、58-59、62-63、66-67、70以及71。在其他实施方案中，存在一种或多种与选自由以下组成的组的肽具有至少70％同一性的短尾畸形蛋白：seqidno:18-19、22-23、26-27、30-31、34-35、38-39、42-43、46-47、50-51、54-55、58-59、62-63、66-67、70以及71。在其他实施方案中，存在一种与选自由以下组成的组的肽具有至少75％、80％、85％、90％或95％同一性的肽：seqidno:18-19、22-23、26-27、30-31、34-35、38-39、42-43、46-47、50-51、54-55、58-59、62-63、66-67、70以及71。

在另一实施方案中，存在一种或多种编码短尾畸形蛋白的核酸序列，所述核酸序列选自由以下组成的组：seqidno:16-17、20-21、24-25、28-29、32-33、36-37、40-41、44-45、48-49、52-53、56-57、60-61、64-65、68以及69。

在其他实施方案中，存在一种或多种核酸序列，所述核酸序列与选自由以下组成的组的核酸具有至少70％同一性：seqidno:16-17、20-21、24-25、28-29、32-33、36-37、40-41、44-45、48-49、52-53、56-57、60-61、64-65、68以及69，并且与选自由以下组成的组的核酸序列具有本质上相同的表达特征：seqidno:16-17、20-21、24-25、28-29、32-33、36-37、40-41、44-45、48-49、52-53、56-57、60-61、64-65、68以及69。在其他实施方案中，存在一种核酸序列，所述核酸序列与选自由以下组成的组的核酸具有至少75％、80％、85％、90％或95％同一性：seqidno:16-17、20-21、24-25、28-29、32-33、36-37、40-41、44-45、48-49、52-53、56-57、60-61、64-65、68以及69，并且与选自由以下组成的组的核酸序列具有本质上相同的表达特征：seqidno:16-17、20-21、24-25、28-29、32-33、36-37、40-41、44-45、48-49、52-53、56-57、60-61、64-65、68以及69。

在一个优选实施方案中，存在一种或多种选自由以下组成的组的核酸序列：seqidno:16-17、20-21、24-25、28-29、32-33、36-37、40-41、44-45、48-49、52-53、56-57、60-61、64-65、68以及69。

表达盒

根据另一实施方案，本发明涉及一种表达盒，所述表达盒包含根据本发明的启动子和/或短尾畸形重组蛋白和/或核酸中的一种或多种。

在一个实施方案中，存在一种表达盒，所述表达盒包含与选自由seqidno:1-10组成的组的核酸具有至少70％同一性的启动子以及编码选自由以下组成的组的短尾畸形肽的核酸：seqidno:11、13、18-19、22-23、26-27、30-31、34-35、38-39、42-43、46-47、50-51、54-55、58-59、62-63、66-67、70以及71。在另一实施方案中，存在一种表达盒，所述表达盒包含选自由seqidno:1-10和77组成的组的启动子和/或编码短尾畸形肽的核酸，其中所述核酸选自由以下组成的组：seqidno:12、14-17、20-21、24-25、28-29、32-33、36-37、40-41、44-45、48-49、52-53、56-57、60-61、64-65、68以及69。

在一个优选实施方案中，存在一种表达盒，所述表达盒包含与选自由以下组成的组的核酸序列至少70％同源的核酸序列：seqidno:72-76。在其他实施方案中，存在一种表达盒，所述表达盒包含与选自由以下组成的组的核酸具有至少75％、80％、85％、90％或95％同一性的核酸序列：seqidno:72-76。

在一个更优选实施方案中，存在一种包含seqidno:72的表达盒。

在一个更优选实施方案中，存在一种包含seqidno:73的表达盒。

在一个更优选实施方案中，存在一种包含seqidno:74的表达盒。

重组痘病毒

根据另一实施方案，根据本发明的核酸、启动子、重组蛋白和/或表达盒可为载体的一部分。术语“载体”是指本领域技术人员已知的任何载体。载体可为质粒载体，诸如pbr322；或puc系列的载体。更优选地，载体为重组病毒。在本发明的背景下，术语“病毒”或“重组病毒”是指包含病毒基因组的感染性病毒。在此情况下，本发明的核酸、启动子、重组蛋白和/或表达盒为相应重组病毒的病毒基因组的一部分。对重组病毒基因组进行包装并且可将所获得的重组病毒用于感染细胞和细胞系，特别是用于感染活的动物，包括人类。可根据本发明使用的典型重组病毒为腺病毒载体、逆转录病毒载体或基于腺相关病毒2(aav2)的载体。最优选为痘病毒载体。

在若干实施方案中，根据本发明的核酸、启动子、多肽以及表达盒优选具有作为痘病毒启动子的活性或在痘病毒感染细胞中作为启动子的活性。痘病毒优选为禽痘病毒或正痘病毒。更优选地，痘病毒为禽痘病毒。

术语“禽痘病毒”是指任何禽痘病毒，诸如鸡痘病毒、金丝雀痘病毒、uncopoxvirus、燕八哥痘病毒、鸽痘病毒、鹦鹉痘病毒、鹌鹑痘病毒、孔雀痘病毒、企鹅痘病毒、麻雀痘病毒、欧椋鸟痘病毒以及火鸡痘病毒。优选禽痘病毒为金丝雀痘病毒和鸡痘病毒。

金丝雀痘病毒的实例为rentschler株。称为alvac(美国专利号5,766,598)的蚀斑纯化的金丝雀痘株根据布达佩斯条约(budapesttreaty)条款存放在美国典型培养物保藏中心(americantypeculturecollection，atcc)，登录号为vr-2547。另一金丝雀痘株为可购自institutemerieux,inc的命名为lf2cep524241075的商业金丝雀痘疫苗株。

鸡痘病毒的实例为fp-1、fp-5、trovac(美国专利号5,766,598)以及poxvac-tc株(美国专利7,410,644)。fp-1为进行过修饰以在一日龄鸡中用作疫苗的duvette株。所述株为命名为odcep25/cep67/2309(1980年10月)的商业鸡痘病毒疫苗株并且可购自institutemerieux,inc。fp-5为鸡胚来源的商业鸡痘病毒疫苗株，可购自americanscientificlaboratories(scheringcorp.的分部,madison,wis.)，美国兽医学许可证号165，序列号30321。

在某些实施方案中，重组fpv包含选自由以下组成的组的核酸序列：seqidno:1-10和77。在各种其他实施方案中，重组fpv包含表达盒，所述表达盒包含选自seqidno:72-76的核酸序列。在一个更优选实施方案中，重组fpv包含表达盒，所述表达盒包含选自seqidno:72、73以及74的核酸序列。

在其他实施方案中，重组fpv包含编码选自由以下组成的组的短尾畸形抗原的核酸：seqidno:11、13、18-19、22-23、26-27、30-31、34-35、38-39、42-43、46-47、50-51、54-55、58-59、62-63、66-67、70以及71。在其他实施方案中，重组fpv包含选自由以下组成的组的短尾畸形肽：seqidno:11、13、18-19、22-23、26-27、30-31、34-35、38-39、42-43、46-47、50-51、54-55、58-59、62-63、66-67、70以及71。在其他实施方案中，重组fpv包含选自由以下组成的组的核酸：seqidno:12、14-17、20-21、24-25、28-29、32-33、36-37、40-41、44-45、48-49、52-53、56-57、60-61、64-65、68以及69。在更优选实施方案中，重组fpv包含选自由以下组成的组的短尾畸形肽：seqidno:18-19、22-23、26-27、30-31、34-35、38-39、42-43、46-47、50-51、54-55、58-59、62-63、66-67、70以及71；和/或选自由以下组成的组的核酸：seqidno:16-17、20-21、24-25、28-29、32-33、36-37、40-41、44-45、48-49、52-53、56-57、60-61、64-65、68以及69。

在本公开的各种其他实施方案中，重组痘病毒为正痘病毒，诸如但不限于牛痘病毒、修饰过的安卡拉牛痘病毒(modifiedvacciniavirusankara，mva)或mva-bn。

牛痘病毒株的实例为天坛(templeofheaven)、哥本哈根(copenhagen)、巴黎(paris)、布达佩斯(budapest)、大连(dairen)、gam、mrivp、per、塔什干(tashkent)、tbk、tom、伯尔尼(bern)、patwadangar、biem、b-15、lister、em-63、纽约市卫生局(newyorkcityboardofhealth)、埃尔斯特里(elstree)、池田(ikeda)以及wr株。优选牛痘病毒(vv)株为wyeth(dryvax)株(美国专利7,410,644)。另一优选vv株为mva(sutter,g.等人[1994],vaccine12:1032-40)。另一优选vv株为mva-bn。

适合用于实践本发明并且已按照布达佩斯条约的要求存放的mva病毒株的实例为mva572株，其在1994年1月27日存放在欧洲动物细胞保藏中心(europeancollectionofanimalcellcultures，ecacc)(vaccineresearchandproductionlaboratory,publichealthlaboratoryservice,centreforappliedmicrobiologyandresearch,portondown,salisbury,wiltshiresp40jg,unitedkingdom)，存放号ecacc94012707；以及在2000年12月7日存放在ecacc00120707的mva575。在2000年8月30日以编号v00083008存放在欧洲细胞培养物保藏中心(ecacc)的mva-bn以及其衍生物为额外示例性病毒株。

虽然mva-bn因其较高安全性(复制能力较低)而为优选的，但所有mva均适合用于本发明中。根据本发明的一个实施方案，mva株为mva-bn和其衍生物。以引用的方式并入本文中的pct/ep01/13628中定义了mva-bn和其衍生物。

在一个实施方案中，本发明涵盖重组正痘病毒，优选为用于癌症疗法的牛痘病毒(vv)、wyeth株、acam1000、acam2000、mva或mva-bn。通过将异源序列插入正痘病毒中来产生重组正痘病毒。

在某些实施方案中，mva为在2000年8月30日以编号v00083008存放在欧洲细胞培养物保藏中心(ecacc)的mva-bn，并且在国际pct公布wo2002042480中有描述(还参见例如美国专利号6,761,893和6,913,752)，所述pct公布以引用的方式并入本文中。

在某些实施方案中，重组mva为mva-bn的衍生物。此类“衍生物”包括与存放的病毒株(ecacc编号v00083008)展现出本质上相同的复制特征但在其基因组的一个或多个部分中展现出差异的病毒。与存放的病毒具有相同“复制特征”的病毒为在cef细胞和细胞系hela、hacat以及143b中与存放的病毒株以类似扩增比率复制；并且如例如在agr129转基因小鼠模型中所测定，在体内展示类似复制特征的病毒。

在某些实施方案中，重组正痘病毒包含选自由以下组成的组的核酸：seqidno:1-10和77。在各种其他实施方案中，重组正痘病毒包含表达盒，所述表达盒包含选自seqidno:72-76的核酸序列。在一个更优选实施方案中，重组正痘病毒包含表达盒，所述表达盒包含选自seqidno:72、73以及74的核酸序列。

在其他实施方案中，重组正痘病毒包含编码选自由以下组成的组的短尾畸形抗原的核酸：seqidno:11、13、18-19、22-23、26-27、30-31、34-35、38-39、42-43、46-47、50-51、54-55、58-59、62-63、66-67、70以及71。在其他实施方案中，重组正痘病毒包含选自由以下组成的组的核酸：seqidno:12、14-17、20-21、24-25、28-29、32-33、36-37、40-41、44-45、48-49、52-53、56-57、60-61、64-65、68以及69。在更优选实施方案中，重组正痘病毒包含选自由以下组成的组的短尾畸形肽：seqidno:18-19、22-23、26-27、30-31、34-35、38-39、42-43、46-47、50-51、54-55、58-59、62-63、66-67、70以及71；和/或选自由以下组成的组的核酸：seqidno:16-17、20-21、24-25、28-29、32-33、36-37、40-41、44-45、48-49、52-53、56-57、60-61、64-65、68以及69。

如何可将根据本发明的表达盒或启动子插入病毒基因组中，特别是插入痘病毒的基因组中，最优选插入正痘病毒和/或fpv的基因组中的方法为本领域技术人员已知的。举例来说，可通过同源重组将根据本发明的表达盒或启动子或其衍生物插入痘病毒的基因组中。为此目的，将核酸转染至诸如cef或bhk细胞等受纳细胞系中，其中所述核酸包含侧接数段核苷酸的根据本发明的表达盒或启动子或其衍生物，所述数段核苷酸与痘病毒基因组中根据本发明的表达盒或启动子或其衍生物所要插入的区同源。用痘病毒感染细胞并且在感染的细胞中在所述核酸与所述病毒基因组之间发生同源重组。或者，还可以首先用痘病毒感染细胞并且然后将核酸转染至感染的细胞中。在所述细胞中再次发生重组。然后通过现有技术中已知的方法选择重组痘病毒。重组痘病毒的构建不限于此特定方法。替代地，可使用本领域技术人员已知的任何适合的方法来实现此目的。

可将根据本发明的表达盒或启动子引入病毒或病毒载体的任何适合的部分中，特别是引入病毒基因组中。在正痘病毒和禽痘病毒的情况下，可插入病毒基因组的非本质部分中或插入病毒基因组的基因间区中。术语“基因间区”优选指病毒基因组中位于两个邻近基因之间的不包含编码序列的那些部分。如果病毒为正痘病毒和禽痘病毒，那么还可插入病毒基因组的缺失位点中。术语“缺失位点”是指病毒基因组中相对于天然存在的正痘病毒或禽痘病毒的基因组被缺失的那些部分。然而，插入位点不限于正痘病毒和禽痘病毒基因组中的这些优选插入位点，因为在本发明范围内，表达盒可插入病毒基因组中的任何地方，只要有可能获得可在至少一种细胞培养系统(诸如鸡胚胎成纤维细胞(cef细胞))中扩增和增殖的重组物即可。

根据本发明的启动子可用于表达已为载体(例如正痘病毒和/或禽痘病毒的基因组)的一部分的基因。此类基因可为天然地为病毒基因组的一部分的基因或为已插入载体中的外来基因。在这些情况下，根据本发明的启动子被插入载体中基因的上游，所述基因的表达受启动子控制。

疫苗和/或组合物

根据另一实施方案，本发明涉及根据本发明作为疫苗或药剂的载体。更一般来说，本发明涉及一种疫苗或药物组合物，所述疫苗或药物组合物包含根据本发明的表达盒、dna或载体。如何可向动物或人体施用疫苗或药物组合物的方法为本领域技术人员已知的。在dna和重组质粒载体的情况下，可简单地通过注射来施用dna和载体。如果疫苗或组合物为诸如正痘病毒或禽痘病毒等重组病毒，特别是重组mva或重组fpv，那么还可根据本领域技术人员的了解，例如通过静脉内、肌肉内、鼻内、皮肤内或皮下施用将它施用给动物或人体。下文给出了关于所施用的病毒的量的其他细节。

医药组合物药物组合物或疫苗除根据本发明的启动子、表达盒或载体之外通常还可包括一种或多种药物可接受的和/或被批准的载体、添加剂、抗生素、防腐剂、佐剂、稀释剂和/或稳定剂。所述助剂物质可为水、生理盐水、甘油、乙醇、润湿剂或乳化剂、ph缓冲物质等。适合的载体典型地为大的缓慢代谢的分子，诸如蛋白质、多糖、聚乳酸、聚乙醇酸、聚合氨基酸、氨基酸共聚物、脂质聚集体等。

为制备药物组合物或疫苗，将根据本发明的dna、表达盒或载体，特别是诸如重组mva或重组fpv等重组正痘病毒或禽痘病毒转化成生理学上可接受的形式。对于mva和fpv，这可基于用于针对天花接种的痘病毒疫苗制备中的经验来进行(如stickl,h.等人[1974]dtsch.med.wschr.99,2386-2392所描述)。举例来说，将纯化的病毒储存在-80℃下。，于约10mmtrismmtris、140mmnaclph7.4中配制成5×10⁸tcid50/ml的滴度。为制备疫苗注射物，在磷酸盐缓冲盐水(pbs)中，在存在2％蛋白胨和1％人类白蛋白的情况下，将例如根据本发明的重组病毒的10¹-10⁹个粒子在安瓿，优选玻璃安瓿中冻干。或者，可通过将制剂中的病毒逐渐冷冻干燥来制备疫苗注射物。此制剂可含有适合用于体内施用的额外添加剂，诸如甘露糖醇、右旋糖酐、糖、甘氨酸、乳糖或聚乙烯吡咯烷酮；或其他添加剂，诸如抗氧化剂或惰性气体、稳定剂或重组蛋白(例如人类血清白蛋白)。适合用于冷冻干燥的含典型病毒的制剂包含10mmtris-缓冲液、140mmnacl、18.9g/l右旋糖酐(mw36000-40000)、45g/l蔗糖、0.108g/l单水合l-谷氨酸单钾盐(ph7.4)。然后，将玻璃安瓿密封并且可将其在4℃与室温之间储存数月。然而，只要不存在需要，就将安瓿优选地储存在-20℃以下的温度下。

对于接种或治疗，可将冻干物或冷冻干燥产物溶解于0.1至0.5ml的水溶液中，优选为水、生理盐水或tris缓冲液中，并且全身或局部施用，即通过肠胃外、肌肉内或熟练从业者已知的任何其他施用路径施用。施用模式、剂量以及施用次数可由本领域技术人员以已知方式最佳化。

在一个或多个实施方案中，本发明进一步涉及一种出于治疗目的将编码序列引入靶细胞，诸如人类细胞中的方法，所述方法包括将根据本发明的核酸、启动子、重组蛋白和/或表达盒引入靶细胞中。示例性人类靶细胞可包括抗原呈递细胞(apc)，诸如树突细胞、巨噬细胞；及其他非apc，诸如成纤维细胞、肿瘤细胞等。

本发明进一步涉及一种制备肽、蛋白质和/或病毒的方法，所述方法包括用根据本发明的重组病毒感染宿主细胞，随后在适合的条件下培养感染的宿主细胞，并且随后进一步分离和/或富集由所述宿主细胞产生的肽和/或蛋白质和/或病毒。如果意在制备，即扩增根据本发明的病毒，那么细胞必须为病毒能够在其中复制的细胞。对于痘病毒，特别是mva，适合的细胞为cef(鸡胚成纤维细胞)或bhk(幼仓鼠肾)细胞。对于禽痘病毒，诸如鸡痘病毒，适合的细胞包括cef或ced(鸡胚皮肤)细胞。如果意在制备由根据本发明的重组病毒编码的肽/蛋白质，那么细胞可为可由重组病毒载体感染并且允许病毒编码的蛋白质/肽表达的任何细胞。

本发明进一步涉及一种制备肽、蛋白质和/或病毒的方法，所述方法包括用根据本发明的表达盒、核酸、启动子、重组蛋白和/或表达盒dna转染细胞，随后用痘病毒感染细胞。在适合的条件下培养感染的宿主细胞。另一步骤包括分离和/或富集由所述宿主细胞产生的肽和/或蛋白质和/或病毒。用痘病毒感染细胞的步骤可在转染细胞的步骤之前或之后进行。

本发明进一步涉及包含根据本发明的核酸、启动子、重组蛋白和/或表达盒的细胞。特别地，本发明涉及用根据本发明的重组病毒感染的细胞。

实施例

以下实施例进一步说明本发明。本领域技术人员应了解，所提供的实施例决不可解释为限制技术的适用性。

实施例1：短尾畸形在感染重组鸡痘病毒的人类dc中的表达

为识别短尾畸形蛋白的表达，用阳性对照病毒(包含短尾畸形和tricom的重组mva)以2.5的感染复数(moi)感染人类树突细胞(dc)。还用阴性对照非重组鸡痘(fpv-wt)或包含根据本公开的短尾畸形表达盒和tricom的重组鸡痘病毒株感染人类dc。使用包括fpv-wt、fpv-mbn343a、fpv-mbn344a以及fpv-mbn345a的每种fpv株(在表1中更详细地列出)以20的moi感染dc。经由使用兔单克隆抗短尾畸形抗体进行的西方墨点分析来检测fpv短尾畸形表达。还经由西方墨点分析检测看家蛋白甘油醛3-磷酸脱氢酶(gapdh)作为加样对照(loadingcontrol)。

表1.包含短尾畸形表达盒和tricom的重组鸡痘病毒株

图1中示出了结果。在fpv-mbn343a和fpvmbn345重组fpv情况下检测到短尾畸形的表达，但使用fpv-mbn344a重组fpv却未检测到。在mva-短尾畸形-tricom情况下也检测到短尾畸形表达。通过gapdh表达证实了样品的类似加样。

实施例2：短尾畸形在感染重组鸡痘病毒的人类dc中的表达

还比较了使用不同启动子的表达短尾畸形的额外重组fpv株之间的短尾畸形蛋白表达水平。用5moi的包含短尾畸形和tricom的阳性对照重组mva和阴性对照非重组株mva-wt感染人类树突细胞(dc)。还用根据本公开的包含短尾畸形表达盒和tricom的重组fpv(例如fpv-mbn343a、fpv-mbn344a、fpv-mbn345a、fpv-mbn354a、fpv-mbn355a，参见表1)感染人类dc。另外用包含具有牛痘病毒(vv)-40k启动子或prs启动子的短尾畸形表达盒的重组鸡痘病毒(fpv)感染人类dc。非重组fpv-wt株充当阴性对照。所有fpv均以40的moi使用。经由使用兔单克隆抗短尾畸形抗体进行的西方墨点分析来检测短尾畸形表达。还检测gapdh作为加样对照。

图2中示出了结果。在fpv-mbn343a和fpv-mbn345a重组fpv情况下检测到短尾畸形的表达，但使用fpv-mbn344a和fpv-mbn354a重组fpv却未检测到。更特别地，对于具有驱动短尾畸形的vv-40k或prs启动子的重组fpv(即fvp-mbn281a、fvp-mbn249b)来说，检测到较低水平的短尾畸形表达。在阴性对照(未感染的dc、mva-wt或fpv-wt)中未检测到短尾畸形表达。通过gapdh表达证实了样品的类似加样。

将由实施例2中所示的西方墨点法得到的短尾畸形表达水平相对于看家基因gapdh的表达进行校正，看家基因gapdh预期在细胞之间以同等水平表达。测量各短尾畸形和gapdh条带的强度，并且计算在相同样品内短尾畸形和gapdh条带的强度的之间的比率。

图3中示出了结果。在fpv构建体之中，在感染fpv-mbn355a的dc中检测到短尾畸形相对于gapdh的最高表达。在感染fpv-mbn343a或fpv-mbn345a的dc中检测到中度相对短尾畸形表达。由具有驱动短尾畸形的vv-40k或prs启动子的重组fpv(即fvp-mbn281a、fvp-mbn249b)检测到最低相对短尾畸形表达。由阳性对照病毒mva-短尾畸形-tricom感染观测到最高相对短尾畸形表达；在阴性对照样品中未检测到短尾畸形表达。因此，在重组fpv株之中，来自fpv-mbn355、fpv-mbn345或fpv-mbn344启动子的驱动短尾畸形表达的载体诱导优良的短尾畸形表达。

实施例3：短尾畸形和tricom在感染重组鸡痘病毒的cmmt细胞中的表达

还使用对每种蛋白质具特异性的荧光标记抗体通过流式细胞术对短尾畸形和tricom蛋白的表达进行了评估。用包含短尾畸形和tricom的阳性对照重组mva，或用包含根据本公开的短尾畸形表达盒和tricom的重组fpv(例如fpv-mbn343a、fpv-mbn345a)，或用具有驱动短尾畸形的prs启动子的重组fpv(fvp-mbn249b)感染cmmt细胞(恒河猴乳房肿瘤细胞系)。以1以下的moi感染细胞，从而分析未感染和感染细胞的混合物。未感染的cmmt细胞充当阴性对照。

在bdlsrii或fortessa取得facs样品并且使用bdfacsdiva软件(bdbioscience,sanjose,ca)或flowjo(treestarinc.,ashland,or)进行分析。

图4中示出了结果。绘制针对短尾畸形和三种tricom蛋白(cd80、cd54以及cd58)所检测到的信号的柱状图，并且绘出其中检测到正信号的闸(黑线)。在fpv构建体之中，在感染fpv-mbn343a或fpv-mbn345a的cmmt细胞中检测到最高短尾畸形表达(通过沿x轴的最大信号位移来展示)。由具有驱动短尾畸形的prs启动子的重组fpv(即fvp-mbn281a、fvp-mbn249b)检测到最低短尾畸形表达。在fpv构建体之中检测到类似的tricom蛋白表达水平。由阳性对照病毒mva-短尾畸形-tricom感染也观测短尾畸形和tricom蛋白的表达。

为定量短尾畸形在感染细胞中的表达水平，计算图4中闸选的短尾畸形-阳性细胞的中值荧光强度(mfi)。

图5中示出了结果。在fpv构建体之中，在感染fpv-mbn343a或fpv-mbn345a的cmmt细胞中检测到最高短尾畸形mfi。由具有驱动短尾畸形的prs启动子的重组fpv(fvp-mbn249b)检测到最低短尾畸形mfi。所有所测试构建体的最高短尾畸形mfi是在感染阳性对照病毒mva-短尾畸形-tricom的细胞中。因此，与来自prs启动子相比，由来自fpv-mbn345或fpv-mbn344启动子的驱动短尾畸形表达的载体得到的短尾畸形在感染cmmt细胞中的中值表达水平较高。

实施例4：来自fpv-mbn345b的短尾畸形表达

将用以最初产生重组fpv-mbn345a株的药物选择盒移除以产生适合用于临床研发的重组载体。这是通过在不进行药物选择的情况下使病毒在鸡胚成纤维细胞(cef)上通过、蚀斑纯化个别克隆以及通过pcr和dna测序识别缺乏选择盒的克隆来实现。这产生一代包含由i3+15aa启动子驱动的短尾畸形表达盒和tricom但不含药物选择盒的的fpv-mbn345b。

通过用fpv-bn345b以0.625的moi感染cmmt细胞以感染细胞子集，或以40的moi感染以感染所有细胞在cmmt细胞中确认了来自fpv-mbn345b的短尾畸形和tricom蛋白表达。

图6中示出了结果。绘制针对短尾畸形和三种tricom蛋白(cd80、cd54以及cd58)检测到的信号的柱状图，红线为以0.625的moi感染的样品，而蓝线为以40的moi感染的样品。未感染的细胞充当阴性对照(黑线)。在0.625的moi下，短尾畸形和三种tricom蛋白的表达据检测呈移至未感染细胞的更高峰右侧的峰的形式。在40的moi下，据检测在所有细胞中短尾畸形和tricom的表达呈移至未感染细胞右侧的峰的形式。

通过考虑本说明书及实践本文所公开的本发明，本发明的其他实施方案对本领域技术人员来说将显而易见。意在仅将本说明书和实施例视为示例性的，本发明的真正范围和精神由以下权利要求书指示。

序列表

<110>巴法里安诺迪克有限公司(bavariannordica/s)

<120>用于增强在痘病毒中的表达的启动子

<130>bnit0010pct

<140>62/199681

<141>2015-07-31

<160>77

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>167

<212>dna

<213>人工序列(aritificialsequence)

<220>

<223>具有基因fpv088的5’端核苷酸的启动子序列

<400>1

tatccgtacaggtttgtttctgaaattcactttgtaagatacataattaacaaattcagg60

gggaaaaatctttacaaaattagtatagaagctatagatatatcaaaaggtagacaacaa120

ataatcagaacctaatttttttatcaaaaaattaaaatataaataaa167

<210>2

<211>170

<212>dna

<213>人工序列(aritificialsequence)

<220>

<223>具有基因fpv088的5’端核苷酸+atc序列的启动子序列

<400>2

tatccgtacaggtttgtttctgaaattcactttgtaagatacataattaacaaattcagg60

gggaaaaatctttacaaaattagtatagaagctatagatatatcaaaaggtagacaacaa120

ataatcagaacctaatttttttatcaaaaaattaaaatataaataaaatc170

<210>3

<211>183

<212>dna

<213>人工序列(aritificialsequence)

<220>

<223>具有基因fpv088的5’端核苷酸外加fpv088的16个核苷酸的启动子序列

<400>3

tatccgtacaggtttgtttctgaaattcactttgtaagatacataattaacaaattcagg60

gggaaaaatctttacaaaattagtatagaagctatagatatatcaaaaggtagacaacaa120

ataatcagaacctaatttttttatcaaaaaattaaaatataaataaaatgaaaaataact180

tgt183

<210>4

<211>194

<212>dna

<213>人工序列(aritificialsequence)

<220>

<223>具有来自基因fpv088的区外加27个核苷酸的启动子序列

<400>4

tatccgtacaggtttgtttctgaaattcactttgtaagatacataattaacaaattcagg60

gggaaaaatctttacaaaattagtatagaagctatagatatatcaaaaggtagacaacaa120

ataatcagaacctaatttttttatcaaaaaattaaaatataaataaaatgaaaaataact180

tgtatgaagaaaaa194

<210>5

<211>200

<212>dna

<213>人工序列(aritificialsequence)

<220>

<223>具有来自基因fpv088的区外加33个核苷酸的启动子序列

<400>5

tatccgtacaggtttgtttctgaaattcactttgtaagatacataattaacaaattcagg60

gggaaaaatctttacaaaattagtatagaagctatagatatatcaaaaggtagacaacaa120

ataatcagaacctaatttttttatcaaaaaattaaaatataaataaaatgaaaaataact180

tgtatgaagaaaaaatgaac200

<210>6

<211>212

<212>dna

<213>人工序列(aritificialsequence)

<220>

<223>具有来自基因fpv088的区外加45个核苷酸的启动子序列

<400>6

tatccgtacaggtttgtttctgaaattcactttgtaagatacataattaacaaattcagg60

gggaaaaatctttacaaaattagtatagaagctatagatatatcaaaaggtagacaacaa120

ataatcagaacctaatttttttatcaaaaaattaaaatataaataaaatgaaaaataact180

tgtatgaagaaaaaatgaacatgagtaagaaa212

<210>7

<211>232

<212>dna

<213>人工序列(aritificialsequence)

<220>

<223>具有来自基因fpv088的区外加65个核苷酸的启动子序列

<400>7

tatccgtacaggtttgtttctgaaattcactttgtaagatacataattaacaaattcagg60

gggaaaaatctttacaaaattagtatagaagctatagatatatcaaaaggtagacaacaa120

ataatcagaacctaatttttttatcaaaaaattaaaatataaataaaatgaaaaataact180

tgtatgaagaaaaaatgaacatgagtaagaaacaagtaaaaactcaaagtaa232

<210>8

<211>242

<212>dna

<213>人工序列(aritificialsequence)

<220>

<223>具有来自基因fpv088的区外加75个核苷酸的启动子序列

<400>8

tatccgtacaggtttgtttctgaaattcactttgtaagatacataattaacaaattcagg60

gggaaaaatctttacaaaattagtatagaagctatagatatatcaaaaggtagacaacaa120

ataatcagaacctaatttttttatcaaaaaattaaaatataaataaaatgaaaaataact180

tgtatgaagaaaaaatgaacatgagtaagaaacaagtaaaaactcaaagtaaatgtaata240

at242

<210>9

<211>245

<212>dna

<213>人工序列(aritificialsequence)

<220>

<223>具有来自基因fpv088的区外加78个核苷酸的启动子序列

<400>9

tatccgtacaggtttgtttctgaaattcactttgtaagatacataattaacaaattcagg60

gggaaaaatctttacaaaattagtatagaagctatagatatatcaaaaggtagacaacaa120

ataatcagaacctaatttttttatcaaaaaattaaaatataaataaaatgaaaaataact180

tgtatgaagaaaaaatgaacatgagtaagaaacaagtaaaaactcaaagtaaatgtaata240

atatc245

<210>10

<211>119

<212>dna

<213>人工序列(aritificialsequence)

<220>

<223>具有基因fpvl2r的5’的核苷酸的启动子序列

<400>10

ttaatgtatagaactaatttataataaacatagtaaatatgggtaacttcttaatagcca60

taattaaaattgaaaaaaaaatatcattataaaacgtaaacgaacaaaaaacattaatt119

<210>11

<211>435

<212>prt

<213>人工序列(aritificialsequence)

<220>

<223>来自genbank登录号o15178.1的短尾畸形蛋白同种型1

<400>11

metserserproglythrgluseralaglylysserleuglntyrarg

151015

valasphisleuleuseralavalgluasngluleuglnalaglyser

202530

glulysglyaspprothrgluarggluleuargvalglyleugluglu

354045

sergluleutrpleuargphelysgluleuthrasnglumetileval

505560

thrlysasnglyargargmetpheprovalleulysvalasnvalser

65707580

glyleuaspproasnalamettyrserpheleuleuaspphevalala

859095

alaaspasnhisargtrplystyrvalasnglyglutrpvalprogly

100105110

glylysprogluproglnalaprosercysvaltyrilehisproasp

115120125

serproasnpheglyalahistrpmetlysalaprovalserpheser

130135140

lysvallysleuthrasnlysleuasnglyglyglyglnilemetleu

145150155160

asnserleuhislystyrgluproargilehisilevalargvalgly

165170175

glyproglnargmetilethrserhiscyspheprogluthrglnphe

180185190

ilealavalthralatyrglnasnglugluilethralaleulysile

195200205

lystyrasnprophealalysalapheleuaspalalysgluargser

210215220

asphislysglumetmetglugluproglyaspserglnglnprogly

225230235240

tyrserglntrpglytrpleuleuproglythrserthrleucyspro

245250255

proalaasnprohisproglnpheglyglyalaleuserleuproser

260265270

thrhissercysaspargtyrprothrleuargserhisargserser

275280285

protyrproserprotyralahisargasnasnserprothrtyrser

290295300

aspasnserproalacysleusermetleuglnserhisaspasntrp

305310315320

serserleuglymetproalahisprosermetleuprovalserhis

325330335

asnalaserproprothrserserserglntyrproserleutrpser

340345350

valserasnglyalavalthrproglyserglnalaalaalavalser

355360365

asnglyleuglyalaglnphepheargglyserproalahistyrthr

370375380

proleuthrhisprovalseralaproserserserglyserproleu

385390395400

tyrgluglyalaalaalaalathraspilevalaspserglntyrasp

405410415

alaalaalaglnglyargleuilealasertrpthrprovalserpro

420425430

prosermet

435

<210>12

<211>1308

<212>dna

<213>人工序列(aritificialsequence)

<220>

<223>短尾畸形蛋白同种型1genbank登录号o15178.1的编码序列

<400>12

atgagctcccctggcaccgagagcgcgggaaagagcctgcagtaccgagtggaccacctg60

ctgagcgccgtggagaatgagctgcaggcgggcagcgagaagggcgaccccacagagcgc120

gaactgcgcgtgggcctggaggagagcgagctgtggctgcgcttcaaggagctcaccaat180

gagatgatcgtgaccaagaacggcaggaggatgtttccggtgctgaaggtgaacgtgtct240

ggcctggaccccaacgccatgtactccttcctgctggacttcgtggcggcggacaaccac300

cgctggaagtacgtgaacggggaatgggtgccggggggcaagccggagccgcaggcgccc360

agctgcgtctacatccaccccgactcgcccaacttcggggcccactggatgaaggctccc420

gtctccttcagcaaagtcaagctcaccaacaagctcaacggagggggccagatcatgctg480

aactccttgcataagtatgagcctcgaatccacatagtgagagttgggggtccacagcgc540

atgatcaccagccactgcttccctgagacccagttcatagcggtgactgcttatcagaac600

gaggagatcacagctcttaaaattaagtacaatccatttgcaaaagctttccttgatgca660

aaggaaagaagtgatcacaaagagatgatggaggaacccggagacagccagcaacctggg720

tactcccaatgggggtggcttcttcctggaaccagcaccctgtgtccacctgcaaatcct780

catcctcagtttggaggtgccctctccctcccctccacgcacagctgtgacaggtaccca840

accctgaggagccaccggtcctcaccctaccccagcccctatgctcatcggaacaattct900

ccaacctattctgacaactcacctgcatgtttatccatgctgcaatcccatgacaattgg960

tccagccttggaatgcctgcccatcccagcatgctccccgtgagccacaatgccagccca1020

cctaccagctccagtcagtaccccagcctgtggtctgtgagcaacggcgccgtcaccccg1080

ggctcccaggcagcagccgtgtccaacgggctgggggcccagttcttccggggctccccc1140

gcgcactacacacccctcacccatccggtctcggcgccctcttcctcgggatccccactg1200

tacgaaggggcggccgcggccacagacatcgtggacagccagtacgacgccgcagcccaa1260

ggccgcctcatagcctcatggacacctgtgtcgccaccttccatgtga1308

<210>13

<211>435

<212>prt

<213>人工序列(aritificialsequence)

<220>

<223>短尾畸形蛋白同种型1(l254v)

<400>13

metserserproglythrgluseralaglylysserleuglntyrarg

151015

valasphisleuleuseralavalgluasngluleuglnalaglyser

202530

glulysglyaspprothrgluarggluleuargvalglyleugluglu

354045

sergluleutrpleuargphelysgluleuthrasnglumetileval

505560

thrlysasnglyargargmetpheprovalleulysvalasnvalser

65707580

glyleuaspproasnalamettyrserpheleuleuaspphevalala

859095

alaaspasnhisargtrplystyrvalasnglyglutrpvalprogly

100105110

glylysprogluproglnalaprosercysvaltyrilehisproasp

115120125

serproasnpheglyalahistrpmetlysalaprovalserpheser

130135140

lysvallysleuthrasnlysleuasnglyglyglyglnilemetleu

145150155160

asnserleuhislystyrgluproargilehisilevalargvalgly

165170175

glyproglnargmetilethrserhiscyspheprogluthrglnphe

180185190

ilealavalthralatyrglnasnglugluilethralaleulysile

195200205

lystyrasnprophealalysalapheleuaspalalysgluargser

210215220

asphislysglumetmetglugluproglyaspserglnglnprogly

225230235240

tyrserglntrpglytrpleuleuproglythrserthrvalcyspro

245250255

proalaasnprohisproglnpheglyglyalaleuserleuproser

260265270

thrhissercysaspargtyrprothrleuargserhisargserser

275280285

protyrproserprotyralahisargasnasnserprothrtyrser

290295300

aspasnserproalacysleusermetleuglnserhisaspasntrp

305310315320

serserleuglymetproalahisprosermetleuprovalserhis

325330335

asnalaserproprothrserserserglntyrproserleutrpser

340345350

valserasnglyalavalthrproglyserglnalaalaalavalser

355360365

asnglyleuglyalaglnphepheargglyserproalahistyrthr

370375380

proleuthrhisprovalseralaproserserserglyserproleu

385390395400

tyrgluglyalaalaalaalathraspilevalaspserglntyrasp

405410415

alaalaalaglnglyargleuilealasertrpthrprovalserpro

420425430

prosermet

435

<210>14

<211>1308

<212>dna

<213>人工序列(aritificialsequence)

<220>

<223>编码含l254v的短尾畸形蛋白同种型1的编码序列

<400>14