本发明涉及嵌合抗原受体领域，特别是涉及包含至少一个抗原结合结构域，至少一个细胞因子受体激活或阻断结构域，连接至跨膜和细胞内信号传导结构域的兼性细胞外间隔子结构区的嵌合抗原受体，特别是涉及表达所述嵌合抗原受体的细胞，及其治疗用途。
背景技术：
基于免疫系统可以长期控制癌症的一般假设，通过过继性细胞疗法对恶性疾病的治疗正引起人们的主要兴趣。从肿瘤病灶中分离的肿瘤浸润淋巴细胞(til)，体外扩增并回输至患者，已经在转移性黑色素瘤治疗方面产生了令人鼓舞的结果。由于这些t细胞的特异性常常是未知的，并且til通常不能从其他肿瘤实体分离出足够的数量，所以制定了策略以通过用t细胞受体(tcr)或重组嵌合抗原受体(car)(“t型体(t-body)”)进行工程化，以植入对癌细胞具有预定的特异性的离体的患者t细胞。与tcr相比，car是由具有衍生自抗体的细胞外抗原结合结构域(主要是可变区(scfv)抗体的单链片段)和细胞内信号传导链(通常是tcr衍生的cd3ζ链)的一条多肽链组成。抗体结构域独立于主要组织相容性复合体(mhc)介导靶标识别，并且使得能够靶向过量的抗原，其包括蛋白质、碳水化合物和神经节苷脂，只要抗原存在于靶细胞表面。通过car进行的抗原接合通过tcr相关激酶的级联反应诱导突触形成和下游信号传导，最终产生增加的细胞因子分泌、t细胞扩增和细胞毒性。car结构的改变，特别是个体car结构域的改变，以优化重定向的t细胞功能，一直是临床前研究的一个方面。第二代car是通过将共刺激结构域添加至基本cd3ζ信号传导链而工程化，以加强应答并延长t细胞持续性；第三代car具有两个共刺激结构域来微调重定向的t细胞应答。
在美国7,514,537b2中公开了称为"zetakines"的嵌合跨膜免疫受体。它们由包含连接至能够将细胞外结构域连接到细胞表面的支持区域的可溶性受体配体(例如细胞因子)的细胞外结构域，跨膜区和细胞内信号传导结构域组成。当在t淋巴细胞表面上表达时，zetakines将t细胞活性引导至表达可溶性受体配体对其特异性的受体的那些特定细胞，因为可溶性受体配体与嵌合跨膜免疫受体的抗原结合结构域相同。zetakine不影响可能向其施用的患者中细胞因子的稳态环境。
尽管在血液恶性肿瘤的治疗方面取得了显著的成功，但t型体策略在针对实体瘤病灶时面临许多限制；其中一些代表抗原重定向策略的更一般的限制。随着疾病的进展，癌细胞在表型和功能上获得相当大的变异性，其导致对car或tcr修饰的t细胞不可见的抗原丢失肿瘤细胞变体。此外，多种其他机制增加了特异性t细胞的抗肿瘤效力的降低，例如对细胞溶解性t细胞攻击的抗性增加，其由以下原因造成：细胞凋亡途径中的缺陷，t细胞不易穿透的基质，和通过包括调节性t(treg)细胞、骨髓衍生抑制细胞(mdsc)和巨噬细胞的各种手段积极抑制免疫细胞激活的环境。尽管存在大量的循环肿瘤特异性t细胞，但是这些和其他因素促进肿瘤复发。目前已经进行了很多努力以克服这些限制，例如通过优化靶标结合，改善t细胞存活和提供有利的稳态环境。除了所提及的缺点之外，最近描述的策略通过使用car工程化t细胞作为生产设施来解决抗原丢失癌细胞变体的消除，其将转基因细胞因子释放到靶向的肿瘤组织中以募集另外的免疫细胞以对抗对cart细胞不可见的癌细胞(chmielewski等,immunologicalreviews2014,vol.257:83-90)。
truck(重定向用于通用细胞因子杀伤的t细胞)是car重定向的t细胞，其用作载体以产生和释放积累在靶向组织中的转基因产物。一旦t细胞被靶向组织中的car激活，产物(主要是促炎细胞因子)可以被组成性地产生或诱导。转基因促炎细胞因子的积累旨在以局部受限方式招募第二波免疫细胞，以启动对那些对cart细胞不可见的癌细胞的攻击。除了t细胞以外的其他生产细胞，如nk细胞，也可以用作car重定向载体，以在靶向组织中car激活时产生有效载荷。truck策略的可行性最近由由于非凡的il-12毒性而不可以以治疗剂量全身给药的il-12的局部积累证明。通过肿瘤靶向car重定向和另外用car诱导型il-12(iil-12)盒工程化的t细胞在car接合同源抗原时分泌il-12(chmielewskicancerres2011；71：5697-5706)；没有car信号传导，没有il-12释放发生。
truck介导的il-12释放是局部受限的，然而处于il-12在“脱瘤”环境中积累的风险中。
白细胞介素12(il-12)是由树突细胞、巨噬细胞、中性粒细胞和人b淋巴母细胞(nc-37)响应抗原刺激而自然产生的白细胞介素。它是由两个独立基因il-12a(p35)和il-12b(p40)编码的异二聚体细胞因子。p40的活性异源二聚体(称为“p70”)和同源二聚体在蛋白质合成后形成。il-12参与初始t细胞向thl细胞的分化。它被称为t细胞刺激因子，其可以刺激t细胞的生长和功能。它刺激来自t细胞和自然杀伤(nk)细胞的干扰素-γ(ifn-γ)和肿瘤坏死因子-α(tnf-α)的产生，并降低il-4介导的ifn-γ的抑制。il-12在自然杀伤细胞和t淋巴细胞的活性中起重要作用。il-12介导nk细胞和cd8+细胞毒性t淋巴细胞的细胞毒活性的增强。
il-12与il-12受体结合，其是由il-12r-β1和il-12r-β2形成的异源二聚体受体。il-12r-β2被认为在il-12功能中起关键作用，因为它在激活的t细胞上被发现。
本领域需要改进的car，特别是当car在免疫细胞上表达时，可以与受试者中的细胞因子受体-细胞因子系统可控地相互作用的car。
技术实现要素：
本发明提供了car，其含有至少一个细胞因子受体激活或阻断结构域，例如感兴趣的至少一个细胞因子，作为car的细胞外部分的另外模块。本文所公开的car是反式激活car。当在白血细胞(免疫细胞)表面上表达时，反式激活car指导那些细胞对抗表达由反式激活car的所述至少一个抗原结合结构域识别的抗原的靶细胞的反式活性。
反式活性指本发明的car的特征，即本发明的car包含至少一个结构域，即细胞因子受体激活或阻断结构域，其当在白血细胞表面上表达时，在靶细胞上、在表达所述car的白血细胞上或在另外的细胞上触发活性，其中所述触发的活性是独立于所述car的抗原结合结构域对靶细胞的抗原的结合。所述触发的活性可以是细胞因子受体的激活，导致例如给定细胞因子的释放(当所述结构域是细胞因子受体激活结构域)或可以是细胞因子受体的阻断，导致例如给定细胞因子的释放的减少或抑制(当所述结构域是细胞因子受体阻断结构域)。
令人惊讶地发现，整合到car的细胞外部分的细胞因子受体激活结构域例如单链p34-p40il-12(il-12的重组变体)可以相互作用并激活匹配的细胞因子受体。例如，整合到car的细胞外部分的il-12或其功能片段激活免疫效应细胞的il-12受体，例如表达所述car的t细胞，导致在car接合靶标后的协同性t细胞激活，例如由ifn-γ释放的增加所指示的。含car细胞(以下称"car-细胞")攻击受益于关于靶向肿瘤组织中延长和改善的免疫应答和持久性的细胞因子介导的信号传导。il-12启动并促进许多功能，包括t细胞、nk细胞、骨髓衍生细胞的激活，t辅助-1极化的促进和t辅助-2极化的逆转，mhci类提呈的改进，趋化因子分泌如ip-10和mig的增加，改变细胞外基质和减少血管生成。
il-12p40同源二聚体是如本文所公开的car的细胞因子受体阻断结构域的实例。
本发明还提供了编码所述car的分离的核酸分子，包含所述核酸分子的细胞，表达所述car的细胞和所述car的治疗用途。
附图说明
图1：il12-car的模块化组成
(a)常规第二代抗ceacar的表达盒
(b)具有cea抗原结合结构域和il-12受体激活结构域(抗cea-il12-car)的杂合car的表达盒。
图2：外周血t细胞对car的表达。
将外周血t细胞转导以分别表达常规的第二代抗ceacar或杂合抗cea-il12-car。通过分别利用抗人igg和抗cd3抗体的双色流式细胞术在细胞表面检测car。
图3：抗cea-il12-car在不同t细胞亚组中表达。
将外周血t细胞转导以分别表达常规的第二代抗cea-car或杂合抗cea-il12-car。通过分别利用抗人igg和抗cd4和抗cd8抗体的三色流式细胞术记录cd4+和cd8+细胞中的car表达。门控cd4+和cd8+t细胞，并测定t细胞亚组上car+细胞的数量。
图4：抗cea-il12-car诱导cd56+cd62l+t细胞。
分别将抗cea-cart细胞、抗cea-il12-cart细胞和未转导t细胞在il2(500u/ml)存在下在转导后培养9天，并通过多色流式细胞术分析cd56和cd62l的表达。数据代表典型实验的斑点印迹。
图5：通过杂合抗cea-il12-car的组合的顺式和反式信号传导增强的ifn-γ分泌。
将cart细胞(0.313-2.5×10(4)/孔)分别与cea+ls174t、cea-colo320肿瘤细胞(各自2.5×10(4)/孔)和不与靶细胞共培养48小时。48小时后，去除上清液并通过elisa测试ifn-γ分泌。数据代表一式三份的平均值±标准偏差(sd)。
图6：car介导的靶细胞裂解。
将cart细胞(0.313-2.5×10(4)/孔)分别与cea+ls174t或skov3肿瘤细胞以及与用作对照的cea-colo320肿瘤细胞(各2.5×10(4)/孔)共培养48小时。48小时后，通过比色四唑盐基xtt试验来测定靶细胞活力。细胞毒性通过100-活力[％]计算。数据代表一式三份的平均值±标准偏差(sd)。
图7：杂合抗cea-il12-car优于由car和外源il12组合刺激的常规抗cea-car。
常规cart细胞在il2(500u/ml)存在下培养72小时，或者在car-特异性抗独特型抗体bw2064(4μg/ml)和外源mil12(5ng/ml)和il2(500u/ml)的存在下条件化72小时。将条件化的和未条件化的cart细胞(2.5×10(4)/孔)和抗cea-il12-cart细胞分别与cea+ls174t或skov3肿瘤细胞以及与用作对照的cea-colo320肿瘤细胞(各2.5×10(4)/孔)共培养48小时。48小时后，通过比色四唑盐基xtt试验来测定靶细胞活力。细胞毒性通过100-活力[％]计算。数据代表一式三份的平均值±标准偏差(sd)。
图8：外源性il2和il12的组合刺激分别对杂合抗cea-il12-car和常规抗cea-car的靶细胞裂解没有影响。
将未转导的和cart细胞(2.5×10(4)/孔)与cea+skov3肿瘤细胞(2.5×10(4)/孔)分别在mil12(5ng/ml)或il2(10-1000u/ml)或两者组合的存在下共培养48小时。48小时后，通过比色四唑盐基xtt试验来测定靶细胞活力。细胞毒性通过100-活力[％]计算。数据代表一式三份的平均值±标准偏差(sd)。
图9：抗cea-cart细胞抑制免疫缺陷rag-/-普通γ-/-小鼠中skov3肿瘤的生长。
将rag-/-普通γ-/-小鼠用skov3肿瘤细胞(5×l0(6)/小鼠；6只动物/组)皮下移植。肿瘤建立后，小鼠接受未转导的或cart细胞的单次静脉内剂量(l×10(7)/小鼠)。cart细胞的数量分别是14％(抗cea-car)和9％(抗cea-il12-car)。数据代表平均值。箭头表示t细胞注射的时间。
图10：抗muc1-car和抗muc1-il12-car的表达盒。
(a)抗muc1car的表达盒。
(b)抗muc1scfv-il12-car的表达盒。
图11：在外周血t细胞中具有不同抗原特异性的scfv-il12-car的表达。
将来自外周血的t细胞转导以分别表达抗cea-il12-car或抗muc1-il12-car。通过分别利用检测细胞外fc间隔子的抗人igg抗体和抗cd3抗体的双色流式细胞术在t细胞表面检测car。facs点图显示了分别的scfv-il12-car在t细胞表面上的表达。
图12：在抗原接合时，抗muc1-il12-car增强的ifn-γ分泌。
(a，b)将cart细胞(0.313-2.5×10(4)细胞/孔)分别与muc1+ls174t和muc1-colo320肿瘤细胞(各2.5×10(4)细胞/孔)共培养48小时。48小时后，通过elisa检测上清液中的ifn-γ。数据代表一式三份的平均值±标准偏差(sd)。
(c)将抗muc1-cart细胞、抗muc1-il12-cart细胞和用于对照的未转导的t细胞(各0.313-2.5×10(4)细胞/孔)与muc1+mcf7肿瘤细胞(2.5×l0(4)细胞/孔)共培养。48小时后，通过比色四唑盐基xtt试验来测定靶细胞活力。细胞毒性通过100-活力[％]计算。数据代表一式三份的平均值±标准偏差(sd)。
图13：抗cea-il12和抗muc1-il12cart以高效率特异性地裂解肿瘤细胞。
将抗muc1-il12-car、抗cea-il12cart细胞和用于对照的未转导t细胞分别与cea+muc1+ls174t、cea+muc1+mcf7或cea-muc1-colo320肿瘤细胞(各2.5×10(4)细胞/孔)共培养。48小时后，通过比色四唑盐基xtt试验来测定靶细胞活力。细胞毒性通过100-活力[％]计算。数据代表一式三份的平均值±标准偏差(sd)。数据显示了杂合scfv-il12-cart细胞对靶细胞的有效和特异性裂解。
图14：抗cea-il12cart细胞不裂解cea-正常成纤维细胞。
(a)将抗cea-car-t细胞、杂合抗cea-il12-car-t细胞和未转导的t细胞(各0.313-2.5×10(4)细胞/孔)与cea+ls174t、cea-正常成纤维细胞和cea-colo320肿瘤细胞(各2.5×10(4)细胞/孔)共培养。48小时后，通过比色四唑盐基xtt试验来测定靶细胞活力。细胞毒性通过100-活力[％]计算。数据代表一式三份的平均值±标准偏差(sd)。
图15：il7-抗cea-car的表达盒。
il7-car含有il7而不是il12作为活性细胞因子，并且在末端位置具有细胞因子结构域，而il12car是在scfv和igg1-fc间隔子之间的位置。li，接头；hi，铰链；cd28d，具有突变的lck结合位点的cd28细胞内结构域；bw431/26scfv，抗ceascfv。
图16：外周血t细胞中杂合il7-抗cea-car的表达。
将外周血t细胞转导以表达抗cea-car或杂合il7-抗cea-car。通过分别利用抗人igg和抗cd3抗体的双色流式细胞术在细胞表面检测car。数据显示了杂合il7-抗cea-car的有效表达。w/o，无car。
图17：具有il7-抗cea-car的cd8+t细胞的优先扩增。
(a)通过分别用il7-抗ceacar和用于比较的不具有细胞因子的抗ceacar进行逆转录病毒转导，使外周血t细胞工程化。将t细胞在il2(500u/ml)存在下培养。通过双色流式细胞术在转导后72小时和144小时监测car表达。
(b)t细胞在用用于t细胞分类的抗cd4和抗cd8抗体和用抗人iggfc抗体转导后144小时染色以记录car。通过流式细胞术分析细胞并测定car+t细胞的数量。
图18：il7-抗cea-cart细胞高效裂解cea+肿瘤细胞。
将抗cea-cart细胞、il7-抗cea-car-t细胞和未转导的t细胞(各0.625-5×10(4)细胞/孔)与cea+ls174t或cea-colo320肿瘤细胞(各2.5×10(4)细胞/孔)共培养。48小时后，通过比色四唑盐基xtt试验来测定靶细胞活力。细胞毒性通过100-活力[％]计算。数据代表一式三份的平均值±标准偏差(sd)。w/o，无car。
具体实施方式
在第一方面，本发明提供了一种嵌合抗原受体(car)，其包含细胞外部分，至少一个细胞内信号传导结构域，和至少一个跨膜结构域，其中所述car的所述细胞外部分包含
a)至少一个抗原结合结构域，和
b)至少一个细胞因子受体激活或阻断结构域。
所述至少一个细胞内信号传导结构域可以包含至少一个共刺激结构域和/或至少一个初级信号传导结构域。
car可以从n端到c端包含包含至少一个抗原结合结构域和至少一个细胞因子受体激活或阻断结构域的细胞外部分，跨膜结构域，和至少一个细胞内信号传导结构域。car也可以包含共同作为功能活性car起作用的多肽的两个或更多个成员(例如开启式car、关闭式car、有条件地活性car、可调节car、可控car、多链car)，例如第一多肽，其包含至少一个抗原结合结构域，至少一个细胞因子受体激活或阻断结构域，二聚对的第一成员，和跨膜结构域；和第二多肽，其包含二聚对的第二成员，和至少一个细胞内信号传导结构域(用于活性car的关键信号传导)，和任选地跨膜结构域，其中所述car在通过识别二聚对的成员的二聚体进行二聚化时被激活。具有分离的关键信号传导和识别模块的这种car构建体公开于例如wo2014/127261a1、wo2015017214a1、wo2015090229a1、wo2015142661a1和wo2015150771a1。
在本发明的一个实施方式中，所述car的所述至少一个细胞因子受体激活结构域可以选自il-1，il-2，il-4，il-5，ifn-γ，il-6，il-7，gm-csf，il-12、il-17、il-18、il-23、il-32、tnf-α或其功能片段的p35-p40变体。与所述细胞因子受体激活结构域的野生型序列相比，所述细胞因子受体激活结构域可以分别具有至少85％，90％，95％，96％，97％，98％，99％或100％的氨基酸序列同一性。
在本发明的一个实施方式中，所述car的所述至少一个细胞因子受体阻断结构域可以选自tgf-β，il-10，il12、il-13、il-32或其功能片段的p40-p40变体。与所述细胞因子受体阻断结构域的野生型序列相比，所述细胞因子受体阻断结构域可以分别具有至少85％，90％，95％，96％，97％，98％，99％或100％的氨基酸序列同一性。在本发明的一个实施方式中，所述car的所述至少一个细胞因子受体激活或阻断结构域激活或阻断白细胞介素12受体。
白细胞介素12受体可以被任何分子或肽序列激活或阻断/抑制，所述分子或肽序列可与所述受体相互作用并由此激活或阻断/抑制所述受体。优选地，所述至少一个细胞因子受体激活结构域是细胞因子il-12或其功能片段，更优选地，所述至少一个细胞因子受体激活结构域是单链p35-p40il-12，或其具有85％，90％，95％，96％，97％，98％，99％同一性的氨基酸序列。
在本发明的一个实施方式中，所述至少一个细胞因子受体激活结构域包含有seqidno:l编码的序列或其具有85％，90％，95％，96％，97％，98％，99％同一性的序列。
在本发明的一个实施方式中，所述car的所述至少一个细胞因子受体激活或阻断结构域激活或阻断白细胞介素7受体。
白细胞介素7受体可以被任何分子或肽序列激活或阻断/抑制，所述分子或肽序列可与所述受体相互作用并由此激活或阻断/抑制所述受体。优选地，所述至少一个细胞因子受体激活结构域是细胞因子il-7或其功能片段或其具有85％，90％，95％，96％，97％，98％，99％的同一性的氨基酸序列。
在本发明的一个实施方式中，所述至少一个细胞因子受体激活结构域包含由seqidno:14编码的序列或其具有85％，90％，95％，96％，97％，98％，99％同一性的序列。
在本发明的一个实施方式中，所述至少一个细胞因子受体激活或阻断结构域是在所述car的至少一个抗原结合结构域和至少一个跨膜结构域之间。在另一个实施方式中，所述至少一个细胞因子受体激活或阻断结构域的侧翼为接头结构域，例如igg1铰链。
在本发明的另一个实施方式中，所述至少一个细胞因子受体激活或阻断结构域是在所述car的氨基酸序列的n端位置，即至少一个抗原结合结构域是在所述car的至少一个细胞因子受体激活或阻断结构域和至少一个跨膜结构域之间。
对应于各自的细胞因子受体激活或阻断结构域的受体的激活，例如，本文所述的il-12受体或il-7受体的激活，导致通过携带所述受体的细胞进行的增加的ifn-γ释放和技术人员熟知的其他改善的效应功能。所述受体的激活或抑制的作用独立于如本文所公开的car的所述至少一个细胞因子受体激活或阻断结构域的细胞外位置。
在本发明的一个实施方式中，所述至少一个抗原结合结构域包含结合抗原的抗体的至少一个单链可变片段，或结合抗原的抗体的至少一个重链或轻链可变区。
在本发明的一个实施方式中，所述至少一个抗原结合结构域的至少一个抗原是肿瘤特异性抗原或肿瘤相关抗原。
在本发明的一个实施方式中，所述至少一个抗原结合结构域的至少一个抗原是癌胚抗原(cea)。
在本发明的一个实施方式中，所述抗原结合结构域包含抗ceascfv抗原结合结构域，或其具有85％，90％，95％，96％，97％，98％，99％同一性的氨基酸序列。
在本发明的一个实施方式中，所述细胞内信号传导结构域包含cd3ζ信号传导结构域。
在本发明的一个实施方式中，所述至少一个共刺激结构域包含ox40，cd70，cd27，cd28，cd5，icam-1，lfa-1(cd11a/cd18)，icos(cd278)，dap10，dap12和4-1bb(cd137)或其组合的功能信号传导结构域。在本发明的一个实施方式中，所述car包含由seqidno:2编码的氨基酸序列，或其具有85％，90％，95％，96％，97％，98％或99％同一性的氨基酸序列。
在本发明的一个实施方式中，car是包含seqidno:3的序列或由seqidno:4编码的序列的抗cea-il12-car。
在本发明的一个实施方式中，car是包含seqidno:13的序列或由seqidno:12编码的序列的il7-抗cea-car。
在本发明的一个实施方式中，所述至少一个抗原结合结构域的至少一个抗原是粘蛋白-1(muc1，cd227)。
在本发明的一个实施方式中，所述抗原结合结构域包含抗muc1scfv抗原结合结构域，或其具有85％，90％，95％，96％，97％，98％或99％同一性的氨基酸序列。
在本发明的一个实施方式中，car是包含seqidno:6的序列或由seqidno:5编码的序列的抗muc1-il12-car。
在本发明的一个实施方式中，所述car用于免疫疗法，即用于受试者中的疾病的治疗。
在本发明的一个实施方式中，所述car用于受试者中的癌症的治疗。
癌症包括，尤其是，血液恶性肿瘤，例如白血病(例如慢性淋巴细胞白血病(cll)、急性淋巴细胞白血病(all)、或慢性髓性白血病(cml))、淋巴瘤(例如套细胞淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤或霍奇金淋巴瘤)或多发性骨髓瘤，或实体瘤如胃肠道、乳腺、卵巢、前列腺、肝、肺、肾的癌，或其组合。
在本发明的一个实施方式中，所述car是用于自身免疫病、慢性炎症和/或感染的治疗。
在一个方面，本发明提供了一种或多种分离的核酸分子，其中所述核酸分子编码car，所述car包含细胞外部分，至少一个细胞内信号传导结构域，和至少一个跨膜结构域，其中所述car的所述细胞外部分包含
a)至少一个抗原结合结构域，和
b)至少一个细胞因子受体激活或阻断结构域。
可以构建核酸分子使得它们编码本文公开的car的至少全部实施方式。当由所述分子编码的car的全部结构域都在一个多肽内时，它们可以是连续的核酸分子。或者，可以有两个或更多个核酸分子，例如当由所述分子编码的car的一些结构域是在不同的多肽上时。
在本发明的一个实施方式中，编码所公开的car的核酸分子可以包含在载体例如病毒载体中。载体可以是dna载体，rna载体，质粒载体，粘粒载体，疱疹病毒载体，麻疹病毒载体，慢病毒载体，腺病毒载体，或逆转录病毒载体，或其组合。
在本发明的某些实施方式中，载体还包含启动子，其中启动子是诱导型启动子，组织特异性启动子，组成性启动子，自杀启动子或其任何组合。
在另一个实施方式中，可以进一步修饰表达car的载体以包含操作元件以控制car细胞的表达，或通过自杀开关(例如，诱导信号传导级联的细胞凋亡或诱导细胞死亡的药物)消除car细胞。
在另一方面，本发明提供了包含一种或多种分离的核酸分子的细胞，其中所述核酸分子编码car，所述car包含细胞外部分，至少一个细胞内信号传导结构域，和至少一个跨膜结构域，其中所述car的所述细胞外部分包含
a)至少一个抗原结合结构域，和
b)至少一个细胞因子受体激活或阻断结构域。
所述细胞可以是免疫细胞。
优选地所述细胞是nk细胞或t细胞，特别是cd4+或cd8+t细胞。
在另一方面，本发明提供了编码car的细胞，所述car包含细胞外部分，至少一个细胞内信号传导结构域，和至少一个跨膜结构域，其中所述car的所述细胞外部分包含
a)至少一个抗原结合结构域，和
b)至少一个细胞因子受体激活或阻断结构域。
所述细胞可以是免疫细胞。
优选地所述细胞是nk细胞或t细胞，特别是cd4+或cd8+t细胞。
在一个方面，本发明提供了一种药物组合物，其包含表达car的细胞群(细胞组合物)，所述car包含细胞外部分，至少一个细胞内信号传导结构域，和至少一个跨膜结构域，其中所述car的所述细胞外部分包含
a)至少一个抗原结合结构域，和
b)至少一个细胞因子受体激活或阻断结构域。
所述细胞群可以是免疫效应细胞。
优选地，所述细胞群是nk细胞和t细胞的群，特别是cd4+或cd8+t细胞。
所述药物组合物可以包含抗肿瘤有效量的所述细胞的群。
所述药物组合物还可以包含药学上可接受的载体。
在一个方面，本发明提供了一种用于通过向受试者施用编码本发明的car的核酸分子或表达本发明的car的细胞，治疗或预防受试者中的疾病的方法，例如癌症、自身免疫病、慢性炎症或感染。
过继性细胞疗法使用基于免疫细胞的，优选基于t细胞的细胞毒性应答以攻击患病的细胞，例如癌细胞。对患者的癌症具有天然或基因工程反应性的免疫细胞，优选t细胞，在体外用本发明的car工程化并转移至癌症患者。car提供针对癌症的靶向特异性。本发明的car可以被工程化以包含包含抗原结合结构域和细胞因子受体激活或阻断结构域的细胞外部分，跨膜结构域，和细胞内信号传导结构域，通常为例如cd3ζ。关键信号传导和抗原识别模块可以在一个或两个(或甚至更多个)多肽上。由于car的每个多肽中的小分子依赖性异源二聚化结构域，分离信号传导和抗原识别模块使得能够对car细胞表达进行小分子依赖的、可滴定的和可逆的控制(wu等，2015,science350:293-303)。
本发明的工程化免疫细胞，优选t细胞，表达本发明的car，其能够识别并随后激活或阻断相同细胞或相邻其他免疫细胞或靶细胞上的细胞因子受体，因为细胞因子受体激活或阻断结构域整合到car中。除了car的抗原结合结构域与靶细胞的抗原的结合之外，其中大部分抗原是肿瘤相关抗原，本发明的car构建体具有局部结合并激活或阻断细胞因子受体的作用。细胞因子受体激活结构域对细胞因子受体的激活导致例如免疫调节物质从细胞到局部受限环境中的改变的释放。示例性的，携带il-12受体激活结构域的car细胞对il-12受体的结合导致ifn-γ释放至所述局部受限环境的增加。然后car细胞攻击受益于增加的ifn-γ释放，具有改善的癌细胞杀伤和肿瘤消除。同时，避免了由il-12介导的毒性引起的严重副作用，因为没有可溶性il-12释放到环境中。
本发明的示例性概念用cea-car显示，即具有针对癌胚抗原的抗原结合结构域(cea，cd66e)和作为细胞因子激活结构域il-12序列(参见图ib)或作为细胞因子激活结构域的il7序列(参见图15)的car，由此两种细胞因子结构域的位置对于其在car中的细胞外定位而言是不同的。对靶细胞具有不同特异性的另一种car(抗muc1代替抗cea)示例性用于证明本发明的概念与由car识别的靶细胞的抗原的独立性。因此，不旨在对本文具体使用的具有所述特定抗原结合结构域和所述特定细胞因子受体激活结构域的car作出限制，因为可将概念转移至具有其他抗原结合结构域和其他细胞因子受体激活或阻断结构域的其他car。
具有cea抗原结合结构域和il-12受体激活结构域的car(以下称"具有il-12模块的cea-car"或"抗cea-il12-car")以特定方式重定向t细胞，如通过与cea+癌细胞孵育但不与cea-癌细胞孵育时通过特异性杀伤(图6)和ifn-γ释放(图5)所指示的。
一些癌细胞通过各种手段抑制t细胞激活，结果t细胞抗肿瘤应答不成功。tcr或car重定向t细胞也是这种情况。使用具有il-12模块的cea-car用于靶向，工程化t细胞被成功激活并介导生产性抗癌细胞应答，其没有用具有cea特异性car而不具有il-12模块的t细胞获得。skov-3细胞是卵巢腺癌细胞，其经常用作t细胞中癌症诱导的il-2依赖性信号传导途径的抑制的模型。skov-3细胞抑制il-1受体β-和γ链的诱导，通过jak-stat5途径信号的传导，减少ifn-γ和增加il-10水平并通过g0/g1阻滞抑制细胞周期。因此，在长期试验中，与相同cart细胞对其他癌细胞系的杀灭相比，cart细胞的杀灭不佳。然而，与缺乏il-12模块的cart细胞的杀灭(图6)相比，在向car中加入il-12模块后，skov-3细胞的特异性杀灭得到显著改善。
许多小鼠模型表明cea靶标抗原识别和特异性t细胞激活是由体内cea特异性car介导。因此，预期通过具有il-12模块的cea-car发生相同的结合和激活。而且，任何其他细胞因子受体激活或阻断结构域可能在体内以预测方式起作用。
在本发明的一个实施方式中，产生编码本文公开的car的dna构建体(载体，质粒)，例如具有il-12模块的cea-car。这种表达载体的构建可以通过本领域公知的重组方法进行。或者，可以合成地产生核酸序列。
编码本发明的car的dna或rna构建体(核酸分子)可以通过本领域公知的方法(例如基于病毒的系统，物理方法，生物学方法，化学方法)转染或转导到宿主细胞中。不考虑用于整合优选稳定整合编码本发明的car的dna到宿主细胞中的方法，结果是宿主细胞表达在其细胞外部分具有细胞因子受体激活或阻断结构域的car。
在本发明的一个实施方式中，在其细胞外部分含有细胞因子受体激活或阻断结构域的car在免疫细胞或免疫细胞亚组中表达。在本发明的一个实施方式中，在其细胞外部分含有细胞因子受体激活或阻断结构域的car在t细胞或t细胞亚组中表达。
在本发明的一个实施方式中，在其细胞外部分含有细胞因子受体激活或阻断结构域的car在nk细胞或nk细胞亚组中表达。
在本发明的一个实施方式中，在通过本领域公知的方法(例如基于荧光的分离技术如
通常，用于产生表达本发明的car的工程化细胞的免疫细胞，优选t细胞，可以从受试者获得。免疫细胞，优选t细胞，可以从多种来源获得，例如外周血单核细胞(pmbc)，骨髓，淋巴结组织，脐带血或胸腺组织。为了这些细胞的富集，可以使用本领域公知的方法，例如通过ficolltm或percolltm梯度离心或阳性/阴性选择技术例如荧光分选(例如fcassort)或磁性分选(例如
示例性的，受试者的血液样品的t细胞例如用分别结合至cd4和cd8特异性抗体的磁珠进行磁性标记，洗涤，磁力富集和收集。然后将这些t细胞工程化以表达car，在它们的细胞表面上所述car在其细胞外部分含有细胞因子受体激活或阻断结构域。
在本发明的一个实施方式中，在基因修饰之前或之后，表达在其细胞外部分含有细胞因子受体激活或阻断结构域的car的分离的/富集的工程化t细胞可以使用本领域公知的方法激活并扩增以增加工程化t细胞的数量，例如用抗cd3/抗cd28珠或transactt细胞试剂(miltenyibiotec；ep2711418a1)进行多克隆刺激。优选地，所述工程化t细胞的数量增加至治疗有效量。
在本发明的一个实施方式中，表达本发明的car的细胞由编码本发明的car的rna工程化。rna可以通过本领域公知的方法(例如基于病毒的系统，物理方法，生物学方法，化学方法)转染或转导到宿主细胞中。通常，这种“rna工程化细胞”在wo2013/040557中详细公开。不考虑用于将编码本发明的car的rna转移到宿主细胞中的方法，结果是宿主细胞表达car，其在细胞外部分含有细胞因子受体激活或阻断结构域。“rna工程化细胞”在有限的时间内表达car(瞬时表达)。
在本发明的一个实施方式中，表达car的遗传修饰细胞，优选t细胞，在封闭系统中的自动化过程中产生，所述car在其细胞外部分含有细胞因子受体激活或阻断结构域。用于产生遗传修饰细胞(优选t细胞)的方法包括例如以下步骤：
a)提供细胞样品；
b)通过离心制备细胞样品；
c)磁性分离细胞，优选t细胞；
d)使用调节剂激活富集的细胞，优选t细胞；
e)对细胞(优选t细胞)进行遗传修饰以表达本发明的car；
f)在培养室中扩增遗传修饰细胞，优选t细胞；
g)洗涤培养的细胞，优选t细胞。
所有这些步骤可以在封闭系统中，优选在封闭且无菌的系统中进行。该方法特别适用于制备基因修饰细胞，优选t细胞，其中富集的细胞，优选t细胞，通过使用病毒和/或非病毒载体进行基因修饰。这些步骤中的任一步可以进行多次，省略或可以按不同顺序发生。
调节剂可以选自激动性抗体和/或细胞因子。
基因修饰细胞，优选t细胞，可以在培养之前或之后通过细胞的磁性标记和磁力分离来富集，以在最终细胞产物中获得更高频率的基因修饰细胞，优选t细胞。
作为用于细胞修饰的封闭且无菌的系统，可以使用全自动细胞处理装置clinimacs
在本发明的一个实施方式中，在其细胞外部分含有细胞因子受体激活或阻断结构域的car用于治疗患有与可由本发明的car的抗原结合结构域特异性结合的抗原相关的疾病、紊乱或病症的受试者。
在本发明的一个实施方式中，本发明的car用于治疗患有癌症的受试者中的癌症。免疫细胞，例如受试者的t细胞，被分离，或者建立的免疫细胞系被使用。受试者可以患有所述癌症或可以是健康受试者。这些细胞在体外被遗传修饰以表达本发明的car。这些工程化细胞可以在体外被激活和扩增。在细胞治疗中，这些工程化细胞被输注至有需要的受体。这些细胞可以是药物组合物。受体中的输注的细胞可以能够杀灭癌细胞(或至少停止其生长)，所述癌细胞表达被本发明的car的抗原结合结构域识别的抗原。受体可以是从其获得细胞的同一受试者(自体细胞疗法)或可以是来自同一物种的另一受试者(异基因细胞疗法)。
在本发明的一个实施方式中，患有癌症的受试者可以用与免疫调节剂一起的本发明的药物组合物治疗，所述免疫调节剂例如但不限于雷帕霉素或细胞激活检查点靶向药物。
在本发明的一个实施方式中，受试者可以另外(同时或随后)用经典化疗治疗。适用于治疗癌症的经典化疗剂是本领域公知的。
被工程化以表达具有在其细胞外部分含有细胞因子受体激活结构域的car的免疫细胞，优选t细胞，可以单独施用，或作为与稀释剂和/或其他组分或细胞群组合的药物组合物施用。简而言之，本发明的药物组合物可以包含如本文所述的遗传修饰细胞的细胞群，与一种或多种药学上或生理学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂组合。这样的组合物可以包含缓冲液，例如中性缓冲盐水、磷酸盐缓冲盐水等；碳水化合物例如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖、甘露糖醇；蛋白质；多肽或氨基酸例如甘氨酸；抗氧化剂；螯合剂例如edta或谷胱甘肽；佐剂(例如氢氧化铝)；和防腐剂。
优选地，本发明的组合物配制成用于静脉内施用。向受试者施用细胞组合物(细胞群)可以以本领域公知的任何方便的方法进行。
本发明的药物组合物可以以适用于待治疗疾病的方式施用。适合的剂量可以通过临床试验确定。但是施用的数量和频率也将由诸如患者状况和患者疾病的类型和严重程度等因素决定和影响。
包含免疫细胞，优选本文公开的t细胞的药物组合物可以以104至109细胞/kg体重，优选105至106细胞/kg体重的剂量施用。细胞组合物也可以以这些剂量多次施用。细胞的组合物可以直接注射至肿瘤、淋巴结或感染部位。
可以使用本领域已知的方法将细胞激活并扩增至治疗有效量。
本发明的细胞可以与例如化学疗法、放射疗法、免疫调节剂、抗体或抗体疗法组合使用。
定义
除非另有定义，否则本文使用的技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。
通常，car可以包含包含抗原结合结构域的细胞外结构域(细胞外部分)、跨膜结构域和细胞内信号传导结构域。细胞外结构域可以通过接头连接至跨膜结构域。细胞外结构域也可以包含信号肽。本发明的car的细胞外部分还包含如本文所公开的细胞因子受体激活或阻断结构域。"信号肽"指肽序列，其指导蛋白质在细胞内的转运和定位例如至某个细胞器(例如内质网)和/或细胞表面。
"抗原结合结构域"指特异性地结合至抗原(并从而能够靶向含有抗原的细胞)的car的区域。本发明的car可以包含一个或多个抗原结合结构域。通常，car上的靶向区域是细胞外的。抗原结合结构域可以包含抗体或其片段。抗原结合结构域可以包含例如全长重链、fab片段、单链fv(scfv)片段、二价单链抗体或双抗体。特异性结合至给定抗原的任何分子，例如来自天然存在的受体的亲和体或配体结合结构域，可以用作抗原结合结构域。通常抗原结合结构域是scfv。通常，在scfv中，免疫球蛋白重链和轻链的可变区通过柔性接头融合以形成scfv。这种接头可以是例如"(g4/s1)3-接头"。
在一些情况下，有益的是抗原结合结构域衍生自其中将使用car的相同物种。例如，当计划将其治疗地在人类中使用时，可以有益的是car的抗原结合结构域包含人或人源化抗体或其片段。人或人源化抗体或其片段可以通过本领域公知的各种方法制备。
本文所使用的"间隔区"或"铰链"指位于抗原结合结构域和跨膜结构域之间的亲水区域。本发明的car可以包含细胞外间隔子结构域，但是也可以通过这样的间隔子。间隔子可以包括抗体或其片段的fc片段、抗体或其片段的铰链区、抗体的ch2或ch3区、辅助蛋白、人工间隔子序列或其组合。间隔子的著名实例是cd8α铰链。
car的跨膜结构域可以衍生自这样的结构域的任何期望的天然或合成来源。当来源是天然的，结构域可以衍生自任何膜结合或跨膜蛋白。跨膜结构域可以衍生自例如cd8α或cd28。当如上所述关键信号传导和抗原识别模块是在两个(或甚至更多个)多肽上时，则car可以具有两个(或更多个)跨膜结构域。由于car的每个多肽中的小分子依赖性异源二聚化结构域，分离关键信号传导和抗原识别模块使得能够对car细胞表达进行小分子依赖的、可滴定的和可逆的控制(wu等，2015,science350:293-303)。
car的细胞质结构域或细胞内信号传导结构域负责激活其中表达car的免疫细胞的至少一种正常效应功能。"效应功能"指细胞的专门功能，例如在t细胞中，效应功能可以是细胞溶解活性或辅助活性，包括细胞因子的分泌。细胞内信号传导结构域是指转导效应功能信号并指导表达car的细胞以执行专门功能的蛋白质的部分。细胞内信号传导结构域可以包括足以转导启动或阻断免疫细胞效应功能的信号的给定蛋白的细胞内信号传导结构域的任何完整的、突变的或截短的部分。
用于car的细胞内信号传导结构域的著名实例包括t细胞受体(tcr)的细胞质信号传导序列和在抗原受体接合后启动信号转导的共受体。
通常，t细胞激活可以由两种不同类型的细胞质信号传导序列介导，首先是通过tcr启动抗原依赖性初级激活的那些(初级细胞质信号传导序列)，其次是以抗原非依赖性方式起作用以提供次级或共刺激信号的那些(次级细胞质信号传导序列，共刺激信号传导结构域)。因此，car的细胞内信号传导结构域可以包含初级细胞质信号传导结构域和/或次级细胞质信号传导结构域。
以刺激方式起作用的初级细胞质信号传导序列可以含有itam(基于免疫受体酪氨酸的激活基序信号传导基序)。
在car中常用的含有初级细胞质信号传导序列的itam的实例是衍生自tcrζ(cd3ζ)、fcrγ、fcrβ、cd3γ、cd3δ、cd3ε、cd5、cd22、cd79a、cd79b和cd66d的那些。最著名的是衍生自cd3ζ的序列。
car的细胞质结构域可以被设计为包含cd3-ζ信号传导结构域自身或与任何其他期望的细胞质结构域结合。car的细胞质结构域可以包含cd3ζ链部分和共刺激信号传导区。共刺激信号传导区指包含共刺激分子的细胞内结构域的car的一部分。共刺激分子是除抗原受体或其配体以外的细胞表面分子，其是淋巴细胞对抗原的有效应答所需的。共刺激分子的实例是cd27、cd28、4-1bb(cd137)、ox40、cd30、cd40、pd-1、icos、淋巴细胞功能相关抗原-1(lfa-1)、cd2、cd7、light、nkg2c、b7-h3。
car的细胞质信号传导部分内的细胞质信号传导序列可以按随机或特定顺序用或不用接头相互连接。短寡肽或多肽接头，其优选为2至10个氨基酸长度，可以形成连接。著名的接头是甘氨酸-丝氨酸双联体。
作为实例，细胞质结构域可以包含cd3-ζ的信号传导结构域和cd28的信号传导结构域。在另一个实例中，细胞质结构域可以包含cd3-ζ的信号传导结构域和cd27的信号传导结构域。在另一个实例中，细胞质结构域可以包含cd3-ζ的信号传导结构域，cd28的信号传导结构域和cd27的信号传导结构域。
如上所述，出于分离car的关键信号传导和抗原识别模块的目的，car的细胞外部分或跨膜结构域或细胞质结构域也可以包含异源二聚化结构域。
本发明的car(包含细胞因子受体激活或阻断结构域的car)可以被设计为包含导致功能性car的任何组合的本文所述的上述结构域的任何部分或部分。示例性的，本发明的car可以具有seqidno:3的氨基酸序列。
本发明的car可以是具有至少双特异性的car，其包含细胞外部分，至少一个细胞内信号传导结构域，和至少一个跨膜结构域，其中所述car的细胞外部分包含a)至少一个抗原结合结构域，和b)至少一个细胞因子受体激活或阻断结构域，其中所述至少一个抗原结合结构域对靶细胞的抗原是特异性的(第一特异性)，和其中所述至少一个细胞因子受体激活或阻断结构域对不是所述抗原的细胞因子受体是特异性的(第二特异性)。
本发明的car，其包含作为car的细胞外部分的模块的至少一个细胞因子受体激活或阻断结构域，例如感兴趣的至少一个细胞因子，是反式激活car。反式激活car当表达在白血细胞(例如t细胞)表面时，指导对抗表达由反式激活car的所述至少一个抗原结合结构域识别的抗原的靶细胞的那些细胞的反式活性。反式活性指本发明的car的特征，即本发明的car包含至少一个结构域，即细胞因子受体激活或阻断结构域，其当在白血细胞表面上表达时，在靶细胞上，在表达所述car的白血细胞上或在另一个细胞上触发活性，其中所述触发的活性是独立于所述car的抗原结合结构域对靶细胞的抗原的结合。所述触发的活性可以是细胞因子受体的激活，导致例如给定细胞因子的释放(当所述结构域是细胞因子受体激活结构域时)，或可以是细胞因子受体的阻断，例如导致给定细胞因子的释放的减少或抑制(当所述结构域是细胞因子受体阻断结构域时)。当两个或更多个细胞因子受体激活或阻断结构域用于本发明的car中时，可以进一步影响反式活性的效果。具有例如两个相同的细胞因子受体激活或阻断结构域的car可以增强反式活性的效果。具有例如两个不同细胞因子受体激活或阻断结构域的car可以使反式活性的效果多样化，因为这种car的每个细胞因子受体激活或阻断结构域可以触发靶细胞上、表达所述car的白血细胞上或另一个细胞上的不同活性。
细胞因子是细胞信号传导中重要的广泛而零散种类的小蛋白质(约5-20kda)。它们由细胞释放并影响其他细胞的行为。细胞因子包括趋化因子、干扰素、白细胞介素、淋巴因子和肿瘤坏死因子。细胞因子由广泛的细胞产生，其包括免疫细胞如巨噬细胞、b淋巴细胞、t淋巴细胞和肥大细胞，以及内皮细胞、成纤维细胞和各种基质细胞；给定的细胞因子可以由多于一种类型的细胞产生。
它们通过受体起作用，并且在免疫系统中尤其重要；细胞因子调节基于体液和基于细胞的免疫应答之间的平衡；并且它们调节特定细胞群的成熟、生长和应答性。一些细胞因子以复杂的方式增强或抑制其他细胞因子的作用。它们在健康和疾病中很重要，特别是在宿主对感染、免疫应答、炎症、创伤、败血症、癌症和生殖的响应中。
每个细胞因子具有匹配的细胞表面受体。细胞内信号传导的后续级联然后改变细胞功能。这可以包括多个基因及其转录因子的上调和/或下调，导致其他细胞因子的产生，其他分子的表面受体的数量的增加，或通过反馈抑制而抑制其自身作用。
给定细胞因子对给定细胞的作用取决于细胞因子、其浓度、细胞表面上互补受体的存在以及由受体结合激活的下游信号；这最后两个因素可以因细胞类型而异。
白细胞介素12(il-12)是由树突细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞和人类b-淋巴母细胞(nc-37)响应抗原刺激而天然产生的细胞因子。它是由两个独立基因il-12a(p35)和il-12b(p40)编码的异源二聚体细胞因子。p40的活性异源二聚体(称为“p70”)和同源二聚体在蛋白质合成后形成。il-12参与初始t细胞向thl细胞的分化。它被称为t细胞刺激因子，其可以刺激t细胞的生长和功能。它刺激来自t细胞和自然杀伤(nk)细胞的干扰素-γ(ifn-γ)和肿瘤坏死因子-α(tnf-α)的产生，并降低il-4介导的ifn-γ的抑制。产生il12的t细胞具有共受体cd30，其与il-12活性相关。il-12在自然杀伤细胞和t淋巴细胞的活性中起重要作用。il-12介导nk细胞和cd8+细胞毒性t淋巴细胞的细胞毒活性的增强。
il-12与il-12受体结合，其是由il-12r-β1和il-12r-β2形成的异源二聚体受体。il-12r-β2被认为在il-12功能中起关键作用，因为它在激活的t细胞上被发现。
如本文所使用的术语“细胞因子受体激活或阻断结构域”指作为本文公开的car的部分的氨基酸序列，其能够结合并激活或阻断细胞因子受体。细胞因子受体激活结构域可以是细胞因子激动剂。通过car的匹配细胞因子受体激活结构域的特定细胞因子受体的激活导致所述细胞因子受体固有的给定下游信号的激活。细胞因子受体激活结构域的氨基酸序列可以包含细胞因子的全长氨基酸序列，或可以包含在氨基酸序列水平上与所述细胞因子具有至少70％，或至少75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％的序列同一性的序列。在本发明的上下文中，“序列同一性”可以使用本领域公知的氨基酸序列的比对程序使用成对比对来测定。
但是细胞因子激活结构域的氨基酸序列也可以是细胞因子的变体，其具有一些氨基酸缺失、添加、置换或以天然细胞因子以外的另外顺序排列，同时仍然保留天然全长细胞因子的功能。细胞因子受体激活结构域的氨基酸序列也可以是全长细胞因子的功能片段，或全长细胞因子的片段，其在氨基酸序列水平上与所述细胞因子具有至少70％，或至少75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％的序列同一性。在该上下文中，“功能的”指片段能够以足以导致所述细胞因子受体固有的下游信号的激活的方式结合至并激活细胞因子受体。优选地，细胞因子受体激活结构域可以是细胞因子或其片段的氨基酸序列，其可以结合并激活细胞因子受体。
细胞因子受体阻断结构域可以是细胞因子拮抗剂。通过car的匹配细胞因子受体阻断结构域的特定细胞因子的阻断或抑制导致所述细胞因子受体固有的给定下游信号的阻断和/或抑制。细胞因子受体阻断结构域的氨基酸序列可以是细胞因子的变体，其具有一些氨基酸缺失、添加、置换或以天然细胞因子以外的另外顺序排列，由此丧失所述天然细胞因子激活匹配细胞因子受体的功能，但保存所述天然细胞因子与匹配细胞因子受体结合的功能。细胞因子受体阻断结构域的氨基酸序列也可以是全长细胞因子的非功能片段，或全长细胞因子的片段，其在氨基酸序列水平上与所述细胞因子具有至少70％，或至少75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％的序列同一性。在该上下文中，“非功能的”是指片段能够以足以导致所述细胞因子受体固有的给定下游信号的激活的方式结合但不激活细胞因子受体。
术语“抗原”指特别是可以是可溶性或细胞膜结合的分子实体，但不限于可以通过适应性免疫系统识别的分子实体，包括但不限于抗体或tcr，或工程化分子，包括但不限于转基因tcr、car、scfv或其多聚体、fab片段或其多聚体、抗体或其多聚体、单链抗体或其多聚体、或可以以高亲和力执行结合至结构的任何其他分子。肿瘤抗原可以根据其表达模式分为两类：肿瘤特异性抗原(tsa)，其仅存在于肿瘤细胞上而不存在于任何其他细胞上，和肿瘤相关抗原(taa)，其存在于一些肿瘤细胞上，也存在于一些正常细胞上。
本文所使用的术语“靶细胞”指在其细胞表面上表达抗原的细胞，其应该被car的抗原结合结构域识别(结合)。
癌胚抗原(cea；cd66e)描述了一组参与细胞粘附的高度相关的糖蛋白。cea在胎儿发育期间在胃肠组织中产生，并且存在于成人的胃肠和肺上皮的腔位置。可溶性cea在健康个体的血清中被发现，并在炎症和恶性疾病期间增加，特别是在具有胃肠道腺癌、乳腺癌、卵巢癌等的患者中。
car(多肽)、编码car的核酸分子、重组表达载体、表达car的细胞和表达car的细胞群可以被分离和/或纯化。例如，纯化的(或分离的)细胞制备物是其中细胞群比体内其天然环境中的细胞群更纯的细胞制备物。这种细胞可以例如通过标准纯化技术例如细胞磁性分离方法如
在一些实施方式中，细胞的制备物被纯化，使得细胞占制备物的总细胞含量的至少约50％，例如至少约70％。例如，纯度可以是至少约50％，可以是大于约60％，约70％或约80％，或可以是约100％。
术语"肿瘤"在医学上被称为瘤(neoplasm)。不是所有肿瘤都是癌性的；良性瘤不侵入临近组织，也不传播整个身体。
术语"癌症"在医学上被称为恶性瘤。癌症是一组涉及未调节的细胞生长的广泛疾病，并包括所有类型的白血病。在癌症中，细胞(癌细胞)不受控制地分裂和生长，形成恶性肿瘤并侵入身体的附近部分。癌症也可以通过淋巴系统或血流传播至身体的较远部分。有超过200种不同的影响人类的已知癌症。
术语"化学治疗"或"化疗治疗"指用一种或多种细胞毒性抗瘤药物("化学治疗剂"或"化学治疗药物")作为标准化方案的一部分的癌症(癌性细胞)的治疗。化学治疗可以以治愈意图施用，或其可以目的在于延长生命或缓解症状。它通常与其他癌症治疗，例如放射治疗、手术和/或高热治疗联合使用。传统的化学治疗剂通过杀灭快速分裂(这是大多数癌细胞的主要特性之一)的细胞起作用。这意味着化学治疗也损害正常情况下快速分裂的细胞：骨髓、消化道和毛囊中的细胞。这导致化疗的最常见副作用：骨髓抑制(血细胞产生减少，因此还有免疫抑制)、粘膜炎(消化道内衬的炎症)和秃头症(脱发)。
一些较新的抗癌药物(例如各种单克隆抗体或如本发明那些的工程化细胞)不是无差别地细胞毒性的，而是靶向在癌细胞中异常表达且对其生长必要的蛋白。这些治疗通常被称为"靶向治疗"(与经典化疗不同)，并且通常与传统的化学治疗剂一起用于抗瘤治疗方案中。免疫疗法是定义为"通过诱导、增强或抑制免疫应答的疾病治疗"的医学术语。设计用于引发或放大免疫应答的免疫疗法被归类为主动免疫疗法，而减少或抑制的免疫疗法被归类为抑制免疫疗法。癌症免疫治疗作为激活免疫疗法试图刺激免疫系统以排斥和摧毁肿瘤。过继性细胞转移使用基于细胞的(优选基于t细胞的)细胞毒性应答以攻击癌细胞(细胞疗法)。具有对患者的癌症天然或基因工程反应性的t细胞在体外产生，并然后转移回癌症患者体内。
本文使用的术语"治疗"指降低疾病的至少一种体征或症状的频率或严重程度。
术语"生物标志物"或"标志物"在本领域中广泛存在，并且可以广泛地表示其在受试者中的定性和/或定量评估对于个体的表型和/或基因型的一个或多个方面，例如关于个体的状态，是预测性或信息性(例如预测性、诊断性和/或预后性)的生物分子和/或其可检测部分(例如核酸、肽或脂质如糖脂)。
如本文所使用的，术语"受试者"指动物。优选地，受试者是哺乳动物例如小鼠、大鼠、牛、猪、山羊、鸡、狗、猴或人。更优选地，受试者是人。受试者可以是患有例如癌症的疾病的受试者(患者)，但受试者也可以是健康受试者。
如本文所使用的术语"自体的"指衍生自稍后向其重新引入的同一受试者的任何材料。
如本文所使用的术语"同种异基因"指衍生自与向其重新引入材料的受试者相同的物种的不同受试者的任何材料。
术语"治疗有效量"指在受试者中提供治疗益处的量。
关于抗体、其片段或car的抗原结合结构域的术语"特异性结合"或"对……特异性"指识别和结合特定抗原，但基本上不识别或结合样品中的其他分子的抗原结合结构域。特异性地结合来自一个物种的抗原的抗原结合结构域也可以结合来自另一物种的抗原。这种跨物种反应性与该抗原结合结构域作为特异性的定义并不矛盾。特异性结合抗原的抗原结合结构域也可以结合抗原的不同等位形式(等位变体、剪接变体、同种型等)。这种交叉反应性与该抗原结合结构域作为特异性的定义并不矛盾。
如本文所使用的术语"工程化细胞"和"基因修饰细胞"可以互换使用。这些术语指含有和/或表达外源基因或核酸序列，其进而改变细胞或其后代的基因型或表型。特别是，这些术语指细胞，优选t细胞，可以通过本领域公知的重组方法操纵以稳定或瞬时地表达在天然状态下这些细胞中不表达的肽或蛋白质。例如，t细胞被工程化以在其细胞表面表达人工构建体，例如嵌合抗原受体。例如，car序列可以使用逆转录病毒或慢病毒递送至细胞中。
术语"免疫细胞"或"免疫效应细胞"指可以是免疫系统的一部分并执行特定效应功能的细胞，例如α-βt细胞、nk细胞、nkt细胞、b细胞、先天淋巴样细胞(ilc)、细胞因子诱导的杀伤(cik)细胞、淋巴因子激活的杀伤(lak)细胞、γ-δt细胞、间充质干细胞或间充质基质细胞(msc)、单核细胞或巨噬细胞。优选的免疫细胞是具有细胞毒效应功能的细胞，例如α-βt细胞、nk细胞、nkt细胞、ilc、cik细胞、lak细胞或γ-δt细胞。"效应功能"指细胞的专门功能，例如在t细胞中，效应功能可以是细胞溶解活性或辅助活性，包括细胞因子的分泌。
如本文所使用的术语"封闭系统"指任何封闭系统，其在进行培养过程例如新材料的引入以及进行细胞培养步骤例如细胞的增殖、分化、激活、遗传修饰和/或分离的同时降低细胞培养物污染的风险。这样的系统允许在gmp或gmp样条件("无菌")下操作，其导致临床可适用的细胞组合物。封闭系统的实例是clinimacs
如本文所使用的术语"自动化方法"或"自动化过程"指通过设备和/或计算机和计算机软件的使用而自动化，否则会或可以由操作员手动执行的任何过程。已经自动化的方法(过程)需要较少的人工干预和较少的人员交付时间。在一些情况下，如果方法的至少一个步骤在没有任何人支持或干预下进行，则该方法是自动化的。优选地如果方法的所有步骤在没有人支持或干预下进行，则该方法是自动化的。
通过以下实施例进一步说明本发明，其不以任何方式解释为对其范围施加限制。
实施例
实施例1：在t细胞亚组中具有il-12受体激活结构域的car(以下称：il12-car)的表达。
用il12-car移植外周血t细胞。
t细胞是从外周血通过ficoll分离，分别在激动性抗cd3和抗cd28抗体(各100ng/ml)和500u/mlil2存在下激活。激活的t细胞用编码il12-car或不含il12受体激活结构域的car的载体逆转录病毒转导(图1)。两种car的抗体衍生抗原结合结构域都定向针对cea肿瘤抗原。转导的t细胞用抗cd3mab和抗人igg抗体染色以监测car表达(图2)。il12-car在外周t细胞中表达，其效率与没有il12受体激活结构域的car相似。
il12-car在不同t细胞亚组中表达。
如上所述外周t细胞用il12-car转导。分别使用抗cd4和抗cd8抗体监测cd4和cd8t细胞中car的表达，以及抗人iggfc抗体监测car表达(图3)。我们检测到大量的表达il12-car的cd4和cd8t细胞。与没有il12受体激活结构域的car相比，其在cd8+t细胞中更有效地表达，il12-car在cd4+和cd8+t细胞亚组中以相似的效率表达。
结论：
il12-car在原代外周t细胞中有效地表达。由此，il12-car在cd4和cd8t细胞以相似效率表达，使得两种t细胞亚组被il12-car重定向。
实施例2：il12-car诱导工程化t细胞的cd56+cd62l+表型。
t细胞从外周血中分离，分别在激动性抗cd3和抗cd28mab(各100ng/ml)和500u/mlil存在下激活。激活的t细胞是根据标准操作方案用编码il12-car或用作对照的没有细胞因子受体激活结构域的car的载体来逆转录病毒地转导。转导的t细胞培养9天并用抗cd3、抗cd56和抗cd62l抗体染色(图4)。il12-car优先地诱导il12-cart细胞的cd56+cd62l+表型。
结论：
il12-car转导的t细胞的表型类似于被报道为获得改善的治疗潜力的il12成熟的nk/nkt细胞的表型(lehmandd等.,plosone9,e87131,2014)。
实施例3：il12-car信号传导导致改善的ifn-γ分泌。
ifn-γ分泌对于过继转移的cart细胞的有效抗肿瘤应答是重要的。因此，具有高ifn-γ诱导能力的car对于临床应用将是有价值的。为了测试il12-car的ifn-γ分泌特性，如上所述将来自外周血的t细胞分离并转导以表达il12-car和用于比较的没有细胞因子受体结合结构域的car。将cart细胞分别与cea+ls174t和cea-colo320肿瘤细胞共培养48小时，并通过elisa记录ifn-γ分泌。表达il12-car的t细胞在抗原遭遇时比具有无il12受体激活结构域的car的t细胞分泌实质上更多的ifn-γ(图5)。此外，即使在抗原不存在的情况下，il12-cart细胞分泌将调节肿瘤环境以变得更易感于细胞免疫攻击的ifn-γ。
结论：
由于通过car-信号传导结构域和il12受体激活结构域的协同信号传导，il12-car改善了细胞因子分泌特性。促炎细胞因子的改善的分泌将适用于重编程肿瘤微环境以招募另外的过继性和先天性抗肿瘤反应性。
实施例4：il12-car改善肿瘤细胞杀灭。
将来自外周血的t细胞工程化以表达il12-car或用于比较的不含细胞因子受体激活结构域的野生型car。将cart细胞(0.625×10(4)-5×10(4)/孔)分别与cea+ls174t和难杀性skov3肿瘤细胞，或者cea-colo320肿瘤细胞(各2.5×10(4)/孔)共培养48小时。通过基于四唑盐的xtt试验来记录肿瘤细胞活力，并且如下计算百分比细胞毒性：细胞毒性[％]＝100-活力[％]。尽管分别具有野生型car和il12-car的t细胞以相似的效率裂解cea+ls174t肿瘤细胞，但il12-cart细胞以比没有il12受体激活结构域的cart细胞高得多的效率杀灭skov3肿瘤细胞(图6)。相比之下，cea肿瘤细胞不被cart细胞杀灭，其表明car的抗原特异性。skov3肿瘤细胞的改善的杀灭是部分由于car和il12受体激活结构域的同时信号传导，因为用针对car结合结构域的抗独特型抗体和外源il12刺激野生型car改善了没有il12受体激活结构域的cart细胞对skov3细胞的杀灭。令人惊讶的是，il12-car仍然更有效，并且外源il12和抗独特型抗体的额外刺激并不进一步增强skov3细胞的杀灭(图7)。
结论：
il12-car改善靶细胞的杀灭，特别是较不易感于t细胞攻击的肿瘤细胞，如sokv3卵巢肿瘤细胞等。另一方面，如通过与cea-colo320肿瘤细胞共培养所证明的，il12-cart细胞的改善的杀灭特性并不导致靶细胞的总体非特异性杀灭。由于改善的溶细胞性抗肿瘤活性不是通过分别同时施用car的抗原结合结构域的激动性配体和il12受体而诱导，我们得出结论，改善的skov肿瘤细胞的靶向是由于修饰的il12-cart细胞本身的内在特性，而不仅仅是由于不同t细胞激活剂的组合。
实施例5：il12car介导的t细胞激活优于cart细胞激活和同时的il2和il12刺激。
il2和il12协同地增强t细胞对抗肿瘤细胞的功能。我们测试了对针对skov3肿瘤细胞的il12-car和cart细胞的靶细胞裂解分别同时施用外源il2和il12。我们发现外源il2和il12对car介导的skov3细胞的裂解没有影响。此外，与cart细胞相比，il12-cart细胞证实优异的skov3细胞裂解，与是否存在外源il2或il12或il2和il12两者无关(图8)。
结论：
il12-car诱导优异的skov3肿瘤细胞的细胞裂解，所述细胞裂解不受外源促炎细胞因子如il2和il12或两者组合的调节。此外，改善的靶细胞裂解看起来是由于il12-car的固有特性。
实施例6：il12cart细胞抑制免疫缺陷rag-/-普通γ-/-小鼠中建立的skov3肿瘤的体内生长。
根据sop将t细胞工程化以表达il12-car和没有il12受体激活结构域的car，并通过facs监测car表达。将rag-/-普通γ-/-小鼠用5×10(6)个skov3肿瘤细胞/小鼠移植。7天后，将一个剂量的1×10(7)个总t细胞/小鼠注射至具有建立的肿瘤的小鼠的尾静脉中。cart细胞的数量分别是14％(抗cea-car)和9％(抗cea-il12-car)。每隔2-3天记录肿瘤生长并测定肿瘤体积(图9)。然而car修饰的t细胞和没有car的t细胞并不有效抑制肿瘤生长，而il12-cart细胞显著抑制skov3肿瘤的生长。
结论：
il12-cart细胞抑制skov3细胞的肿瘤生长，其表明持续的体内抗肿瘤反应性。
实施例7：具有对muc1的特异性的il-12car
对il-12car工程化，其含有抗muc1scfv作为car靶向结构域而不是抗cea靶向结构域(图10)。car与抗ceacar具有相同的模块组成，然而具有不同的靶向特异性(参见图1)。为了对比，将抗muc1car工程化为没有整合的il-12。
将来自外周血的t细胞逆转录病毒转导以分别表达抗cea-il12-car或抗muc1-il12-car。分别利用检测共同的细胞外间隔子结构域的抗人igg抗体和抗cd3抗体通过流式细胞术检测t细胞表面上的car以验证t细胞(图11)。
结论：
在逆转录病毒转导后，t细胞分别在细胞表面上表达抗cea-il12car和抗muc1-il12car。
实施例8：抗muc1il12-car改善了抗原接合后的t细胞激活。
将抗muc1-il12-cart细胞分别与muc1+ls174t和muc1-colo320肿瘤细胞共培养48小时。48小时后，在muc1+肿瘤细胞的接合后，通过elisa在il12-cart细胞的上清液中记录到比没有il12的cart细胞中更多的ifn-γ(图12)。在muc1肿瘤细胞存在下il12-cart细胞释放一些ifn-γ，表明il12-cart细胞对抗原非依赖性ifn-γ分泌的诱导，而cart细胞不是这样。
为了测定细胞溶解活性，将抗muc1-il12-cart细胞和抗muc1-cart细胞分别在体外与muc1+mcf7乳腺癌细胞一起在增加的细胞数中共同孵育并记录肿瘤细胞存活。如图13所概述的，在低t细胞数量下，抗muc1-il12-cart细胞比抗muc1-cart细胞更有效地裂解mcf7细胞。由于没有car的t细胞不产生剂量依赖性细胞溶解，car特异性地介导mcf7细胞的杀灭。
结论：
il12-car显示出改善的抗原依赖性t细胞激活，如与具有相同特异性但不含有il12的cart细胞相比，增加的ifn-γ释放和细胞溶解活性所表示的。在抗原不存在下，il12-cart细胞释放ifn-γ，然而其低于在car同源抗原存在下。
实施例9：il12-cart细胞的特异性肿瘤细胞裂解
分别将抗muc1-il12-car、抗cea-il12cart细胞和用作对照的未修饰t细胞与cea+muc1+ls174t和mcf7或cea-muc1-colo320肿瘤细胞共培养。48小时后测定细胞溶解活性(图13)。具有抗cea-il12car的t细胞消除了cea+ls174t和mcf-7细胞，但不消除cea-colo320细胞。因此，具有抗muc1-il12car的t细胞消除了muc1+ls174t和mcf-7细胞，但不消除muc1-colo320细胞。对于比较，未修饰的t细胞对靶细胞不表现出显著的细胞溶解活性。
结论：
具有整合的il12结构域的抗cea和抗muccar介导靶细胞的抗原特异性和剂量依赖性杀灭。
实施例10：抗cea-il12cart细胞不裂解cea-正常成纤维细胞。
我们论证了il12-car诱导的对工程化t细胞(参见图4)的nkt细胞表型的变化是否伴随着健康细胞的抗原非依赖性裂解。将具有抗cea-car、抗cea-il12-car的t细胞和未转导的t细胞与cea-正常成纤维细胞和用于比较的cea+ls174t和cea-colo320肿瘤细胞共培养。48小时后记录细胞活力(图14)。数据证实具有抗cea-il12-car的t细胞优先裂解cea+肿瘤细胞，而cea-成纤维细胞和cea-肿瘤细胞基本上没有受到影响。
结论：
具有抗cea-il12-car的t细胞在体外不消除正常的健康成纤维细胞。
实施例11：在末端位置具有il7的car。
我们工程化了第二原型的细胞因子car，具有两个改变；含有il7而不是il12，并在分子的末端位置具有细胞因子(图15)。car具有由bw431/26scfv提供的对cea的靶向特异性。il7和抗ceascfv通过gly-ser接头连接。
在逆转录病毒转导后，如通过流式细胞术显示的，具有对cea的特异性的il7-car通过人外周血t细胞表达。没有il7的抗ceacar由t细胞表达用于比较。
结论：
具有il7和末端位置的细胞因子的细胞因子car被修饰的t细胞有效地表达。
实施例12：具有il7-抗ceacar的cd8+t细胞的优先扩增
我们论证了具有il7-抗-ceacar的t细胞在存活和/或扩增方面是否具有优势。用il7-抗ceacar和用于比较的不含il7的抗ceacar工程化t细胞。在il2存在下48小时后，cart细胞的频率相同，然而，在144小时后，具有il7-抗ceacar的t细胞的频率高于具有不含il7的抗ceacar的t细胞的频率(图17a)。具有il7-抗ceacar的cd4+和cd8+t细胞两者在体外以比具有抗ceacar的t细胞更高的效率扩增。此外，cd8+cart细胞增加至比cd4+t细胞更高的频率(图17b)。
结论：
数据证实与不含il7的cart细胞相比，具有il7car的t细胞的优先扩增。在扩增和/或存活方面，cd8+t细胞特别地确实受益于il7car。
实施例13：具有il7-抗ceacar的t细胞的改善的细胞溶解活性
将来自外周血的人t细胞分别用il7-抗ceacar和不含il7的抗ceacar工程化。未修饰的t细胞用作对照。将t细胞与cea+ls174t细胞和cea-colo320细胞共孵育，并在48小时后测定肿瘤细胞的活力。
结论：
数据证实il7-抗cea-cart细胞对抗原阳性肿瘤细胞的抗原特异性和有效裂解；抗原阴性细胞未被裂解。