金刚砂辅助农杆菌转化狗尾草种子的高效转化方法与流程

本发明属生物
技术领域：
,涉及一种狗尾草农杆菌高效转化方法,具体是一种金刚砂辅助农杆菌转化狗尾草种子的高效转化方法。
背景技术：
：C4光合作用是驱动几种主要粮食作物和生物能源草类的生产力，包括玉米(Zeamays)、甘蔗(Saccharumofficinarum)、高粱(Sorghumbicolor)、芒草(Miscanthusgiganteus)和柳枝稷(Panicumvirgatum)等。狗尾草(Setariaviridis)是一个真正的二倍体，具有许多适于遗传分析的特性，包括相对较小的基因组(510Mb)，身材矮小，生命周期短和种子量大等等，因此，狗尾草是研究C4光合作用的优秀模型，同时也是研究非生物胁迫耐受性和生物能源原料的模型。狗尾草在形态上类似于大多数禾本科草，包括主要生物能源作物柳枝稷(Panicumvirgatum)和芒草(Miscanthusgiganteus)等，在地理上广泛分布，并且占据多样化的生态位。目前，狗尾草的转基因技术主要采用成熟种子发芽后，从幼芽节点分生组织处诱导胚性愈伤组织进行农杆菌转化，这种方法的最大问题是胚性愈伤组织诱导率低，因品系和种子状况不同，一般胚性愈伤组织诱导数与种子数的比率都小于10％；其次是胚性愈伤组织诱导时间较长，从接种子到培养基获得第一阶段的少量胚性愈伤组织需要约一个月时间，之后需要继代2次(每半月继代一次)后才有足够的胚性愈伤组织用于农杆菌转化，整个转化周期需要约4个月时间；同时，这种胚性愈伤组织不耐继代，不能长期继代保存用于转化，继代3次以上的胚性愈伤组织转化效率明显降低，不适合继续用于转化；此外，胚性愈伤组织的挑选需要有一定的经验。这些都降低了这套转化技术的灵活性和简单实用性。作为重要的模式植物，为狗尾草建立更简单、灵活、周期短、高效的转基因技术已成为相关领域的研究方向。技术实现要素：本发明的目的是针对现有技术的不足而提供一种金刚砂辅助农杆菌转化狗尾草种子的高效转化方法，以狗尾草成熟种子为外植体，诱导露芽后用金刚砂进行创伤处理，处理后用农杆菌进行浸染，经共培养、抑菌、筛选与植株再生得到转基因植株，具有简单、灵活、快速、高效等特点。本发明所采用的技术方案：一种金刚砂辅助农杆菌转化狗尾草种子的高效转化方法，其具体步骤如下：1、外植体的处理和活化选取经休眠处理的狗尾草干燥成熟种子，将去除种皮后的种子装入离心管，用有效浓度为1～3％的次氯酸钠溶液灭菌消毒处理，无菌水清洗后，按质量体积比：种子：芽诱导液体培养基＝1:6～8的比例在离心管中加入芽诱导液体培养基，振荡培养1～7天，培养条件：光培养，培养温度24～26℃。所述芽诱导液体培养基是以MS培养基为基础培养基，其中微量元素含量加倍，pH值为5.0～6.0，并添加激素；所述激素是2,4-D、Dicamba、KT、6-BA中的一种或多种，其添加量分别为：10mg/L以下。2、金刚砂创伤处理及农杆菌浸染按照种子体积称取等量的中等目度的金刚砂(即按体积比：种子：金刚砂＝1:1)，高温灭菌处理，倒掉离心管中的芽诱导液体培养基，加入金刚砂,然后加入少量含有0.6～1.0OD600nm农杆菌的浸染培养基,在涡旋振荡器下高速处理2～3分钟，再加入含农杆菌的浸染培养基，使含农杆菌的浸染培养基的总体积为种子体积的8～12倍(即按体积比：种子：浸染农杆菌液＝1:8～12)，低速振荡浸染0.5～1小时，培养条件：光培养，培养温度24～26℃。所述浸染培养基是以MS培养基为基础培养基，其中大量元素含量减半，微量元素含量加倍，PH值为5.0～6.0，添加激素、乙酰丁香酮(Acetosyringone)20～60mg/L、表面活性剂0.1～1％(如Synperonic,质量体积比)；所述激素是2,4-D、Dicamba、KT、6-BA中的一种或多种，其添加量分别为：10mg/L以下。3、共培养将浸染后的种子接到带滤纸的共培养培养基上，暗培养3～9天，培养温度在20～28℃之间(可根据使用的不同农杆菌菌株进行调整)。所述共培养培养基是以MS培养基为基础培养基，其中大量元素含量减半，微量元素含量加倍，pH值为5.0～6.0，添加激素、乙酰丁香酮(Acetosyringone)20～60mg/L；所述激素是2,4-D、Dicamba、KT、6-BA中的一种或多种，其添加量分别为：10mg/L以下。4、抑菌和筛选培养将共培养后的种子接到抑菌和筛选培养基上进行筛选，筛选分两个阶段：第一阶段，先在抑菌和筛选培养基中添加筛选剂的半致死计量，筛选1周；第二阶段，将经过第一阶段筛选的种子继代到添加筛选剂全致死计量的抑菌和筛选培养基中，筛选3～4周。培养条件：先暗培养，最后1～2周光培养，培养温度24～26℃。所述抑菌和筛选培养基是以MS培养基为基础培养基，其中微量元素含量加倍，pH值为5.0～6.0，添加激素、抑制农杆菌的抗生素100～500mg/L(如Timentin)；所述激素是2,4-D、Dicamba、KT、6-BA中的一种或多种，其添加量分别为：10mg/L以下。5、抗性愈伤成苗培养将经过筛选阶段诱导的胚性愈伤组织继代到成苗培养基上，培养条件：光培养，培养温度24～26℃，培养时间2～4周。所述成苗培养基是以MS培养基为基础培养基，其中有机元素和微量元素含量加倍，蔗,15～20g/L，pH值为5.0～6.0，添加激素、抑制农杆菌的抗生素100～500mg/L(如Timentin)，不添加或添加筛选剂半致死计量。所述激素是2,4-D、KT、6-BA中的一种或多种，其添加量分别为：10mg/L以下。6、生根培养将在成苗培养基上再生的达到1cm以上的芽单独取出，接到生根培养基上进行生根培养，培养条件：光培养，培养温度24～26℃，培养时间1～2周。所述生根培养基是以MS培养基为基础培养基，其中大量元素含量减半，蔗糖含量减半，pH值为5.0～6.0，添加筛选剂半致死计量，添加或不添加IBA，其添加量为：10mg/L以下。本发明步骤简单，易操作，以成熟的狗尾草种子为外植体，种子经发芽活化处理后，用金刚砂辅助造成伤口，进行农杆菌转化，大大提高了狗尾草的转化效率，缩短了转化周期，简化了转化程序，扩大了转化品系的范围，为狗尾草建立了一种灵活、周期短、高效的转基因技术体系。附图说明图1是用于转化的pZmUbi-GUS(ZmUbis-HPH)质粒载体图。图2是狗尾草不同品系(A10,ME34)种子金刚砂(emery)辅助处理时共培养不同阶段(3天，5天，7天，9天)GUS基因瞬时表达差异图。A10、ME34品系左边的都为不使用金刚砂辅助的转化效果，右边都为使用金刚砂辅助效果；使用金刚砂辅助种子转化的效率明显高于不使用的：当共培养3天时，金刚砂处理的种子幼芽都已GUS染色，转化基因的瞬时表达效果非常强，而没有金刚砂处理的种子幼芽几乎没有被染色，瞬时表达效果很差，随着共培养时间的延长，非处理的种子瞬时表达情况有增加，但都远远不如金刚砂处理的表达效果。图3是pZmUbi-GUS(ZmUbis-HPH)质粒转化苗GUS染色情况。从图可以看出，经金刚砂辅助农杆菌转化狗尾草种子后筛选出的抗性苗几乎都是纯合的转基因苗，整株都能被GUS染色。图4是狗尾草成熟种子金刚砂辅助农杆菌直接转化的优化基本程序。种子活化(activeseeds)5天，浸染和共培养(transformation)5天,低浓度筛选(selection1)1周,高浓度暗筛选(selection2)2周，高浓度光筛选(selection3)2周，成苗培养(regeneration)2周。具体实施方式下面结合实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件,或按照制造厂商所建议的条件。实施例1、外植体的处理和活化选取经休眠处理的狗尾草品系A10和ME34干燥成熟种子，去除种皮后将各约1克种子分别装入两个14ml离心管，用有效浓度1％的次氯酸钠溶液灭菌消毒处理，无菌水清洗后，在离心管中加入约一半体积的芽诱导液体培养基振荡培养5天，培养条件：光培养，培养温度24℃左右。芽诱导液体培养基是以改良MS培养基为基础培养基(微量元素含量加倍)，pH为5.8，并添加2mg/L2,4-D+0.5mg/LKT。2、金刚砂创伤处理及农杆菌浸染按照种子体积比(1:1)称取金刚砂(120目和320目各一半重量)，高温灭菌处理，倒掉离心管中的芽诱导液体培养基，加入金刚砂。加入少量含有0.6OD600nm农杆菌的浸染培养基(液体),在涡旋振荡器下高速处理2分钟，然后再加入含农杆菌的浸染培养基，使浸染培养基的总体积为10mL，低速振荡浸染40分钟，培养条件：光培养，培养温度24℃左右。浸染培养基是以改良MS培养基为基础培养基(大量元素含量减半，微量元素含量加倍)，pH值为5.2，添加2mg/L2,4-D，添加乙酰丁香酮(Acetosyringone)40mg/L，添加表面活性剂Synperonic0.1％(质量体积比)。农杆菌为AGL1菌株，转化质粒为pZmUbi-GUS(ZmUbis-HPH)见图1(GUS标记)，用带50mg/L羧苄青霉素和50mg/L卡那霉素的LB培养基涂板，在20℃暗培养3～5天后取菌块用浸染培养基重悬为0.6OD600nm，农杆菌液轻摇活化2～3小时后用于转化。3、共培养将浸染后的种子接到带滤纸的共培养培养基上，暗培养3～9天，培养温度为20℃。共培养培养基是以改良MS培养基为基础培养基，大量元素含量减半，微量元素含量加倍，pH值为5.2，并添加2mg/L2,4-D+0.5mg/LKT，添加乙酰丁香酮(Acetosyringone)40mg/L。分别在不同共培养阶段(3天、5天、7天、9天)取A10、ME34种子做GUS染色瞬时表达检测，从图2可见用金刚砂(emery)辅助处理转化的种子GUS瞬时表达明显比不辅助处理的强，因此金刚砂辅助处理能明显提高活化种子的转化效率。4、抑菌和筛选培养将共培养5天后的种子接到抑菌和筛选培养基上，抑菌和筛选培养基是以改良MS培养基为基础培养基，微量元素含量加倍，pH值为5.8，添加2mg/L2,4-D+0.5mg/LKT，添加抑制农杆菌的抗生素150mg/L特美丁(Timentin)，添加筛选剂25mg/L潮霉素(Hygromycin)。1周后继代到潮霉素提高到45mg/L的抑菌和筛选培养基上，培养4周。培养条件：先暗培养，后2周光培养，培养温度24℃左右。观察抗性胚性愈伤组织诱导情况，统计抗性胚性愈伤组织数，计算诱导率，结果见表1，抗性胚性愈伤组织诱导率(抗性胚性愈伤组织数/出芽种子数)A10达49％，ME34达34％。表1抗性胚性愈伤组织诱导情况狗尾草品系出芽种子数抗性胚性愈伤组织数诱导率A1050024549％ME3450017034％5、抗性愈伤成苗培养将经过筛选阶段诱导的抗性胚性愈伤组织，继代到成苗培养基上，培养条件：光培养，培养温度24℃左右。成苗培养基是以改良MS培养基为基础培养基，有机和微量元素含量加倍，蔗糖20g/L，pH值为5.8，添加1.5mg/LKT，添加150mg/L特美丁(Timentin)，添加20mg/L潮霉素。培养时间2周。观察抗性愈伤成苗培养情况，统计丛芽数，计算诱导率，结果见表2，基本每块抗性愈伤都能诱导出丛芽。表2植株再生情况狗尾草品系抗性胚性愈伤组织数愈伤再生丛芽数诱导率A1015014798％ME3415013892％6、生根培养将在成苗培养基上再生的达到约1cm以上的芽单独取出，接到生根培养基上生根，培养条件：光培养，培养温度24℃左右。生根培养基是改良的MS培养基，大量元素含量减半，蔗糖含量减半，pH值为5.8，添加150mg/L特美丁(Timentin)，添加20mg/L潮霉素。培养时间1～2周。观察生根培养情况，统计生根数，计算生根率，结果见表3。将经过筛选再生的转化苗进行GUS染色检测，染色情况见图3。表3生根培养情况狗尾草品系丛芽数丛芽生根数生根率A1012011394.1％ME3412010285％以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本
技术领域：
的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。当前第1页1 2 3