本发明属于天然产物提取
技术领域：
，具体涉及一种茯苓酸性多糖提取物的制备方法及用途。
背景技术：
：茯苓[Poriacocos(Schw.)Wolf]是一种食药用真菌，是中药“四君八珍”之一，具有利水渗湿，健脾宁心之功效，现代医学研究更进一步证明茯苓具有抗肿瘤、利水消肿、增强免疫、镇定安神和抑菌等多种作用。茯苓中含有多种化学成分，其中最主要的是茯苓多糖，其含量可达茯苓干重的84％。茯苓多糖分子量分布较广，大分子量的可达100万道尔顿，小分子量的在5000～9000道尔顿之间均有分布。茯苓多糖易溶于中、强碱溶液中，难溶于水，其主体结构为β-(1-3)结合的葡萄糖线性结构，同时还具有β-(1-6)结合的葡萄糖基支链的结构。现代科学研究表明，茯苓多糖在水溶液中的提取率不超过1％，大部分被当成药渣弃去，造成严重的浪费。现有技术如，中国发明授权专利，授权公告号CN102399299B，该发明属于中药有效部位提取纯化
技术领域：
，具体公开了一种茯苓酸性多糖提取物的制备方法，其步骤：取茯苓，加4-8倍重量的60-80v/v％乙醇浸泡3-12h，回流提取1-3次，每次1-2h，过滤，得滤渣；将滤渣用4-10倍重量的水回流提取1-3次，每次1-3h，过滤，得滤渣；加入30-70倍重量的0.1-0.5M的NaOH提取0.5-2h，过滤，滤液用HCl中和，再水洗除盐，得沉淀；再将沉淀喷雾干燥，得茯苓酸性多糖提取物。该方法简单，所用溶媒均可重复回收利用，降低了生产成本，节约了能源，所得提取物中茯苓酸性多糖的含量以葡萄糖计为1.9-50.0wt%。该提取物具有明显的调节免疫及抗肿瘤的功能，但该发明利用的水提法多糖的提取率偏低，可能会造成一定量的浪费。技术实现要素：本发明针对上述技术问题提供一种茯苓酸性多糖提取物的制备方法及用途，利用超临界萃取和助溶剂提高茯苓酸性多糖的提取率，解决了现有技术中茯苓酸性多糖提取率低的问题，本发明的提取方法简单，原料利用率高，所得产物具有优异的免疫力调节抗肿瘤效果。本发明针对上述技术问题所采取的技术方案为：茯苓酸性多糖提取物的制备方法，制备方法包括以下步骤：1）材料预处理：取茯苓，洗净，烘干，粉碎过筛，放入脱脂除杂剂浸泡后回流提取，得滤渣；2）萃取：在滤渣中加入助溶剂，超临界萃取，得多糖粗粉，加入NaOH溶液搅拌提取，过滤，滤液加2wt%HCl中和至中性，离心分离，取沉淀物，依次用无水乙醇，丙酮分别洗涤，得沉淀物A；3）干燥：将沉淀A喷雾干燥，得茯苓酸性多糖提取物；本发明在对原料脱脂除杂后使用助溶剂和超临界萃取获得高含量多糖的粗粉，再对粗粉进行精制和干燥得高含量的茯苓酸性多糖提取物，多糖总含量在70%以上。作为优选，步骤1中茯苓洗净后在40~55℃下烘干3~5h，去除茯苓表面杂质和水分，粉碎至16~50目，过筛，利于将茯苓中的脂类在后续的回流工艺溶解，将多糖沉淀下来。作为优选，脱脂除杂剂为石油醚、乙醇、乙酸乙酯中的一种或多种，去除茯苓中的脂类和杂质。作为优选，步骤2中滤渣与助溶剂的体积比为1：1.5~2.5，助溶剂由复合表面活性剂2~3重量份、混合溶液2~3重量份与蒸馏水0.8~1.2重量份组成，复合表面活性剂是由二己基琥珀酸磺酸钠、聚氧乙烯壬烷基酚醚、异癸烷、十四酸异丙酯，按物质的量比mol5∶3：0.1：0.1配比制成，混合溶液是由分析纯AR的正丁醇、分析纯AR的95%乙醇和聚乙二醇，按体积比ml为3∶4：0.25配比制成，将复合表面活性剂与混合溶液混合后，与蒸馏水按体积比ml为4~6∶1配比制成助溶剂，助溶剂加到C02中可形成超临界CO2反相微乳体系，改善超临界萃取的萃取效率和多糖萃取率，利用助溶剂提高茯苓酸性多糖通过超临界萃取的提取率。作为优选，步骤2中滤渣在萃取釜中萃取，萃取温度为38~42℃，压力为33~38MPa，CO2流量控制在2.2~2.6L/h条件下萃取，萃取时间为3~4h，利用超临界萃取得到高含量多糖粗粉，提取率高，提取物中的有机溶剂残留率低，提取过程安全稳定且简单。作为优选，步骤2中NaOH溶液的浓度为0.08~0.6mol/L，NaOH溶液的重量为滤渣的40~75倍，搅拌提取40~80min，除蛋白质。作为优选，步骤3中喷雾干燥操作条件如下：进风口温度为170~180℃，出风口温度为85~95℃，雾化盘转速为7000~28000r/min，降低多糖溶解度，使之沉淀下来达到纯化的效果。茯苓酸性多糖提取物在药物中使用，药物为具有抗肿瘤和免疫调节作用的药物。与现有技术相比，本发明的有益效果为：本发明在对原料脱脂除杂后使用助溶剂和超临界萃取获得高含量多糖的粗粉，其中十四酸异丙酯、异癸烷通过上述复合表面活性剂其余成分产生预料不到的技术效果，增大助溶剂和细胞的接触面积，再对粗粉进行精制和干燥得高含量的茯苓酸性多糖提取物，与常规的水提法提取多糖技术相比，本发明提取的提取物中多糖总含量在74%以上，本发明使用的助溶剂加到C02中可形成超临界CO2反相微乳体系，改善超临界萃取的萃取效率和多糖萃取率，利用助溶剂提高茯苓酸性多糖通过超临界萃取的提取率，超临界萃取可得到高含量多糖粗粉，提取率高，提取物中的有机溶剂残留率低，提取过程安全稳定且简单。具体实施例以下结合实施例作进一步详细描述：实施例1茯苓酸性多糖提取物的制备方法，制备方法包括以下步骤：1）材料预处理：取茯苓，洗净，烘干，粉碎过筛，放入脱脂除杂剂浸泡后回流提取，得滤渣；2）萃取：在滤渣中加入助溶剂，超临界萃取，得多糖粗粉，加入NaOH溶液搅拌提取，过滤，滤液加2wt%HCl中和至中性，离心分离，取沉淀物，依次用无水乙醇，丙酮分别洗涤，得沉淀物A；3）干燥：将沉淀A喷雾干燥，得茯苓酸性多糖提取物；本发明在对原料脱脂除杂后使用助溶剂和超临界萃取获得高含量多糖的粗粉，再对粗粉进行精制和干燥得高含量的茯苓酸性多糖提取物，多糖总含量在70%以上。步骤1中茯苓洗净后在40~55℃下烘干3~5h，去除茯苓表面杂质和水分，粉碎至16~50目，过筛，利于将茯苓中的脂类在后续的回流工艺溶解，将多糖沉淀下来。脱脂除杂剂为石油醚、乙醇、乙酸乙酯中的一种或多种，去除茯苓中的脂类和杂质。步骤2中滤渣与助溶剂的体积比为1：1.5~2.5，助溶剂由复合表面活性剂2~3重量份、混合溶液2~3重量份与蒸馏水0.8~1.2重量份组成，复合表面活性剂是由二己基琥珀酸磺酸钠、聚氧乙烯壬烷基酚醚、异癸烷、十四酸异丙酯，按物质的量比mol5∶3：0.1：0.1配比制成，混合溶液是由分析纯AR的正丁醇、分析纯AR的95%乙醇和聚乙二醇，按体积比ml为3∶4：0.25配比制成，将复合表面活性剂与混合溶液混合后，与蒸馏水按体积比ml为4~6∶1配比制成助溶剂，助溶剂加到C02中可形成超临界CO2反相微乳体系，改善超临界萃取的萃取效率和多糖萃取率，利用助溶剂提高茯苓酸性多糖通过超临界萃取的提取率。步骤2中滤渣在萃取釜中萃取，萃取温度为38~42℃，压力为33~38MPa，CO2流量控制在2.2~2.6L/h条件下萃取，萃取时间为3~4h，利用超临界萃取得到高含量多糖粗粉，提取率高，提取物中的有机溶剂残留率低，提取过程安全稳定且简单。步骤2中NaOH溶液的浓度为0.08~0.6mol/L，NaOH溶液的重量为滤渣的40~75倍，搅拌提取40~80min，除蛋白质。步骤3中喷雾干燥操作条件如下：进风口温度为170~180℃，出风口温度为85~95℃，雾化盘转速为7000~28000r/min，降低多糖溶解度，使之沉淀下来达到纯化的效果。茯苓酸性多糖提取物在药物中使用，药物为具有抗肿瘤和免疫调节作用的药物。实施例2茯苓酸性多糖提取物优选的制备方法，制备方法包括以下步骤：1）材料预处理：取茯苓，茯苓洗净后在优选的45℃下烘干4h，放入脱脂除杂剂浸泡后回流提取，得滤渣；2）萃取：在滤渣中加入助溶剂，超临界萃取，在萃取釜中萃取，萃取温度优选为40℃，压力优选为35MPa，CO2流量控制在优选的2.5L/h条件下萃取，萃取时间优选为4h，得多糖粗粉，加入NaOH溶液搅拌提取，过滤，滤液加2wt%HCl中和至中性，离心分离，取沉淀物，依次用无水乙醇，丙酮分别洗涤，得沉淀物A；3）干燥：将沉淀A喷雾干燥，进风口温度优选为175℃，出风口温度优选为90℃，雾化盘转速优选为29040r/min，得茯苓酸性多糖提取物；上述步骤1~3中的超临界萃取、喷雾干燥等常规技术的操作步骤为已知现有技术，在此不作详细描述。步骤2中滤渣与助溶剂的体积比不仅限于1：1.5~2.5，还应包括1：1.5、1：1.51、1：1.52、1：1.53、1：1.54……1：2.49、1：2.5。脱脂除杂剂为石油醚、乙醇、乙酸乙酯中的一种或多种，去除茯苓中的脂类和杂质。步骤2中滤渣与助溶剂的体积比优选为1：2，助溶剂由优选的复合表面活性剂2.3重量份、混合溶液2重量份与蒸馏水1.1重量份组成，复合表面活性剂是由优选的二己基琥珀酸磺酸钠、聚氧乙烯壬烷基酚醚、甲基乙醇胺，按物质的量比mol5∶3：0.1配比制成，混合溶液是由分析纯AR的正丁醇、分析纯AR的95%乙醇和聚乙二醇，按体积比ml为3∶4：0.25配比制成，将复合表面活性剂与混合溶液混合后，与蒸馏水按优选体积比ml为5∶1配比制成助溶剂，助溶剂加到C02中可形成超临界CO2反相微乳体系，改善超临界萃取的萃取效率和多糖萃取率，利用助溶剂提高茯苓酸性多糖通过超临界萃取的提取率。茯苓酸性多糖提取物在药物中使用，药物为具有抗肿瘤和免疫调节作用的药物。实施例3本发明制备的茯苓酸性多糖提取物在免疫调节作用的实验研究：昆明小鼠(17-23g)，雌雄各半，随机分组，每组10只，灌胃给药15天，前4天空白组和模型组给予生理盐水10ml/kg/d，其他两组给予干燥后的茯苓酸性多糖提取物(分高低两个剂量组，用量分别为：100mg/kg/d、300mg/kg/d)，从第5天到第10天，除空白组外，其他各组分别皮下注射氢化可的松10ml/kg/d(氢化可的松注射液的规格：5mg/ml)，后5天停止造模，空白组和模型组给予生理盐水10ml/kg/d，其他两组给予干燥后的茯苓酸性多糖提取物(用量仍分别为100mg/kg/d，300mg/kg/d)，末次给药后次日摘眼球取血，分离血清，按试剂盒说明书方法测定白细胞介素2(IL-2)、肿瘤坏因子(TNFα)以及IFN-r的含量，结果见表1；取胸腺、脾脏测定脏器指数(脏器重量/体重*10)，结果见表2。表1茯苓酸性多糖提取物对小鼠血清IL-2及TNFα含量的影响（±s，n=10)组别剂量(kg)IL-2pg/mlTNFαpg/mlIFN-rpg/ml空白组10ml16.7026±1.2334911.5558±3.578827.3212±3.23440模型组10ml13.9581±4.3672218.7459±1.688628.8678±4.81347酸性多糖低剂量组100mg43.5158±4.99902*31.8680±18.22002*16.5930±5.14569△酸性多糖高计量组300mg77.9828±8.31987*33.5116±5.46642*24.5085±4.5718△注：与生理盐水+氢化可的松组(模型组)比较，P＜0.05*，P＜0.01Δ。表2茯苓酸性多糖提取物对小鼠胸腺、脾脏指数的影响（±s，n=10)组别剂量（kg/d）胸腺指数脾脏指数空白组10ml0.2647±0.45430.4137±0.02782模型组10ml0.0954±0.013420.2507±0.03761茯苓酸性多糖低剂量组100mg0.1295±0.032140.2989±0.06795茯苓酸性多糖高剂量组300mg0.1367±0.03801*0.3675±0.1425*注：与生理盐水+氢化可的松组(模型组)比较，P＜0.05*。以上实验结果充分表明，与模型组相比，茯苓酸性多糖提取物能够明显提高由氢化可的松所致的免疫低下小鼠的免疫功能，能明显提高小鼠的胸腺指数和脾脏指数；并能够明显促进T细胞合成更多的IL-2、TNF-α以及IFN-r等细胞因子，从而提高机体的免疫能力。以上实施方式仅用于说明本发明，而并非对本发明的限制，本领域的普通技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，还可以做出各种变化和变型。因此，所有等同的技术方案也属于本发明的范畴，本发明的专利保护范围应由权利要求限定。当前第1页1 2 3