本发明涉及一种构建植物中pre-miRNA 3’RACE-seq文库的方法。
背景技术：
随着测序技术的发展，转录组和降解组的测序日渐普遍，作为二代测序技术的基础，文库的构建对测序结果起着决定性作用。现在市场上已经出现了很多种RNA文库的构建已经很成熟，但是在植物中，对pre-miRNA 3’RACE-seq的文库构建方法还没有报道。Pre-miRNA作为miRNA的前体，是miRNA加工过程中的重要中间产物，其3’段修饰对于成熟miRNA的形成至关重要，所以探明3’pre-miRNA的核苷酸的变化情况对于研究miRNA的形成具有重要的生物学意义。然而，由于植物中pre-miRNA的丰度很低，长度较长(100bp-600bp)，且无ploy(A)结构，现成的建库方法都无法适用于pre-miRNA 3’RACE-seq文库的构建。
技术实现要素：
针对上述不足之处，本发明提供一种构建植物中pre-miRNA 3’RACE-seq文库的方法，本方法采用SDS-PAGE进行RNA的分离，添加3’端接头，反转录，成功构建了pre-miRNA 3’RACE-seq文库。
本发明所采用的技术如下：一种构建植物中pre-miRNA 3’RACE-seq文库的方法，包括如下：
(1)、植物总RNA的提取；
(2)、RNA的准备：
利用SDS-PAGE对所提取的植物总RNA进行分离，对50bp-400bp之间的RNA进行切胶回收；
(3)、连接：
回收好的RNA的长度集中在50bp-400bp，通过连接酶在RNA的3’末端连接一种特殊的DNA接头，序列如序列表SEQ ID No.1所示；
(4)、反转录：
利用反转录试剂盒，对已经加好接头的RNA进行反转录，反转录成cDNA；
(5)、巢式PCR反应：
利用5’端的特殊引物，以步骤(4)的反转录cDNA为模板，进行第一轮PCR；PCR产物跑PAGE胶回收后，再利用第二轮引物进行第二轮PCR，PCR产物回收后即可送去测序。
本发明还具有如下技术特征：如上步骤(5)所述的第一轮PCR，上引物如序列表SEQ ID No.2-SEQ ID No.79所示，下引物如序列表SEQ ID No.80所示；第二轮PCR，上引物如序列表SEQ ID No.81所示，下引物如序列表SEQ ID No.82所示。
本方法利用pre-miRNA 5’端的特殊引物设计，巧妙的解决了以上问题，构建出了高质量的pre-miRNA 3’RACE-seq文库。本方法是一种利用SDS-PAGE RNA分离技术、3’-RACE加接头技术和巢式PCR等技术，通过5’端的特殊引物设计，特异且全面的构建3’pre-miRNA文库的方法，利用该技术可通过二代高通量测序技术分析植物中pre-miRNA的3’端在不同的基因突变下的变化情况
附图说明
图1为本发明建库流程简图。
具体实施方式
下面根据说明书举例对本发明做进一步解释：
实施例1
如图1所示，一种构建植物中pre-miRNA 3’RACE-seq文库的方法，步骤如下
一、植物总RNA的提取
1、取100mg新鲜的植物组织于干净的1.5mL离心管中。
2、将植物组织在液氮中速冻，用枪头捣碎。
3、加入1mL TRIZOL上下颠倒混匀，室温下静置5min。
4、加入200μL氯仿，颠倒混匀，室温静置15min。
5、12000X g离心15min，吸取上清400μL。
6、加入400μL异丙醇，颠倒混匀，-20℃静置30min淀RNA。
7、4℃，12000X g离心15min，弃上清。
8、加入1mL 75％的乙醇洗涤RNA，4℃，12000X g离心5min。
9、室温干燥RNA，加入30μL ddH2O溶解RNA。
10、将提取的RNA存放于-80℃保存。
二、RNA的准备(50-400)
1、配置15％尿素-PAGE胶，共15mL：
将胶倒入夹板，放上梳子，凝胶至少30min。
2、在30μL的总RNA中，加入等量的2×small RNA loading dye，混匀后70℃变性5min，然后立即放在冰上。
2×small RNA loading dye：80％formamide(甲酰胺)；0.1％Xylene FF(二甲苯FF)；0.1％Brophenol Blue(溴酚蓝)
3、点样，并加入10μL 10bp的DNA marker，150V电泳1-1.5h。(Running buffer:0.5×TBE)
4、EB染色5min。
5、切胶，回收50-400bp的胶到1.5mL离心管，并用1mL的枪头将胶磋碎。
6、加入500μL 0.4N NaCl-DEPC到离心管，并确保胶在翻转离心管的时候能够流动。
7、4℃保持持离心管翻转6h或者过夜。
8、4℃，13200r/m离心1min，将上清液转移到新的离心管中。重复2-3次，直到去除所有的胶。
9、加入1μL Glycogen(糖元)，50μL NaOAc和1mL 100％乙醇，混匀后放入-20℃6h或者过夜。
10、离心并用70％的乙醇洗涤RNA。
11、用20μL DEPC-水溶解RNA，此RNA用来建库。
三、连接
(一)连接
上述连接体系中Linker的序列为：
5′-rAppTGGAATTCTCGGGTGCCAAGG–NH2-3′；
反应条件：
1、25℃反应2h。
2、65℃反应20min使酶变性。
(二)回收(50bp–420bp)
1、配置15％尿素-PAGE胶。
2、在30μL的总RNA中，加入等量的2×small RNA loading dye，混匀后70℃变性5min，然后立即放在冰上。
3、点样，并加入10μL 10bp的DNA marker，150V电泳1-1.5h。
4、EB染色5min。
5、切胶，回收50-400bp或者50-250bp的胶到1.5mL离心管，并用1mL枪头将胶戳碎。
6、加入500μL 0.4N NaCl-DEPC到离心管，并确保胶在翻转离心管的时候能够流动。
7、4℃保持离心管翻转6h或者过夜。
8、4℃，13200r/m离心1min，将上清液转移到新的离心管中。重复2-3次，直到去除所有的胶。
9、加入1μL Glycogen(糖元)，50μL NaOAc和1mL 100％乙醇，混匀后放入-20℃6h或者过夜。
10、离心并用70％的乙醇洗RNA，烘干后溶于20μL DEPC-水，-80℃保存。
四、反转录反应
(一)反转录
1.预变性
Ligated RNA 12μL
RT Primer 1μL
70℃反应10min，迅速放冰上2min。
2、反转录反应(20μL体系)
30℃10min，42℃1h，70℃15min变性后，4℃保存。
(二)回收
12％的native polyacrylamide gel回收50-420bp的片段。
制备12％的PAGE胶(共15mL)
1、加入10μL 6×DNA loading dye到PCR产物中，将所有的DNA点入胶孔,同时点上10μL 10bp DNA marker。
2、进行凝胶电泳150V，1.5h。
3、切50-420bp的DNA条带，用回收小RNA的方法回收DNA。
4、离心，洗涤，干燥。
5、用70％的乙醇洗DNA，烘干后溶于20μL DEPC-水，-80℃保存。
五、巢式PCR反应
两轮PCR反应(LA Taq)
(一)第一轮10个循环(20μL体系)
引物：
Sense:1st PCR Forward primer(将以下78条引物混合)
PCR反应体系：
反应条件：98℃预变性3min；98℃变性10s，60℃退火30s，72℃延伸30s，共10个循环；72℃终延伸5min，12℃∞。
(二)回收
12％的native polyacrylamide gel回收50-200bp的片段。
1、制备12％的PAGE胶
2、加入10μL 6×DNA loading dye到PCR产物中，将所有的DNA点入胶孔，同时点上10μL 10bp DNA marker。
3、进行凝胶电泳150V，1.5h；
4、切50-200bp的DNA条带，用回收小RNA的方法回收DNA；
5、离心，洗涤，干燥；
6、用20-30μL的水溶解DNA。
(三)第二轮PCR(16个循环)
引物：
Sense:2nd PCR Forward primer：
AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACGTTCAGAGTTCTACAGTCCGA2nd PCR Anti-sense Anti-sense:
CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGTGATGTGACTGGAGTTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA
PCR体系：(20μL体系)
反应条件：98℃预变性3min；98℃变性10s，60℃退火30s，72℃延伸30s，共16个循环；72℃终延伸5min，12℃∞。
(四)回收(12％的native polyacrylamide gel回收100-300bp的片段)
1、制备12％的PAGE胶
2、加入10μL 6×DNA loading dye到PCR产物中，将所有的DNA点入胶孔，同时点上10μL 10bp DNA marker
3、进行凝胶电泳150V，1.5h。
4、切100-300bp的DNA条带，用回收小RNA的方法回收DNA。
5、离心，洗涤，干燥。
6、用20-30μL的水溶解DNA，用以测序。
＜110＞深圳大学
＜120＞一种构建植物中pre-miRNA 3’RACE-seq文库的方法
＜160＞ 82
＜210＞ 1
＜211＞21
＜212＞DNA
＜213＞Linker
＜400＞ 1
TGGAATTCTC GGGTGCCAAG G
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＜212＞DNA
＜213＞miR156a
＜400＞ 2
GAGTTCTACA GTCCGACGAT CCACAAAGGC AATTTGCA
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＜212＞DNA
＜213＞miR156b
＜400＞ 3
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＜212＞DNA
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＜212＞DNA
＜213＞miR822
＜400＞72
GTTCAGAGTT CTACAGTCCG ACGATCAATG CTTTCTACAG GAA
＜210＞73
＜211＞43
＜212＞DNA
＜213＞miR824
＜400＞73
GTTCAGAGTT CTACAGTCCG ACGATCTTGG GGAGTGGGGA GAT
＜210＞74
＜211＞49
＜212＞DNA
＜213＞miR837
＜400＞74
GTTCAGAGTT CTACAGTCCG ACGATCTACA CTCATAATCT TGAAACGAA
＜210＞75
＜211＞43
＜212＞DNA
＜213＞miR840
＜400＞75
GTTCAGAGTT CTACAGTCCG ACGATCAATC CGCACGATGA TCT
＜210＞76
＜211＞45
＜212＞DNA
＜213＞miR844
＜400＞76
GTTCAGAGTT CTACAGTCCG ACGATCCTTC TACGCATTGG GCTTA
＜210＞77
＜211＞49
＜212＞DNA
＜213＞miR846
＜400＞77
GTTCAGAGTT CTACAGTCCG ACGATCTAGT TTTGAATTGA AGTGCTTGA
＜210＞78
＜211＞45
＜212＞DNA
＜213＞miR851
＜400＞78
GTTCAGAGTT CTACAGTCCG ACGATCTGAA AACAATCATC ACGAG
＜210＞79
＜211＞48
＜212＞DNA
＜213＞miR864
＜400＞79
GTTCAGAGTT CTACAGTCCG ACGATCAAAT ACCTTGAAAC TATAAACC
＜210＞80
＜211＞22
＜212＞DNA
＜213＞Anti-sense
＜400＞80
GCCTTGGCAC CCGAGAATTC CA
＜210＞81
＜211＞50
＜212＞DNA
＜213＞2nd PCR Forward primer
＜400＞81
AATGATACGG CGACCACCGA GATCTACACG TTCAGAGTTC TACAGTCCGA
＜210＞82
＜211＞63
＜212＞DNA
＜213＞2nd PCR Anti-sense
＜400＞82
CAAGCAGAAG ACGGCATACG AGATCGTGAT GTGACTGGAG TTCCTTGGCA CCCGAGAATT 60
CCA 63