一种DNA序列及其应用的制作方法

本发明涉及基因工程领域，特别涉及一种DNA序列及其应用。

背景技术：

许多微藻种类含有丰富的蛋白质、脂类及各种维生素等营养成分，已广泛用于营养保健、饵料等。不同种类微藻的油脂含量及脂肪酸组成区别较大，微藻被视为规模开发生物油脂及EPA、DHA等多不饱和脂肪酸产品的重要来源。另外，富含脂质的微藻也被认为是极具前景的生物柴油生产新原料。石油资源日趋枯竭，急需开发清洁、可再生的能源，微藻生产生物柴油具有生长速度快、产油量高等诸多优势而被人们关注。

已有研究发现，通过氮胁迫、磷胁迫可以促进微藻油脂合成，但是，这会影响微藻的生长，降低其生物量。所以，必须寻找一个更好的手段去改良微藻的产油性状。基因工程是一个很好的手段，在已有研究指出通过脂肪酸合成途径的单个关键基因进行基因工程改造，获得相对优良的产油藻株。但是，对微藻脂肪酸合成途径中单个关键基因的进行改造，所取得的效果也是有限的。针对这个问题，也有研究人员对其多个基因同时进行超量表达，以获得更高的产油性状，但是，这个操作过程非常耗时间，而且很繁琐。

同时，制约微藻型生物柴油发展的一个因素是微藻的细胞壁很厚，提取胞内油脂需要去除微藻的细胞壁，这个环节会提高生产的成本，同时也会造成细胞的死亡，这对于工业应用来说是很不利的。虽然某些非细胞破坏的提油方法已经成功，但还是不能满足微藻工业产油的需求。因此，我们需要去寻找一株既能高产油又能进行油脂胞外分泌的微藻。

转录因子是一类能够同时调控多个基因的蛋白，其在基因表达调控中扮演着“管理员”的角色，因此，我们只需要对微藻中的一个转录因子进行基因改造，就可以达到同时改造多个基因的效果，获得一个更加优良的品种。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明提供了一种DNA序列及其应用。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明公开了一种DNA序列，其特征在于，所述DNA编码BZIP转录因子；所述BZIP转录因子包括FBPcase结构域和BZIP结构域。

作为优选，所述DNA序列为其具有(Ⅰ)、(Ⅱ)所示的核苷酸序列中任意一个：

(Ⅰ)如DNA序列SEQ ID NO.1所示；或

(Ⅱ)经修饰、取代、缺失或添加一个或几个核苷酸获得的具有至少72％同源性的序列；

作为优选，所述取代的核苷酸数目为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42个。

作为优选，所述DNA序列编码的BZIP转录因子正调控Acyl-CoA-binding proteins基因，3-Ketoacyl-ACP synthase基因，Long chain acyl-CoA synthetases基因,Lysophospholipid acyltransferase基因中的一个或多个基因的表达，同时负调控Anionic cell wall polymer biosynthesis enzyme基因的表达。

作为优选，所述DNA序列在提高三酰甘油合成、脂肪酸合成和促进脂质向胞外分泌中的应用。

本发明提供了一种表达载体，所述表达载体含有所述DNA序列。

作为优选，所述的表达载体能在微藻中表达，所述微藻为绿藻、硅藻，更优选为微拟球藻、小球藻、三角褐指藻。

作为优选，所述的表达载体为微藻通用型载体，所述通用型载体为pNA03载体。

作为优选，所述的表达载体含有hsp20启动子(SEQ ID NO.2)；或经修饰、取代、缺失或添加一个或几个核苷酸，且与hsp20启动子(SEQ ID NO.2)所示核苷酸序列至少72％同源性的核苷酸序列。

本发明还提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞在提高微藻脂质产量和促进微藻脂质向胞外分泌中的应用。

作为优选，所述的宿主细胞为微藻，优选为绿藻、硅藻，更优选为微拟球藻、小球藻、三角褐指藻。

本发明还提供了一种生产生物柴油的方法，所述方法为将宿主细胞扩大培养后，在所述宿主细胞的生长平台期收集所述脂质，分离纯化后获得生物柴油。

综上所述，本发明的目的在于克服现有技术的缺点和不足，通过基因工程的方法来得油脂含量高并能把胞内油脂分泌到胞外的微藻。本发明过表达编码转录因子的DNA序列促使BZIP转录因子基因转录水平上升，使BZIP转录因子含量增加，促使TAG和脂肪酸合成途径多个关键基因(Acyl-CoA-binding proteins基因，3-Ketoacyl-ACP synthase基因，Long chain acyl-CoA synthetases基因，Lysophospholipid acyltransferase基因)上调，同时，可负调控细胞壁合成的基因(Anionic cell wall polymer biosynthesis enzyme)，使其转录水平下降，细胞壁聚糖含量降低，细胞壁变薄。本发明通过过表达BZIP转录因子获得了油产量是野生型的2.48倍，并能使脂质分泌到细胞外的转基因微藻。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1示BZIP转录因子过表达结构示意图，A：BZIP转录因子预测结构图，B：BZIP转录因子重组载体结构图；

图2示转化藻基因电泳图；

图3示转化藻基因测序结果图；

图4示对照藻与转化藻BZIP转录因子序列qPCR分析，Control：对照藻，BZIP-TF1、BZIP-TF2：转化藻，**表示(p<0.01)；

图5示对照藻与转化藻生长曲线，Control：对照藻，BZIP-TF1、BZIP-TF2：转化藻；

图6示对照藻与转化藻光合作用，Control：对照藻，BZIP-TF1、BZIP-TF2：转化藻；

图7示对照藻与转化藻中性脂测定分析，Control：对照藻，BZIP-TF1、BZIP-TF2：转化藻；

图8示对照藻与转化藻总糖含量测定，Control：对照藻，BZIP-TF1、BZIP-TF2：转化藻；

图9示对照藻与转化藻甘油总酯测定，WT：对照藻，BZIP-TF1、BZIP-TF2：转化藻；

图10示转录因子BZIP调控的基因ChIP分析，其中ACBP为Acyl-CoA-binding proteins基因，KAS为3-Ketoacyl-ACP synthase基因，LC-FACS为Long chain acyl-CoA synthetases基因，LPAAT为Lysophospholipid acyltransferase基因，CW为Anionic cell wall polymer biosynthesis enzyme；

图11示对照藻与转化藻荧光共聚焦细胞图，其中A：对照藻，B：转化藻，Bar＝5μm；

图12示对照藻与转化藻透射电镜图，其中A：对照藻，B：转化藻，Bar＝5μm；

图13示BZIP转录因子过表达全局通路图；

附图中BZIP转录因子均标记为BZIP-TF。

具体实施方式

本发明公开了一种DNA序列及其应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本发明提供的一种DNA序列及其应用，其中所用原料及试剂均可由市场购得。

实施例所用微藻为微拟球藻(Nannochloropsis oceanica)。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1：BZIP转录因子过表达载体的构建

本发明的BZIP转录因子含有856个氨基酸，使用SMART网站和NCBI网站对假定的BZIP转录因子的蛋白序列进行分析，发现其BZIP转录因子含有2个结构域：FBPcase结构域(12-399)，BZIP结构域(499-543)(图1A)。

提取微拟球藻的基因组DNA(美基DNA提取试剂盒)。引物(上海生工生物工程有限公司)经PAGE方法纯化，使用时稀释到20μM。采用引物对Na07F，Na08R(表1)，以微拟球藻的基因组为模板，扩增得到BZIP转录因子序列，其全长为4057bp。

表1.相关引物

表2.PCR反应体系(20μl)

反应条件为：预变性：94℃，2min.

把上述BZIP转录因子序列采用同源重组试剂盒(ClonExpress MultiS One Step Cloning)连接到过表达载体中，其BZIP转录因子上游为hsp20启动子(SEQ ID NO.2)，下游为fcpA终止子，同时含有博来霉素抗性表达盒，重组表达载体命名为pna03-[BZIP]TF，结构如图1B所示。

其中，博来霉素抗性表达盒能筛选出成功把过表达载体整合到微藻基因组的微藻，hsp20启动子能启动BZIP转录因子基因的转录。

实施例2：微拟球藻转化及转化藻的筛选

第一步，对重组过表达载体(pna03-[BZIP]TF)使用ScaI限制性内切酶(TAKARA)进行线性化，孵育8h，然后使用DNA片段纯化试剂盒(takara)进行纯化；第二步，将线性化的重组过表达载体进行电击转化，方法如下：4400rpm，10min离心收集藻细胞，使用375mmol无菌山梨醇进行3次洗涤，尽可能去除里面的海水，最后，使用150μl无菌山梨醇溶液重新悬浮藻细胞，加入30ug的预冷的硅精DNA(已经95度加热1min)，和3ug的线性化的重组过表达载体，冰上静置10min，使用电击仪器进行电击，条件如下：2.2kv，电容为50Uf，电容为600ohms。第三步，电击完成后，将藻细胞转移到5mL的f/2无硅培养基，黑暗培养24h。随后，将5ml藻细胞离心10min(4400rpm)收集，并均匀涂到含有5μg/mL博莱霉素的平板中。通过4-5次博来霉素的筛选获得具有抗性的转化藻，得出了两株具有博来霉素抗性的转化藻，标记为BZIP-TF1和BZIP-TF2。

实施例3：转化藻的验证

第一步，在分子水平上验证，把100ml转化藻(BZIP-TF1和BZIP-TF2)和100ml野生型微拟球藻在4400rpm离心10min，收集微藻，提取基因组DNA(美基DNA提取试剂盒)，利用引物Na01和Na02进行PCR，PCR条件、体系参照实施例1，转化藻出现了4200bp的电泳条带(如图2所示)，而对照藻则没有；第二步，切胶回收电泳条带，用引物Na01进行测序，在NCBI网上进行blast比对，图3结果显示，4057bp的电泳条带确实为BZIP转录因子的基因序列。说明了重组过表达载体(pna03-[BZIP]TF)成功整合到微藻的基因组里面。

实施例4：对转化藻验证其过表达的效率

本发明对转化藻(BZIP-TF1和BZIP-TF2)的BZIP转录因子基因进行荧光实时定量分析。野生型藻和转化藻放置新的培养基中，控制藻密度在1×10⁶个/ml，取第十天的微藻，微藻的数量控制在3×10⁸个，在4400rpm条件下离心10min，获得微藻后采用RNA isolation kit(takara)对微藻的总RNA进行提取，并使用the PrimeScript^TM RT reagent Kit with gDNA Eraser(Takara)试剂盒进行逆转录。利用BZIP转录因子基因的特异引物TF-F和TF-R进行实时定量扩增，实验所用的检测设备为ABI PRISM 7500Sequence Detection System(Applied Biosystems,USA)。

结果如图4所示，在微拟球藻中能够显著地提高BZIP转录因子基因表达，与野生型藻相比，BZIP-TF1转化藻是野生型藻的3.83倍，而BZIP-TF2的转录水平是转化藻的2.29倍，表明重组过表达载体(pna03-[BZIP]TF)的成功在微拟球藻中的表达。

实施例5：微拟球藻的藻密度计算

藻密度计算步骤如下：每隔1天对微拟球藻进行取样，利用倒置的显微镜和血球计数板进行计算。微拟球藻的计算公式如下：藻细胞密度＝(N/80)×400×10⁴，其中N表示细胞总数(80个方格)。

结果如图5所示，转化藻(BZIP-TF1和BZIP-TF2)与野生型微藻的生长曲线相似，说明转化藻的生长效率与野生型相当，BZIP转录因子基因对微藻的生长基本没有影响。

实施例6：微拟球藻光合作用测定

微藻的光合作用测定步骤如下：采用Fv/Fm(可变/最大荧光之比)的比值来测定光合作用效率，转化藻和野生型藻黑暗处理40min后，使用TD-700fluorometer(Turner Design,USA)测定。

结果如图6所示，转化藻(BZIP-TF1和BZIP-TF2)与野生型微藻的Fv/Fm基本一样，说明了过表达BZIP转录因子基因，并不影响其光合效率。

实施例7：微拟球藻中性脂测定

微藻的中性脂测定采用尼罗红染色测定中性脂含量，步骤如下：取300ul的藻液，加入0.5g/mL的甘油和3.75μL尼罗红(0.3μg/mL)，上下颠倒1-3次混匀后，常温下黑暗孵育5min，随后使用流式细胞仪(Beckman Gallios)进行测定。其中，测定激发波长为530nm，发射波长为592nm。测定第7、10、11、12、13天的中性脂含量。

结果如图7所示，转化藻(BZIP-TF1和BZIP-TF2)的单细胞中性脂含量在第7、10、11、12、13天均显著大于野生型藻，在12天，在BZIP-TF1转化藻的单细胞中性脂含量比野生型藻增加超过一倍。说明BZIP转录因子基因，会促使更多的碳流向甘油总酯的合成，提高脂质的合成。

实施例8：微拟球藻总糖含量分析

总糖含量的测定步骤如下：离心收集藻液50ml，采用4400rpm，10min来收集藻并称量空的1.5ml的EP管重量，将微藻转移到1.5ml的EP管内。将藻置于冻干仪器，冻干8h后，称量其重量，通过计算得到藻的干重。将冻干好的藻粉，用10ml去离子水重新混匀悬浮，将5ml藻液转移到新的离心管中，向新的离心管中加入3ml的5％的苯酚溶液(w/v)，混匀后，加入15ml的浓硫酸，混匀，常温静置10min，随后，置于30℃孵育20min后，取100ul的转移到96孔酶标板，放到酶标仪中读数，参数为483nm。

结果如图8所示，BZIP-TF1和BZIP-TF2转化藻的总糖含量都显著下降了50％。因此，结果表明了过表达BZIP转录因子基因，会显著下调总糖的合成。

实施例9：微拟球藻甘油总酯产量的测定

甘油总酯含量的测定步骤如下：使用气相色谱-质谱进行分析。4400rpm离心10min收集藻细胞，采用冻干仪器冻干藻，并称其干重，向干燥好的藻细胞加入KOH-CH₃OH，超声波破碎，上清和HCL-甲醇混匀后75℃，10min反应分层，用正己烷萃取，加入C₁₉内标，由氮吹仪吹干。用于脂肪酸干重和组分的分析。

结果如图9所示，bZIP1转化藻的甘油总酯的产量是野生型的2.6倍，bZIP2转化藻的甘油总酯的产量是野生型的1.7倍。因此，bZIP过表达，可以促进TAG的合成。

实施例10：转录因子BZIP调控的基因ChIP分析

采用染色质免疫沉淀技术(ChIP)对转录因子调控的基因进行分析。步骤如下：

1)取野生型藻和转化藻放置新的培养基中，控制藻密度在1×10⁶个/ml，取第十天的微藻，微藻的数量控制在3×10⁸个，在4400rpm条件下离心10min；

2)样品准备与交联：细胞收集后，用37％的formaldehyde处理细胞，交联核酸与DNA结合蛋白；

3)超声打断染色质：裂解细胞，用Bioruptor将染色质超声破碎成200－1000bp片断；将片段分为两份，一份用于免疫共沉淀，一份用于对照。

4)免疫共沉淀(IP)：取步骤3)所得一份片断与ChIP特异抗体结合进行免疫共沉淀，利用免疫磁珠法富集抗体复合物。

5)解交联及纯化DNA：将富集的DNA/蛋白复合物解交联释放DNA片段，并进行纯化(IP DNA)；步骤3)所得用于对照(Input DNA)的片断不进行IP实验，但也要解交联并纯化；

6)DNA段PCR扩增：针对Acyl-CoA-binding proteins基因，3-Ketoacyl-ACP synthase基因，Long chain acyl-CoA synthetases基因,Lysophospholipid acyltransferase基因，Anionic cell wall polymer biosynthesis enzyme基因的特异引物如表1所示。

如图10所示，转录因子BZIP的过表达会同时增强Acyl-CoA-binding proteins基因，3-Ketoacyl-ACP synthase基因，Long chain acyl-CoA synthetases基因,Lysophospholipid acyltransferase基因转录，降低Anionic cell wall polymer biosynthesis enzyme基因的转录。

实施例11：微拟球藻荧光共聚焦观察

荧光共聚焦的分析步骤如下：取300μl的藻液，加入0.5g/mL的甘油和3.75μL尼罗红(0.3μg/mL)，混匀后，常温下黑暗孵育5min，进行尼罗红染色后，使用激光共聚焦分析仪Zeiss LSM 510meta(Zeiss,Germany)进行分析。激发波长为488nm，发射波长为505-550nm。

结果如图11所示，野生型藻的胞内有较少的油滴，胞外没有油滴；而转化藻周围有油滴，其胞内的油滴也明显比的大。因此，BZIP转录因子基因能促使更多的碳流向三酰甘油(TAG)的合成途径，合成更多三酰甘油。

实施例12：微拟球藻透射电镜分析

透射电镜分析步骤如下：在4℃，4400rpm条件下离心10分钟，分别收集野生型藻和转化藻。取上清液后的藻细胞样品用1×PBS缓冲液清洗3次，最后5000rpm离心3分钟收集藻细胞；收集的藻细胞用溶于pH7.2的0.1M NaH₂PO₄缓冲液中的2.5％(v/v)戊二醛及2％(w/v)多聚甲醛进行固定，并用真空泵在4℃条件下抽真空30分钟；之后将固定液(多聚甲醛)离心并去掉上清液，重新用固定液(多聚甲醛)在4℃条件下固定12h。固定完成后离心去除固定液并用0.1M NaH₂PO₄缓冲液(pH7.2)清洗4次(15分钟和30分钟各两次)；之后样品用1％(w/v)四氧化锇在4℃下固定3h，完成后用0.1M NaH₂PO₄缓冲液(pH7.2)清洗4次(15分钟和30分钟各两次)；完成后用梯度浓度的乙醇(30％，50％，70％，80％，90％v/v)对样品进行脱水，每隔10分钟更换一种浓度，最后用100％的乙醇冲洗两次(每次30分钟)；之后样品分别重悬于环氧丙烷(2次，每次30分钟)和1:1(v/v)环氧丙烷：环氧树脂(1次，30分钟)中进行细胞渗透；完成后藻细胞固定于100％w/v环氧树脂中反应24h，且在70℃中包埋的时间不少于8h。藻细胞完成包埋后利用8800Ultratome III进行超微切片，并用乙酸双氧铀及柠檬酸铅对切片进行染色；处理后的切片利用TECNAI-10透射电子显微镜进行观察。

结果如图12所示，在野生型藻中，细胞壁浑厚有序，而在转化藻中，细胞壁变薄，形状无规则。因此，在微拟球藻中，BZIP转录因子基因的过表达会干扰细胞壁的生成，细胞壁变薄，使胞内的油滴分泌到胞外。

综上所述，从图13的全局通路图可知，在微藻中过表达BZIP转录因子的转录翻译，一方面可以上调Acyl-CoA-binding proteins基因，3-Ketoacyl-ACP synthase基因，Long chain acyl-CoA synthetases基因,Lysophospholipid acyltransferase基因的转录翻译水平，另一方面可以下调Anionic cell wall polymer biosynthesis enzyme基因的转录翻译水平，能使微藻内的脂质含量增加，同时时细胞壁变薄，使过多的油脂分泌到胞外。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 暨南大学

<120> 一种DNA序列及其应用

<130> MP1622271

<160> 18

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 4057

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

atggcaattc ctccgacaat gtcctcgggt cgacgaacac ttctctcctt cctgcaagag 60

gagcgtgctg cccaacccac gttggtagac gaggacctgc acctggtgct ggccgcgatt 120

gcgtcggcgg tgaagcgcat cagctacatg gttcgacgag caggcattgt ggacctgacc 180

ggcttgtaca ccacggagca cggtggagaa gtcaccctta acaagggcgg ggagaagcaa 240

aagaagcttg acgtcttggc gaacgacatt cttaaggagc atttgcaaga ttgcgggtat 300

gtcgctgcct ttgcctcaga ggaagaagat ggagtgattc ctttgcggac cggtggcaag 360

tttgtggtgg tgcttgaccc tttagatggc tcgtcgaacg tagacgcatc cattcccacc 420

ggcaccatct ttggagtcta tcgcagccta ggcgacagcc ccgcccaact ccaagccggg 480

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ctgctcgtgc tgacaatggg tagaggcaca ggcacgcatg ttttgaccct tgatcatcac 600

attggggact tcgtcttgac tacccgccgt ctccgactcc ctttgcgggg ttctacttat 660

tcattaaatg aggctcgatt cggtgattgg cccgagggct tacagcgtta tgtcacggac 720

atgaagctgg gcaggaatca aaaacagacg ccgtatgatt tggtgtatgt ttgttcctta 780

gtggcagacg cgcattgggt tttgattcga gggggcatgg catgtaaccc taggagtcat 840

ttgcggttgt gctttgaggg taaccctatg agcttggtac gtatgaggtt gggggttggc 900

ggtattgatt gcatttcttt ggagcttgca ggttgtgttt gtgtttgtac aactgtctcg 960

gtaggcatgt tccgggtttg tactcactat ttcacttttt ggggtgcggt gagatatacg 1020

tgctaatgaa ataattttat aataacatac ccctggtttt ccatcattta tcgtctaaat 1080

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caaatgtgaa aatgtaccag agtcaggtgt tttaacgaaa gtcgttgtcg tcgttatcgc 1440

ttgcttcttt ttcttcgagt caactctctc ttgctatgac aagttccttc cccaaacgta 1500

cccggcggct ggaaaaaaag gcctacaaac gcaaagttgg aaccttttta gccacacata 1560

cctccgtcta ctcttgcacg cattcatgtc tttccaaact gtacacctgg cgcgtttgct 1620

gagacctgcg gccacggcat ttttgttcag atcaagtggt ccaagccccg gctcatggat 1680

cgctcctcgc tcccctaggt agtcgatcct cattgcccat gcctcttacc acacacgcac 1740

agattcctcc gactggacac gtctgtaaga acctcttggg cctgttttcc gcccttctcg 1800

aagtcgttac ccctcagctg gcacagaggt aagagggcac tccgattgga tatcatacgt 1860

gacggacgga gcacacacgt aatgcagaga ccaaagccaa aaattcacac tggtccccat 1920

ccccctaaca caaggcaaag gcgaaaatca aaagagtgct gggggcgaaa atagcgcgga 1980

cagagcacaa tccatggcta caccagcaaa tggaacagga ggaggaggag gagaaggagg 2040

agaggcggga ggaggaggag gaggaggagg aggaggaggt ggcggtggtc tccatcctcc 2100

gctccccaga ccagcttcag gtagcaacct tcgaagaggt acgcaagcag agggcgagag 2160

gggaaccaca tgttgcgtcg tgtaaccttt gctcattatt tggtgatgtg atgataacat 2220

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tccagcagca gcagcagcag caactccaac tacagcagca acaagaactt tatccccacg 2400

ccaagtccga gccaccaaac accctgacca tctctccgca catgcagcaa ctgcagcacc 2460

agcaggagca actatttatc cccatgacta gtcccaacag ccacacaagc cgaaatcagc 2520

atcagcagga cgacgatgac caagactcgc tacagggagg gggaggaggg gtgtaccaac 2580

aagggcaaat gaacagcttg ccccaggcct tcgagaagaa gctgcgacgg ctggagaaga 2640

accgagagtc agctcgtgaa tgtcgaagga ggaagaaaga gcacgtggtg gagctccaga 2700

agcaggtagc cctccttgag gcggagaact tgaagttgaa gctgcaactc aaggtgggag 2760

aggagagcca ggcgcaggag cggcaggaga agggtcggat aactaaaaag ctggacgata 2820

tggtacgccc tgccttctgt cttaatatcg gggggaagtg ggtcgcctcg caatctgtca 2880

tgtctatcaa ggctttgtgc gagctctgtc gtcttccagt cggcagatat tcccttgtaa 2940

cctcgatcat ctggccgggg agcatcgcgt cgtttttact ttccattgct ccccacttct 3000

tcctctctct tcaacaggtg aaaacgggcg cgagtgagtc agacatctgg cagacgatcg 3060

atatgcttaa ggagaggtac tcggactacg gcagcgatcg acgctctgcc attgagtttc 3120

acaccaacca gctcgagaag gtacgcgcgt ggtgggagac tagggagaga ggaaggaaga 3180

gagaacaatt attcacttgt tttgttcttt tctagaagac taatccagtc cttgctttca 3240

ttatacctga atctttttct cactgttttg ccgcccactt ctcctccttc cttcccttgc 3300

acccctgcag ctcctcctcc ccaccaaact caccaagctc tgcatgtgga tgctcttcaa 3360

catgggcgac gagaacggtc aaactttatc tccggtctcc gcccccactc ttctcccttc 3420

tccctctgcc cacggcaaac ccgagaatac ttcccccccc tcctccgcta ctgctactga 3480

tgctggtgcc caagccgcgg cacggcatct ttggtcgatt ctctcagaag aactgcaggt 3540

aacaccagat cagcaagcgt ccctcttaga gcaccggggc agcgtagtcg caatggacgc 3600

tgacttagac gtaaccgcag gcatgctccg cgatcttcgc gccctgatcg acgataaaaa 3660

ctcgagtctg gatcaggagc tgcaggaggt gcagaagatc ctcactccca ctcaaacagc 3720

caagtttatt ctatggatta cgcggaaccc tgcttgtatg cacatgctca atcagttatg 3780

gcgggccgta tatgagcgtt ccgagggggg aggaggagga ggaggaagac aaggaggagg 3840

acaaggcgga cgacatggag gtggagggaa tttgggaggg tttagtggtc atcatcaatg 3900

gaggaccatc gctccgcaag cggctgctcc tgctgctgcg cttggagctg ggggaggtac 3960

gatcaacggc agtatcggta gcagcatgag tagtagcagt gccagtattg gaggtgggaa 4020

ggcgccgtca ccagcccagc tgcaagggtc gttgata 4057

<210> 2

<211> 531

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

tgacggaaga tcactacggc agattgaagg ggtggtaggg aagtggtcag cacatttaat 60

ataagcaaca aaatatactg tcggatatcg ctgtcagcca gcaggaaata ttgagggtaa 120

atatcacaac acctgtgggc atgccgaaaa ggcagggtaa gagtggacag tgctccctca 180

tatcctcaag caggccttgc tgttgcgtga ggggcattcg cctacagcga cgacatgtcg 240

gagcttcaac tcgtactctt tcaagaacta attctagaaa acccggccgg ccggctggca 300

atgttctgtt tgttccaaaa tactgtgcgt tgtttgtatg tgtttatgct aatgtcgtac 360

gtggctatac atttcttttg gcagtccaat atatgttcat gcttatatcg tacgtggcta 420

tacatttctt ttggcagtcc aaacaagctc acaagacacc ctacccatcc cacacacctt 480

tccaccaccc tttccacaag cagctggtac cacactctaa accccaataa a 531

<210> 3

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

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acaattacta tttacaatta caatcca 27

<210> 4

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

gtccttgtag tccaggtgtg ttatcaacga cccttgcagc tggg 44

<210> 5

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<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

acaattacta tttacaatta caatcca 27

<210> 6

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<213> 人工序列

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aaaccaaagcggagtgactgcaac 24

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<212> DNA

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ccgtatgatttggtgtatgt 20

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<213> 人工序列

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gaatggcatcaggtacaatg 20

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agcgtgactttgaatgaga 19

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cgtctatgtgcttagtttga 20

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<213> 人工序列

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tccgtccttt ctctttgtaa tc 22

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<213> 人工序列

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tatcctcctt tgattcgatg tg 22

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cggatgatacaagtaatccaga 22

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tggtcgttgatactctctt 19

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ggctcccaaatcttcgtatt 20

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<213> 人工序列

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acgttcagttgaaggtgtat 20