本发明属于化学医药领域，具体涉及1h-[1,2,3]三氮唑并[4,5-c]喹啉衍生物及其制备方法和用途。
背景技术：
cdc2样激酶(cdc2-likekinases，clks)是一种进化保守的双特异性激酶，属于cmcg家族，其能够同时磷酸化蛋白底物上的丝氨酸、苏氨酸以及酪氨酸。clk激酶家族由四种亚型构成，分别为clk1、clk2、clk3、clk4；结构上，它们的c端具有高度保守的结构域；功能上，它们主要负责细胞内mrna的选择性剪切。由于clks四种亚型在结构、功能上的高度重合，人们一般选择代表性的clk1作为研究对象。clk1，又称为sty，是一种核激酶。pc12细胞中clk1的表达能够诱导神经元分化，显示clk1在神经发育中的重要作用。clk1诱导pc12细胞分化的能力与clk1依耐性map激酶级联反应相关，提示clk1的功能可能是通过信号传导通路实现。clk1促进hiv-1gag蛋白的表达；alexander发现clk1小分子抑制剂tg003能够以超过两个数量级的效率减弱流感病毒在宿主内的复制，他们研究认为，这是病毒m2蛋白信使rna的选择性剪切损伤引发的。在癌细胞及相关细胞中，通过拮抗机制，即选择性信使rna剪切因子45(spf45)诱导的6号外显子从fas蛋白mrna排除，clk1调控spf45的过表达。当spf45过表达导致肿瘤出现增强的迁移、侵袭能力，这依耐于clk1的生化调节(辨别磷酸化位点以及纤维连接蛋白、皮层肌动蛋白的调节)；而当抑制了clk1活性，spf45则通过蛋白酶体途径进行降解而抑制肿瘤迁移、侵袭。
目前认为，与clk1关系最紧密的疾病模型为阿尔兹海默症(alzheimer’sdisease，ad)。阿尔兹海默症是一种神经退行性疾病，其主要的标志为神经元纤维缠结(neurofibrillarytangles，nft)、异常突起，造成皮质淀粉样蛋白沉积。在超微结构下，神经元病变中含有大量成对的螺旋细丝(pairedhelicalfilaments，phf)，而phf最主要的生化构成为非正常形态的tau蛋白。因此，阿尔兹海默症中nft主要由大量高度磷酸化的tau蛋白构成。tau蛋白是一种微管相关蛋白，在微管的多聚化以及稳定微管中发挥重要作用，广泛涉及神经退行性疾病病例过程。人类的tau蛋白基因含有16个外显子，通过选择性剪切，在成人大脑中生成六种亚型的tau蛋白。tau蛋白的c末端包含不充足的重复氨基酸序列，能够与微管蛋白结合并与微管相互作用。tau蛋白基因10号外显子受到选择性剪切调控，负责编码这段重复的氨基酸序列，得到含有3个或4个微管结合域的tau蛋白，分别称为3rtau、4rtau。在健康个体中，3r以及4rtau蛋白的平衡是通过选择性剪切的调控实现，关键机制是通过磷酸化sr蛋白的丝氨酸残基。核质中的核斑包含贮存形式的sr蛋白，该形式的sr蛋白几乎不负责剪切的选择。通过clk1的磷酸化，sr蛋白能够在核质内移动并且结合附近等待剪切的大的核糖核蛋白。在神经元中，核不均一核糖核蛋白(hnrnp)a/b家族的表达在选择性剪切中也具有至关重要的作用。但是，sr蛋白与hnrnp的具体作用有差别。磷酸化的sr蛋白结合剪切增强子，而hnrnp大多结合沉默子，反向抑制剪切。染色分析显示，在阿尔兹海默症患者神经核中hnrnpa/b减少而sr蛋白显著增多。因此，clk激酶通过磷酸化sr蛋白调控tau蛋白转录位点的选择，从而影响tau蛋白的形态，进一步影响阿尔茨海默症。除此而外，其它表明clk1与阿尔茨海默症有关的证据包括：氯碘羟喹，一种金属螯合剂，能够抑制培养细胞、线虫以及小鼠的clk1活性。在ad、帕金森、亨廷顿疾病模型中，该药已广泛作为神经保护剂。加入铁离子、钴离子能够阻断氯碘羟喹作用于clk1发挥的抗老化作用。金属阳离子占据clk1的氯碘羟喹结合位点，表明螯合作用可能与氯碘羟喹抑制clk1活性有关，但确切机制不明。tania等发现clk1抑制剂leucettinel41能够保护ht22细胞免受谷氨酸诱导的神经毒伤害，并且，降低淀粉样前体蛋白app诱导的大鼠脑切片细胞死亡。2014年，fant等研究表明clk1抑制剂leucettinel41能够有效诱导自噬，通过基因敲除clk1，进一步明确leucettinel41诱导自噬是基于其对clk1的抑制，这为clk1在阿尔兹海默症乃及自噬相关疾病中潜在价值提供了新的依据。
鉴于clk1抑制具有自噬诱导的能力，因此，clk1抑制剂有望应用于自噬相关疾病的治疗，这些疾病包括神经退行性疾病、药源性肝损伤、缺血再灌注损伤、肥胖、ⅱ型糖尿病、代谢综合征、癌症、红斑狼疮、庞贝氏症、戈谢病等。
技术实现要素：
本发明提供了一种1h-[1,2,3]三氮唑并[4,5-c]喹啉衍生物，其结构如式ⅰ所示：
其中，r2为-h、-oh、卤素、c1～c4烷基、c1～c4烷氧基、取代或未取代的c4～c10芳基、取代或未取代的5～14元饱和或不饱和杂环；所述5～14元饱和或不饱和杂环含有1～3个杂原子，杂原子为n、o或s；所述取代c4～c10芳基的取代基为-oh、-conh2、-cn、卤素、c1～c4烷基、c1～c4烷氧基或c1～c4的羰基；所述取代5～14元饱和或不饱和杂环的取代基为-oh、-conh2、-cn、卤素、c1～c4烷基、c1～c4烷氧基、c1～c4羰基或c1～c4烷基取代的5～8元饱和杂环；所述c1～c4烷基取代的5～8元饱和杂环含有1～3个杂原子，杂原子为n、o或s；
r1为c1～c4烷基、c1～c4烷氧基、取代或未取代的c4～c10芳基或
r3为-h、c1～c4烷基或c1～c4烷氧基；
r4为c1～c4烷基、取代或未取代的c4～c10芳基或-cf3；所述取代c4～c10芳基的取代基为卤素、c1～c4烷基、c1～c4烷氧基或-oh。
作为优选的方案，r2为卤素、取代或未取代的c4～c10芳基、取代或未取代的5～10元饱和或不饱和杂环；所述5～10元饱和或不饱和杂环含有1～3个杂原子，杂原子为n、o或s；所述取代c4～c10芳基的取代基为-oh、-conh2、-cn、卤素、c1～c4烷基、c1～c4烷氧基或c1～c4的羰基；所述取代5～10元饱和或不饱和杂环的取代基为-oh、-conh2、-cn、卤素、c1～c4烷基、c1～c4烷氧基、c1～c4羰基或c1～c4烷基取代的5～8元饱和杂环；所述c1～c4烷基取代的5～8元饱和杂环含有1～3个杂原子，杂原子为n、o或s；
r1为c1～c4烷基、c1～c4烷氧基、取代或未取代的c4～c10芳基或
r3为-h、c1～c4烷基或c1～c4烷氧基；
r4为c1～c4烷基、取代或未取代的c4～c10芳基或-cf3；所述取代c4～c10芳基的取代基为卤素、c1～c4烷基、c1～c4烷氧基或-oh。
优选的，r2为卤素、取代或未取代的c4～c10芳基、取代或未取代的5～10元饱和或不饱和杂环；；所述5～10元饱和或不饱和杂环含有1～3个杂原子，杂原子为n、o或s；所述取代c4～c10芳基的取代基为-oh、-conh2、-cn、卤素、c1～c4烷基、c1～c4烷氧基或c1～c4的羰基；所述取代5～10元饱和杂环的取代基为c1～c4烷基或c1～c4烷氧基；所述取代5～10元不饱和杂环的取代基为-oh、-conh2、-cn、卤素、c1～c4烷基、c1～c4烷氧基、c1～c4羰基或c1～c4烷基取代的5～6元饱和杂环；所述c1～c4烷基取代的5～6元饱和杂环含有1～3个杂原子，杂原子为n、o或s；
r1为c1～c4烷基、c1～c4烷氧基、取代或未取代的c4～c10芳基或
r3为-h、c1～c4烷基或c1～c4烷氧基；
r4为c1～c4烷基、取代或未取代的c4～c10芳基或-cf3；所述取代c4～c10芳基的取代基为卤素、c1～c4烷基、c1～c4烷氧基或-oh。
进一步的，r2为-f、-cl、-br、取代或未取代的苯基、未取代的5～10元饱和杂环或取代或未取代的5～10元不饱和杂环；所述5～10元饱和或不饱和杂环含有1～3个杂原子，杂原子为n、o或s；所述取代苯基的取代基为-oh、-conh2、-cn、-f、-cl、-br、c1～c4烷基或c1～c4烷氧基；所述取代5～10元不饱和杂环的取代基为-oh、-conh2、-cn、-f、-cl、-br、c1～c4烷基、c1～c4烷氧基、c1～c4羰基或c1～c4烷基取代的5～6元饱和杂环；所述c1～c4烷基取代的5～6元饱和杂环含有1～3个杂原子，杂原子为n、o或s；
r1为c1～c4烷基、c1～c4烷氧基、取代或未取代的苯基或
r3为-h、c1～c4烷基或c1～c4烷氧基；
r4为c1～c4烷基、取代或未取代的苯基或-cf3；所述取代苯基的取代基为-f、-cl、-br、c1～c4烷基、c1～c4烷氧基或-oh。
更进一步的，r2为-f、-cl、-br、取代或未取代的苯基、未取代的5～6元饱和杂环或取代或未取代的5～10元不饱和杂环；所述5～6元饱和杂环含有1～3个杂原子，杂原子为n、o或s；所述5～10元不饱和杂环含有1～3个杂原子，杂原子为n、o或s；所述取代苯基的取代基为-oh、-conh2、-cn、-f、-cl、-br、c1～c4烷基或c1～c4烷氧基；所述取代5～10元不饱和杂环的取代基为-f、-cl、-br、c1～c4烷基、c1～c4羰基或
r1为c1～c4烷基、取代或未取代的苯基或
r3为-h、甲基或乙基；
r4为甲基、乙基、取代或未取代的苯基或-cf3；所述取代苯基的取代基为-f、-cl、-br、甲基或乙基。
最优选的，r2为-f、-br、-cl、苯基、
r1为甲基、乙基、异丙基、
上述h-[1,2,3]三氮唑并[4,5-c]喹啉衍生物，当r2为
其中，r1为c1～c4烷基、c1～c4烷氧基、取代或未取代的c4～c10芳基或
r3为-h、c1～c4烷基或c1～c4烷氧基；
r4为c1～c4烷基、取代或未取代的c4～c10芳基或-cf3；所述取代c4～c10芳基的取代基为卤素、c1～c4烷基、c1～c4烷氧基或-oh。
作为优选的方案，r1为c1～c4烷基、c1～c4烷氧基、取代或未取代的c4～c10芳基或
r3为-h、c1～c4烷基或c1～c4烷氧基；
r4为c1～c4烷基、取代或未取代的c4～c10芳基或-cf3；所述取代c4～c10芳基的取代基为卤素、c1～c4烷基、c1～c4烷氧基或-oh。
优选的，r1为c1～c4烷基、c1～c4烷氧基、取代或未取代的c4～c10芳基或
r3为-h、c1～c4烷基或c1～c4烷氧基；
r4为c1～c4烷基、取代或未取代的c4～c10芳基或-cf3；所述取代c4～c10芳基的取代基为卤素、c1～c4烷基、c1～c4烷氧基或-oh。
进一步的，r1为c1～c4烷基、c1～c4烷氧基、取代或未取代的苯基或
r3为-h、c1～c4烷基或c1～c4烷氧基；
r4为c1～c4烷基、取代或未取代的苯基或-cf3；所述取代苯基的取代基为-f、-cl、-br、c1～c4烷基、c1～c4烷氧基或-oh。
更进一步的，r1为c1～c4烷基、取代或未取代的苯基或
r3为-h、甲基或乙基；
r4为甲基、乙基、取代或未取代的苯基或-cf3；所述取代苯基的取代基为-f、-cl、-br、甲基或乙基。
最优选的，r1为甲基、乙基、异丙基、
上述h-[1,2,3]三氮唑并[4,5-c]喹啉衍生物，当r2为
其中，r1为c1～c4烷基、c1～c4烷氧基、取代或未取代的c4～c10芳基或
r3为-h、c1～c4烷基或c1～c4烷氧基；
r4为c1～c4烷基、取代或未取代的c4～c10芳基或-cf3；所述取代c4～c10芳基的取代基为卤素、c1～c4烷基、c1～c4烷氧基或-oh。
作为优选的方案，r1为c1～c4烷基、c1～c4烷氧基、取代或未取代的c4～c10芳基或
r3为-h、c1～c4烷基或c1～c4烷氧基；
r4为c1～c4烷基、取代或未取代的c4～c10芳基或-cf3；所述取代c4～c10芳基的取代基为卤素、c1～c4烷基、c1～c4烷氧基或-oh。
优选的，r1为c1～c4烷基、c1～c4烷氧基、取代或未取代的c4～c10芳基或
r3为-h、c1～c4烷基或c1～c4烷氧基；
r4为c1～c4烷基、取代或未取代的c4～c10芳基或-cf3；所述取代c4～c10芳基的取代基为卤素、c1～c4烷基、c1～c4烷氧基或-oh。
进一步的，r1为c1～c4烷基、c1～c4烷氧基、取代或未取代的苯基或
r3为-h、c1～c4烷基或c1～c4烷氧基；
r4为c1～c4烷基、取代或未取代的苯基或-cf3；所述取代苯基的取代基为-f、-cl、-br、c1～c4烷基、c1～c4烷氧基或-oh。
更进一步的，r1为c1～c4烷基、取代或未取代的苯基或
r3为-h、甲基或乙基；
r4为甲基、乙基、取代或未取代的苯基或-cf3；所述取代苯基的取代基为-f、-cl、-br、甲基或乙基。
最优选的，r1为甲基、乙基、异丙基、
上述h-[1,2,3]三氮唑并[4,5-c]喹啉衍生物，当r2为
其中，r1为c1～c4烷基、c1～c4烷氧基、取代或未取代的c4～c10芳基或
r3为-h、c1～c4烷基或c1～c4烷氧基；
r4为c1～c4烷基、取代或未取代的c4～c10芳基或-cf3；所述取代c4～c10芳基的取代基为卤素、c1～c4烷基、c1～c4烷氧基或-oh。
作为优选的方案，r1为c1～c4烷基、c1～c4烷氧基、取代或未取代的c4～c10芳基或
r3为-h、c1～c4烷基或c1～c4烷氧基；
r4为c1～c4烷基、取代或未取代的c4～c10芳基或-cf3；所述取代c4～c10芳基的取代基为卤素、c1～c4烷基、c1～c4烷氧基或-oh。
优选的，r1为c1～c4烷基、c1～c4烷氧基、取代或未取代的c4～c10芳基或
r3为-h、c1～c4烷基或c1～c4烷氧基；
r4为c1～c4烷基、取代或未取代的c4～c10芳基或-cf3；所述取代c4～c10芳基的取代基为卤素、c1～c4烷基、c1～c4烷氧基或-oh。
进一步的，r1为c1～c4烷基、c1～c4烷氧基、取代或未取代的苯基或
r3为-h、c1～c4烷基或c1～c4烷氧基；
r4为c1～c4烷基、取代或未取代的苯基或-cf3；所述取代苯基的取代基为-f、-cl、-br、c1～c4烷基、c1～c4烷氧基或-oh。
更进一步的，r1为c1～c4烷基、取代或未取代的苯基或
r3为-h、甲基或乙基；
r4为甲基、乙基、取代或未取代的苯基或-cf3；所述取代苯基的取代基为-f、-cl、-br、甲基或乙基。
最优选的，r1为甲基、乙基、异丙基、
上述h-[1,2,3]三氮唑并[4,5-c]喹啉衍生物，当r2为
其中，r1为c1～c4烷基、c1～c4烷氧基、取代或未取代的c4～c10芳基或
r3为-h、c1～c4烷基或c1～c4烷氧基；
r4为c1～c4烷基、取代或未取代的c4～c10芳基或-cf3；所述取代c4～c10芳基的取代基为卤素、c1～c4烷基、c1～c4烷氧基或-oh。
作为优选的方案，r1为c1～c4烷基、c1～c4烷氧基、取代或未取代的c4～c10芳基或
r3为-h、c1～c4烷基或c1～c4烷氧基；
r4为c1～c4烷基、取代或未取代的c4～c10芳基或-cf3；所述取代c4～c10芳基的取代基为卤素、c1～c4烷基、c1～c4烷氧基或-oh。
优选的，r1为c1～c4烷基、c1～c4烷氧基、取代或未取代的c4～c10芳基或
r3为-h、c1～c4烷基或c1～c4烷氧基；
r4为c1～c4烷基、取代或未取代的c4～c10芳基或-cf3；所述取代c4～c10芳基的取代基为卤素、c1～c4烷基、c1～c4烷氧基或-oh。
进一步的，r1为c1～c4烷基、c1～c4烷氧基、取代或未取代的苯基或
r3为-h、c1～c4烷基或c1～c4烷氧基；
r4为c1～c4烷基、取代或未取代的苯基或-cf3；所述取代苯基的取代基为-f、-cl、-br、c1～c4烷基、c1～c4烷氧基或-oh。
更进一步的，r1为c1～c4烷基、取代或未取代的苯基或
r3为-h、甲基或乙基；
r4为甲基、乙基、取代或未取代的苯基或-cf3；所述取代苯基的取代基为-f、-cl、-br、甲基或乙基。
最优选的，r1为甲基、乙基、异丙基、
上述h-[1,2,3]三氮唑并[4,5-c]喹啉衍生物，当r2为
其中，r1为c1～c4烷基、c1～c4烷氧基、取代或未取代的c4～c10芳基或
r3为-h、c1～c4烷基或c1～c4烷氧基；
r4为c1～c4烷基、取代或未取代的c4～c10芳基或-cf3；所述取代c4～c10芳基的取代基为卤素、c1～c4烷基、c1～c4烷氧基或-oh。
作为优选的方案，r1为c1～c4烷基、c1～c4烷氧基、取代或未取代的c4～c10芳基或
r3为-h、c1～c4烷基或c1～c4烷氧基；
r4为c1～c4烷基、取代或未取代的c4～c10芳基或-cf3；所述取代c4～c10芳基的取代基为卤素、c1～c4烷基、c1～c4烷氧基或-oh。
优选的，r1为c1～c4烷基、c1～c4烷氧基、取代或未取代的c4～c10芳基或
r3为-h、c1～c4烷基或c1～c4烷氧基；
r4为c1～c4烷基、取代或未取代的c4～c10芳基或-cf3；所述取代c4～c10芳基的取代基为卤素、c1～c4烷基、c1～c4烷氧基或-oh。
进一步的，r1为c1～c4烷基、c1～c4烷氧基、取代或未取代的苯基或
r3为-h、c1～c4烷基或c1～c4烷氧基；
r4为c1～c4烷基、取代或未取代的苯基或-cf3；所述取代苯基的取代基为-f、-cl、-br、c1～c4烷基、c1～c4烷氧基或-oh。
更进一步的，r1为c1～c4烷基、取代或未取代的苯基或
r3为-h、甲基或乙基；
r4为甲基、乙基、取代或未取代的苯基或-cf3；所述取代苯基的取代基为-f、-cl、-br、甲基或乙基。
最优选的，r1为甲基、乙基、异丙基、
上述h-[1,2,3]三氮唑并[4,5-c]喹啉衍生物，当r2为
其中，r1为c1～c4烷基、c1～c4烷氧基、取代或未取代的c4～c10芳基或
r3为-h、c1～c4烷基或c1～c4烷氧基；
r4为c1～c4烷基、取代或未取代的c4～c10芳基或-cf3；所述取代c4～c10芳基的取代基为卤素、c1～c4烷基、c1～c4烷氧基或-oh。
作为优选的方案，r1为c1～c4烷基、c1～c4烷氧基、取代或未取代的c4～c10芳基或
r3为-h、c1～c4烷基或c1～c4烷氧基；
r4为c1～c4烷基、取代或未取代的c4～c10芳基或-cf3；所述取代c4～c10芳基的取代基为卤素、c1～c4烷基、c1～c4烷氧基或-oh。
优选的，r1为c1～c4烷基、c1～c4烷氧基、取代或未取代的c4～c10芳基或
r3为-h、c1～c4烷基或c1～c4烷氧基；
r4为c1～c4烷基、取代或未取代的c4～c10芳基或-cf3；所述取代c4～c10芳基的取代基为卤素、c1～c4烷基、c1～c4烷氧基或-oh。
进一步的，r1为c1～c4烷基、c1～c4烷氧基、取代或未取代的苯基或
r3为-h、c1～c4烷基或c1～c4烷氧基；
r4为c1～c4烷基、取代或未取代的苯基或-cf3；所述取代苯基的取代基为-f、-cl、-br、c1～c4烷基、c1～c4烷氧基或-oh。
更进一步的，r1为c1～c4烷基、取代或未取代的苯基或
r3为-h、甲基或乙基；
r4为甲基、乙基、取代或未取代的苯基或-cf3；所述取代苯基的取代基为-f、-cl、-br、甲基或乙基。
最优选的，r1为甲基、乙基、异丙基、
上述h-[1,2,3]三氮唑并[4,5-c]喹啉衍生物，当r2为
其中，r1为c1～c4烷基、c1～c4烷氧基、取代或未取代的c4～c10芳基或
r3为-h、c1～c4烷基或c1～c4烷氧基；
r4为c1～c4烷基、取代或未取代的c4～c10芳基或-cf3；所述取代c4～c10芳基的取代基为卤素、c1～c4烷基、c1～c4烷氧基或-oh。
作为优选的方案，r1为c1～c4烷基、c1～c4烷氧基、取代或未取代的c4～c10芳基或
r3为-h、c1～c4烷基或c1～c4烷氧基；
r4为c1～c4烷基、取代或未取代的c4～c10芳基或-cf3；所述取代c4～c10芳基的取代基为卤素、c1～c4烷基、c1～c4烷氧基或-oh。
优选的，r1为c1～c4烷基、c1～c4烷氧基、取代或未取代的c4～c10芳基或
r3为-h、c1～c4烷基或c1～c4烷氧基；
r4为c1～c4烷基、取代或未取代的c4～c10芳基或-cf3；所述取代c4～c10芳基的取代基为卤素、c1～c4烷基、c1～c4烷氧基或-oh。
进一步的，r1为c1～c4烷基、c1～c4烷氧基、取代或未取代的苯基或
r3为-h、c1～c4烷基或c1～c4烷氧基；
r4为c1～c4烷基、取代或未取代的苯基或-cf3；所述取代苯基的取代基为-f、-cl、-br、c1～c4烷基、c1～c4烷氧基或-oh。
更进一步的，r1为c1～c4烷基、取代或未取代的苯基或
r3为-h、甲基或乙基；
r4为甲基、乙基、取代或未取代的苯基或-cf3；所述取代苯基的取代基为-f、-cl、-br、甲基或乙基。
最优选的，r1为甲基、乙基、异丙基、
上述h-[1,2,3]三氮唑并[4,5-c]喹啉衍生物，当r2为
其中，r1为c1～c4烷基、c1～c4烷氧基、取代或未取代的c4～c10芳基或
r3为h、c1～c4烷基或c1～c4烷氧基；
r4为c1～c4烷基、取代或未取代的c4～c10芳基或-cf3；所述取代c4～c10芳基的取代基为卤素、c1～c4烷基、c1～c4烷氧基或-oh。
作为优选的方案，r1为c1～c4烷基、c1～c4烷氧基、取代或未取代的c4～c10芳基或
r3为h、c1～c4烷基或c1～c4烷氧基；
r4为c1～c4烷基、取代或未取代的c4～c10芳基或-cf3；所述取代c4～c10芳基的取代基为卤素、c1～c4烷基、c1～c4烷氧基或-oh。
优选的，r1为c1～c4烷基、c1～c4烷氧基、取代或未取代的c4～c10芳基或
r3为h、c1～c4烷基或c1～c4烷氧基；
r4为c1～c4烷基、取代或未取代的c4～c10芳基或-cf3；所述取代c4～c10芳基的取代基为卤素、c1～c4烷基、c1～c4烷氧基或-oh。
进一步的，r1为c1～c4烷基、c1～c4烷氧基、取代或未取代的苯基或
r3为-h、c1～c4烷基或c1～c4烷氧基；
r4为c1～c4烷基、取代或未取代的苯基或-cf3；所述取代苯基的取代基为-f、-cl、-br、c1～c4烷基、c1～c4烷氧基或-oh。
更进一步的，r1为c1～c4烷基、取代或未取代的苯基或
r3为-h、甲基或乙基；
r4为甲基、乙基、取代或未取代的苯基或-cf3；所述取代苯基的取代基为-f、-cl、-br、甲基或乙基。
最优选的，r1为甲基、乙基、异丙基、
上述h-[1,2,3]三氮唑并[4,5-c]喹啉衍生物，当r2为
其中，r1为c1～c4烷基、c1～c4烷氧基、取代或未取代的c4～c10芳基或
r3为-h、c1～c4烷基或c1～c4烷氧基；
r4为c1～c4烷基、取代或未取代的c4～c10芳基或-cf3；所述取代c4～c10芳基的取代基为卤素、c1～c4烷基、c1～c4烷氧基或-oh。
作为优选的方案，r1为c1～c4烷基、c1～c4烷氧基、取代或未取代的c4～c10芳基或
r3为-h、c1～c4烷基或c1～c4烷氧基；
r4为c1～c4烷基、取代或未取代的c4～c10芳基或-cf3；所述取代c4～c10芳基的取代基为卤素、c1～c4烷基、c1～c4烷氧基或-oh。
优选的，r1为c1～c4烷基、c1～c4烷氧基、取代或未取代的c4～c10芳基或
r3为-h、c1～c4烷基或c1～c4烷氧基；
r4为c1～c4烷基、取代或未取代的c4～c10芳基或-cf3；所述取代c4～c10芳基的取代基为卤素、c1～c4烷基、c1～c4烷氧基或-oh。
进一步的，r1为c1～c4烷基、c1～c4烷氧基、取代或未取代的苯基或
r3为-h、c1～c4烷基或c1～c4烷氧基；
r4为c1～c4烷基、取代或未取代的苯基或-cf3；所述取代苯基的取代基为-f、-cl、-br、c1～c4烷基、c1～c4烷氧基或-oh。
更进一步的，r1为c1～c4烷基、取代或未取代的苯基或
r3为-h、甲基或乙基；
r4为甲基、乙基、取代或未取代的苯基或-cf3；所述取代苯基的取代基为-f、-cl、-br、甲基或乙基。
最优选的，r1为甲基、乙基、异丙基、
上述1h-[1,2,3]三氮唑并[4,5-c]喹啉衍生物，结构式如下：
本发明还提供了上述1h-[1,2,3]三氮唑并[4,5-c]喹啉衍生物的制备方法，式ⅰ所示化合物的主干合成路线见如下：
方案一
a、化合物1与2-硝基乙醛肟发生取代反应得到化合物2；所述反应温度为15℃～35℃；所述反应化合物1与2-硝基乙醛肟的摩尔比为1﹕1～5；所述反应时间为12h～24h；所述反应溶剂为水；
b、化合物2高温脱水关环得化合物3；所述反应溶剂为醋酸酐；所述反应中间体2与醋酸钾的摩尔比为1﹕1.1～2；所述反应温度为110℃～130℃；所述反应时间为1.5h～3h；
c、化合物3在氯代试剂中回流得氯代的中间体4；所述氯代试剂为三氯氧磷、三氯化磷、五氯化磷等中的一种；所述反应温度为90℃～120℃；所述反应时间为4h～12h；
d、r1取代的胺与中间体4在有机醇作溶剂、有机碱存在下发生亲核取代反应得化合物5；所述有机醇为乙醇、异丙醇、叔丁醇、正丁醇等中的一种；所述有机碱为三乙胺、n,n-二异丙基乙胺、甲基吗啉等中的一种；所述反应中间体4与取代胺的摩尔比为1﹕1～3；
e、化合物5的硝基经fe/hac还原得对应胺6；所述还原中化合物5、铁粉摩尔量比值为1﹕4～6；所述的反应温度为70℃～90℃；
f、醋酸/水作溶剂，中间体6经历重氮化/缩合反应关环形成三氮唑中间体7；所述醋酸、水混合溶剂的体积比为3﹕1～1﹕3；所述反应中间体6与亚硝酸钠的摩尔量比值为1﹕1～1.5；所述的反应温度为0℃～25℃；
g、中间体7与购买的或制备的芳香硼酸(或酯)或有机胺在过渡金属催化下、碱存在下发生偶联反应，制备得到终产物8-31；所述的过渡金属为pd(pph3)4、pd(oac)2、pd2(dba)3、pd(pph3)2cl2、pd(pph3)2cl2·dcm、pd(dppf)cl2等中的任意一种；所述的碱为cs2co3、k2co3、na2co3等中的任意一种；所述中间体7、芳香硼酸(或酯)或有机胺、过渡金属、碱的摩尔比为1︰1～1.2︰0.03～0.2︰2～4；所述反应温度为80℃～120℃；所述反应时间为8h～24h；
其中，r2为-h、-oh、卤素、c1～c4烷基、c1～c4烷氧基、取代或未取代的c4～c10芳基或取代或未取代的5～14元饱和或不饱和杂环；所述5～14元饱和或不饱和杂环含有1～3个杂原子，杂原子为n、o或s；所述取代c4～c10芳基的取代基为-oh、-conh2、-cn、卤素、c1～c4烷基、c1～c4烷氧基或c1～c4的羰基；所述取代5～14元饱和或不饱和杂环的取代基为-oh、-conh2、-cn、卤素、c1～c4烷基、c1～c4烷氧基、c1～c4羰基或c1～c4烷基取代的5～8元饱和杂环；所述c1～c4烷基取代的5～8元饱和杂环含有1～3个杂原子，杂原子为n、o或s；
r1为c1～c4烷基、c1～c4烷氧基、取代或未取代的c4～c10芳基或
r3为-h、c1～c4烷基或c1～c4烷氧基；
r4为c1～c4烷基、取代或未取代的c4～c10芳基或-cf3；所述取代c4～c10芳基的取代基为卤素、c1～c4烷基、c1～c4烷氧基或-oh。
当r2为
方案二
h、邻氨基苯酚与原甲酸酯缩合关环制得5-溴苯并噁唑；所述原甲酸酯为原甲酸三甲酯、原甲酸三乙酯、原甲酸三异丙酯等中的一种；所述反应中邻氨基苯酚质量与原甲酸酯体积的比值为1﹕5～20；所述反应温度为60℃～90℃；所述反应时间为6h～12h；
i、5-溴苯并噁唑经宫浦硼基化反应制得苯并噁唑-5-硼酸频哪醇酯；所述反应所用金属催化剂为pd(dppf)cl2、pd(dppf)cl2·dcm、pd(dba)2、[ir(cod)(ome)]2等中的一种；所述反应所用碱为koac、naoac、k3po4、k2co3等中的一种；所述反应中5-溴苯并噁唑、联硼酸频哪醇酯、金属催化剂、碱的摩尔比为1︰1.1～1.5︰0.03～0.2︰2～4；所述反应溶剂为dmso、二氧六环、甲苯、dme等中的一种；所述反应温度为80～110℃；所述反应时间为8h～12h；
g、中间体7与苯并噁唑-5-硼酸频哪醇酯在过渡金属催化下、碱存在下发生偶联反应，制备得到终产物10；所述的过渡金属为pd(pph3)4、pd(oac)2、pd2(dba)3、pd(pph3)2cl2、pd(pph3)2cl2·dcm、pd(dppf)cl2等中的任意一种；所述的碱为cs2co3、k2co3、na2co3等中的任意一种；所述中间体7、苯并噁唑-5-硼酸频哪醇酯、过渡金属、碱的摩尔比为1︰1～1.2︰0.05～0.2︰2～4；所述反应温度为80℃～120℃；所述反应时间为12h～24h；
其中，r1为c1～c4烷基、c1～c4烷氧基、取代或未取代的c4～c10芳基或
r3为-h、c1～c4烷基或c1～c4烷氧基；
r4为c1～c4烷基、取代或未取代的c4～c10芳基或-cf3；所述取代c4～c10芳基的取代基为卤素、c1～c4烷基、c1～c4烷氧基或-oh。
当r2为
方案三
h、邻氨基苯酚与原甲酸酯缩合关环制得6-溴苯并噁唑；所述原甲酸酯为原甲酸三甲酯、原甲酸三乙酯、原甲酸三异丙酯等中的一种；所述反应中邻氨基苯酚质量与原甲酸酯体积的比值为1﹕5～20；所述反应温度为60℃～90℃；所述反应时间为6h～12h；
i、6-溴苯并噁唑经宫浦硼基化反应制得苯并噁唑-6-硼酸频哪醇酯；反应所用金属催化剂为pd(dppf)cl2、pd(dppf)cl2·dcm、pd(dba)2、[ir(cod)(ome)]2等中的一种；所述反应所用碱为koac、naoac、k3po4、k2co3等中的一种；所述反应中，6-溴苯并噁唑、联硼酸频哪醇酯、金属催化剂、碱的摩尔比为1︰1.1～1.5︰0.03～0.2︰2～4；所述反应溶剂为dmso、二氧六环、甲苯、dme等中的一种；所述反应温度为80～110℃；所述反应时间8h～12h；
g、中间体7与自制的苯并噁唑-6-硼酸频哪醇酯在过渡金属催化下、碱存在下发生偶联反应，制备得到终产物11；所述的过渡金属为pd(pph3)4、pd(oac)2、pd2(dba)3、pd(pph3)2cl2、pd(pph3)2cl2·dcm、pd(dppf)cl2等中的任意一种；所述的碱为cs2co3、k2co3、na2co3等中的任意一种；所述中间体7、苯并噁唑-6-硼酸频哪醇酯、过渡金属、碱的摩尔比为1︰1～1.2︰0.05～0.2︰2～4；所述反应温度为80℃～120℃；所述反应时间为8h～24h；
其中，r1为c1～c4烷基、c1～c4烷氧基、取代或未取代的c4～c10芳基或
r3为-h、c1～c4烷基或c1～c4烷氧基；
r4为c1～c4烷基、取代或未取代的c4～c10芳基或-cf3；所述取代c4～c10芳基的取代基为卤素、c1～c4烷基、c1～c4烷氧基或-oh。
当r2为
方案四
g、中间体7与3,4-二甲氧基苯硼酸在过渡金属催化下、碱存在下发生偶联反应，制备得化合物12；所述的过渡金属为pd(pph3)4、pd(oac)2、pd2(dba)3、pd(pph3)2cl2、pd(pph3)2cl2·dcm、pd(dppf)cl2等中的任意一种；所述的碱为cs2co3、k2co3、na2co3等中的任意一种；所述中间体7、3,4-二甲氧基苯硼酸、过渡金属、碱的摩尔比为1︰1～1.2︰0.05～0.2︰2～4；所述反应温度为80℃～120℃；所述反应时间为8h～24h；
j、化合物12与三溴化硼在二氯甲烷溶剂中进行脱甲基反应，制备得到化合物13；所述的化合物12与三溴化硼的摩尔比为1︰3～8；所述反应温度为0℃～25℃；所述反应时间为12h～24h；
其中，r1为c1～c4烷基、c1～c4烷氧基、取代或未取代的c4～c10芳基或
r3为-h、c1～c4烷基或c1～c4烷氧基；
r4为c1～c4烷基、取代或未取代的c4～c10芳基或-cf3；所述取代c4～c10芳基的取代基为卤素、c1～c4烷基、c1～c4烷氧基或-oh。
当r2为
方案五
k、吡咯并吡啶在碱的存在下与酰氯反应得酰胺中间体；所述的碱为nah、k2co3、cs2co3、naoh、koh、叔丁醇钠、叔丁醇钾等中的一种；所述的酰氯为甲磺酰氯、苯磺酰氯、对甲苯磺酰氯等中一种(式中以苯磺酰氯为例，若换用列举的其它酰氯，不影响化合物14的最终制备)；所述反应溶剂为dmf、dme、乙腈、二氧六环、thf等中的一种；所述反应温度为0℃～60℃；所述反应时间30min～12h；
i、4-溴-1-苯磺酰基-1h-吡咯并[2,3-b]吡啶经宫浦硼基化反应制得1-苯磺酰基-1h-吡咯并[2,3-b]吡啶-4-硼酸频哪醇酯；所述反应所用金属催化剂为pd(dppf)cl2、pd(dppf)cl2·dcm、pd(dba)2、[ir(cod)(ome)]2等中的一种；所述反应所用碱为koac、naoac、k3po4、k2co3等中的一种；所述反应中，4-溴-1-苯磺酰基-1h-吡咯并[2,3-b]吡啶、联硼酸频哪醇酯、金属催化剂、碱的摩尔比为1︰1.1～1.5︰0.03～0.2︰2～4；所述反应所用溶剂为dmso、二氧六环、甲苯、dme等中的一种；所述反应温度为80～110℃；所述反应时间8h～12h；
g、中间体7与1-苯磺酰基-1h-吡咯并[2,3-b]吡啶-4-硼酸频哪醇酯在过渡金属催化下、碱存在下发生偶联反应，制备得中间体8-(1-苯磺酰基-1h-吡咯并[2,3-b]吡啶-4-基)-1h-[1,2,3]三氮唑并[4,5-c]喹啉；所述的过渡金属为pd(pph3)4、pd(oac)2、pd2(dba)3、pd(pph3)2cl2、pd(pph3)2cl2·dcm、pd(dppf)cl2等中的任意一种；所述的碱为cs2co3、k2co3、na2co3等中的任意一种；所述反应中间体7、1-苯磺酰基-1h-吡咯并[2,3-b]吡啶-4-硼酸频哪醇酯、过渡金属、碱的摩尔比为1︰1～1.2︰0.05～0.2︰2～4；所述反应温度为80℃～120℃；所述反应时间为8h～24h；
l、8-(1-苯磺酰基-1h-吡咯并[2,3-b]吡啶-4-基)-1h-[1,2,3]三氮唑并[4,5-c]喹啉在碱性溶液中水解得化合物14；所述碱性溶液所用的碱为氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸铯等中的一种；所述溶液溶质为水与醇的混合物，二者比例为5︰1～1︰5；所述的醇为甲醇、乙醇、异丙醇、叔丁醇等有机醇中的一种或组合；反应温度为室温～100℃；反应时间为30min～24h；
其中，r1为c1～c4烷基、c1～c4烷氧基、取代或未取代的c4～c10芳基或
r3为-h、c1～c4烷基或c1～c4烷氧基；
r4为c1～c4烷基、取代或未取代的c4～c10芳基或-cf3；所述取代c4～c10芳基的取代基为卤素、c1～c4烷基、c1～c4烷氧基或-oh。
当r2
方案六
m、中间体7与吗啉在金属催化剂与配体的催化下发生偶联反应，制备得化合物15；所述的过渡金属为pd(pph3)4、pd(oac)2、pd2(dba)3、pd(pph3)2cl2、pd(pph3)2cl2·dcm、pd(dppf)cl2、pdcl(ally)2、cui、cu2o、cucl、cu等中的任意一种；所述的配体为x-phos、s-phos、brettphos、ruphos、tbuxphos、davephos、johnphos、xanphos、dpephos、binap等中的任意一种；所述反应所用碱为cs2co3、k2co3、na2co3、叔丁醇钠、叔丁醇钾等中的任意一种；所述中间体7、吗啉、金属催化剂、配体、碱的摩尔比为1︰1～30︰0.03～0.1︰0.1～0.2︰2～4；所述反应温度为80℃～120℃；所述反应时间为12h～24h；
其中，r1为c1～c4烷基、c1～c4烷氧基、取代或未取代的c4～c10芳基或
r3为-h、c1～c4烷基或c1～c4烷氧基；
r4为c1～c4烷基、取代或未取代的c4～c10芳基或-cf3；所述取代c4～c10芳基的取代基为卤素、c1～c4烷基、c1～c4烷氧基或-oh。
本发明上述的1h-[1,2,3]三氮唑并[4,5-c]喹啉衍生物，包括了它们的同位素化合物、外消旋体、旋光活性异构体、多晶型形式或其混合物。
本发明还提供了上述1h-[1,2,3]三氮唑并[4,5-c]喹啉衍生物药学上可接受的盐。
本发明还提供了本发明化合物的前药，依据本发明，前药是上述化合物的衍生物，它们自身可能具有较弱的活性或甚至没有活性，但是在给药后，在生理条件下(例如通过代谢、溶剂分解或另外的方式)被转化成相应的生物活性形式。
本发明还提供了上述1h-[1,2,3]三氮唑并[4,5-c]喹啉衍生物药学上可接受的水合物。
本发明还提供一种药物组合物，是由本发明提供的上述1h-[1,2,3]三氮唑并[4,5-c]喹啉衍生物、盐或水合物添加药学上可以接受的辅助性成分制备而成的。本发明提供的1h-[1,2,3]三氮唑并[4,5-c]喹啉衍生物结构如式ⅰ～ⅹ所示。
本发明还提供了上述1h-[1,2,3]三氮唑并[4,5-c]喹啉衍生物、盐或水合物在制备激酶抑制剂中的用途。
进一步的，上述激酶抑制剂为抑制clk1、clk2、clk4、dyrk1a、dyrk1b、dna-pk、trka等激酶的药物。
本发明还提供了上述1h-[1,2,3]三氮唑并[4,5-c]喹啉衍生物、盐或水合物在制备治疗clk1/2/4或dyrk1a/1b过表达相关疾病的药物或自噬失调相关疾病的药物中的用途。
进一步的，上述clk1/2/4或dyrk1a/1b过表达相关疾病包括神经退行性疾病、肿瘤、病毒感染等。
进一步的，上述自噬失调相关疾病包括神经退行性疾病、药源性肝损伤、缺血再灌注损伤、ⅱ型糖尿病、肥胖、代谢综合征、癌症、红斑狼疮、庞贝氏症、戈谢病等。
附图说明
图1.化合物10e对skov-3、bnccl.2细胞sr蛋白磷酸化的影响
图2.化合物10e对于skov-3细胞中lc3蛋白以及p62/sqstm1蛋白表达水平的影响
图3.化合物10e浓度依耐性影响bnlcl.2细胞中lc3ⅱ蛋白以及p62/sqstm1蛋白表达水平
图4.化合物10e时间依耐性影响bnlcl.2细胞中lc3ⅱ蛋白以及p62/sqstm1蛋白表达水平
图5.部分其它化合物对skov-3细胞lc3蛋白表达水平的影响
图6.化合物10e对skov-3、bnlcl.2细胞sr蛋白形态、定位的影响
图7.共聚焦显微镜检测10e诱导的自噬与自噬流数据统计图
图8.化合物10e对apap诱导的小鼠急性肝损伤的保护作用
图9.化合物8l对apap诱导的小鼠急性肝损伤的保护作用
具体实施方式
实施例16-溴-4-氯-3-硝基喹啉的制备
第一步，制备(e)-5-溴-2-((2-硝基乙烯基)氨基)苯甲酸：
向10：1的水-浓hcl混合溶液中加入25g(115.72mmol)的2-氨基-5-溴苯甲酸，搅拌8h后过滤，收集滤液得溶液a。35g的冰与15.3g(382.53mmol)的naoh在冰浴中搅拌均匀，随后向其中慢慢加入8.17g(133.85mmol)的硝基甲烷。加毕，在冰水浴中搅拌1h，再在常温搅拌1h。接着，溶液倒入提前配好的0℃酸性水溶液中(28g冰+42ml浓hcl)，得到溶液b。溶液a与b混合并在室温下搅拌过夜。过滤黄色固体，水洗滤饼，真空干燥得粗产品，不需要进一步纯化，直接用于下一步反应。
第二步，制备6-溴-3-硝基喹啉-4-羟基
5-溴-2-((2-硝基乙烯基)氨基)苯甲酸(5g，17.42mmol)与醋酸钾(2.05g，20.90mmol)在120℃的醋酸酐中搅拌2h。过滤固体，乙酸洗涤直至滤液无色。进一步水洗滤饼并真空干燥得目标化合物(2.32g，两步收率14.21％)。1hnmr(400mhz,dmso)δ13.21(s,1h),9.24(s,1h),8.32(d,j＝2.3hz,1h),7.96(dd,j＝8.8,2.3hz,1h),7.71(d,j＝8.8hz,1h).esi-msm/z:268.9[m+h]+.
第三步，制备6-溴-4-氯-3-硝基喹啉：
6-溴-3-硝基喹啉-4-羟基(2g，7.43mmol)在100℃的pocl3中反应4h，冷却至室温后慢慢用沙冰淬灭反应。nahco3水液中和后，乙酸乙酯萃取有机相并用无水na2so4干燥。过滤，滤液减压蒸干溶剂得棕色粗产品(2.1g，98.13％收率)。
实施例26-溴-n-甲基-3-硝基喹啉-4-氨基(5a)的制备
6-溴-4-氯-3-硝基喹啉(1g，3.48mmol)和三乙胺(703.96mg，6.96mmol)溶于乙醇，常温下慢慢加入甲胺盐酸盐(234.84mg，3.48mmol)。反应液升温至60℃反应4h。反应毕，溶剂真空浓缩后加入水，过滤固体并真空干燥得产品。esi-msm/z281.9[m+h]+.
实施例3中间体5b～5q的制备
以不同的取代胺为原料，采用与实施例2相似的条件，亲核取代得到目标中间体5b～5q。
实施例48-溴-1-甲基-1h-[1,2,3]三氮唑[4,5-c]喹啉(7a)制备
1g(3.54mmol)的6-溴-n-甲基-3-硝基喹啉-4-氨基溶解于约30ml醋酸中，升温至60℃，,随后分批加入989.82mg(17.72mmol)铁粉。tlc监测反应完成后，反应液冷却至室温，粗产物6a溶解于醋酸。
反应瓶转移至冰浴中，搅拌下向瓶内加入60ml水，并用浓盐酸调节ph值2～3。随后，在剧烈搅拌下，10.64ml的0.5m的亚硝酸钠水溶液慢慢滴入反应瓶。滴毕，室温继续搅拌约半小时。随后，向反应瓶内加入大量水，并且调节ph值5～6。乙酸乙酯萃取水液，合并有机相干燥，过滤，滤液减压蒸干得粗产品，再经柱层析分离得目标化合物730.26mg，两步收率78.3％。
1hnmr(400mhz,cdcl3)δ9.54(s,1h),8.47(d,j＝2.1hz,1h),8.21(d,j＝8.9hz,1h),7.93(dd,j＝8.9,2.1hz,1h),4.71(s,3h).13cnmr(101mhz,cdcl3)δ145.45,144.20,141.28,133.04,132.62,123.94,121.75,117.02,100.00,37.60.esi-msm/z262.9[m+h]+.
实施例5中间体7b～7q的制备
以不同中间体5a～5q为起始原料，采用与实施例4相似的方法，分别得到中间体7b～7q。
实施例61-甲基-8-(2-甲基吡啶-4-基)-1h-[1,2,3]三氮唑[4,5-c]喹啉(8a)的制备
8-溴-1-甲基-1h-[1,2,3]三氮唑[4,5-c]喹啉(55mg，209.05μmol)、(2-甲基吡啶-4-基)硼酸(28.63mg，209.05μmol)、pd(dppf)cl2(15.3mg，20.9μmol)以及k2co3(86.67mg，627.14μmol)先后加入二氧六环-水(4：1)的混合溶液中，n2置换三次后升温至100℃反应24h。减压蒸干溶剂，色谱柱层析分离得目标化合物37.4mg，43.2％收率，98.1％hplc纯度。
1hnmr(400mhz,dmso)δ9.58(s,1h),8.81(d,j＝1.8hz,1h),8.61(d,j＝5.2hz,1h),8.37(d,j＝8.7hz,1h),8.29(dd,j＝8.7,1.9hz,1h),7.86(s,1h),7.79(dd,j＝5.2,1.5hz,1h),4.84(s,3h),2.61(s,3h).13cnmr(101mhz,dmso)δ159.28,150.17,146.79,145.77,145.36,141.16,136.93,133.70,131.21,128.72,121.61,121.58,119.59,116.32,38.10,24.70.esi-msm/z276.2[m+h]+.
实施例7化合物8b–8n、8q的制备
采用同实施例6类似的合成方法，(2-甲基吡啶-4-基)硼酸与中间体7b–7n、7q分别反应得对应产物8b–8n、8q。
实施例8化合物9a–9h、9m–9q的制备
采用同实施例6类似的合成方法，3,4-亚甲基苯硼酸与中间体7a–7h、7m–7q分别反应得对应产物9a–9h、9m–9q。
实施例9化合物(s)-5-(1-(1-(4-氟苯基)乙基)-1h-[1,2,3]三氮唑[4,5-c]喹啉-8-基)苯并[d]噁唑(10e)的制备
第一步：制备5-溴苯并噁唑
在氮气保护下，2-氨基-4-溴苯酚(2g，10.64mmol)加入30ml原甲酸三乙酯，回流8h。tlc监测反应完全后冷却至室温，减压蒸馏除去原甲酸三乙酯得粗产物，进一步柱层析分离得白色产物1.89g，收率89.5％。1hnmr(400mhz,dmso)δ8.82(s,1h),8.07(d,j＝1.9hz,1h),7.79(d,j＝8.7hz,1h),7.62(dd,j＝8.7,2.0hz,1h).
第二步：制备苯并噁唑-5-硼酸频哪醇酯
5-溴苯并噁唑(1g，5.05mmol)、联硼酸频哪醇酯(1.54g，6.06mmol)、醋酸钾(1.49g，15.15mmol)以及pd(dppf)cl2(184.76mg，0.25mmol)依次加入烧瓶，在氮气保护下，二氧六环作溶剂于100℃搅拌8h。冷却至室温后，减压蒸干溶剂，柱层析分离得类白色粉末1.03g，收率83.4％。1hnmr(400mhz,dmso)δ8.82(s,1h),7.96(s,1h),7.81(d,j＝7.9hz,1h),7.71(d,j＝7.9hz,1h),1.32(s,12h).13cnmr(101mhz,dmso)δ154.87,152.05,140.05,132.20,126.71,125.29,111.42,84.33,25.13.esi-msm/z246.1[m+h]+.
第三步：制备(s)-5-(1-(1-(4-氟苯基)乙基)-1h-[1,2,3]三氮唑[4,5-c]喹啉-8-基)苯并[d]噁唑
以苯并噁唑-5-硼酸频哪醇酯、(s)-8-溴-1-(1-(4-氟苯基)乙基)-1h-[1,2,3]三氮唑[4,5-c]喹啉为原料，采用实施例6相同的条件得目标化合物10e。1hnmr(400mhz,dmso)δ9.63(s,1h),8.87(s,1h),8.52(d,j＝1.4hz,1h),8.32(d,j＝8.7hz,1h),8.24(dd,j＝8.7,1.7hz,1h),8.18(d,j＝1.0hz,1h),8.00(d,j＝8.3hz,1h),7.78(dd,j＝8.3,1.5hz,1h),7.32(dd,j＝8.6,5.4hz,2h),7.20(t,j＝8.8hz,2h),7.07(q,j＝6.6hz,1h),2.22(d,j＝6.7hz,3h).13cnmr(101mhz,dmso)δ163.26,160.83,155.66,150.72,145.46,144.89,141.39,140.22,139.24,138.01,137.36,133.16,131.29,129.39,128.48,128.40,124.84,121.56,121.02,116.60,116.39,115.72,110.50,60.07,23.56.esi-msm/z410.1[m+h]+.
实施例10化合物(s)-6-(1-(1-(4-氟苯基)乙基)-1h-[1,2,3]三氮唑[4,5-c]喹啉-8-基)苯并[d]噁唑(11e)的制备
以2-氨基-5-溴苯酚为起始原料，采用实施例9所示方法得目标化合物11e。1hnmr(400mhz,dmso)δ9.63(s,1h),8.87(s,1h),8.51(s,1h),8.32(d,j＝8.7hz,1h),8.23(dd,j＝8.6,1.6hz,1h),8.19(s,1h),7.99(d,j＝8.5hz,1h),7.79(d,j＝7.2hz,1h),7.35–7.27(m,2h),7.19(t,j＝8.8hz,2h),7.07(q,j＝6.6hz,1h),2.21(d,j＝6.7hz,3h).13cnmr(101mhz,dmso)δ163.26,160.83,155.65,150.71,145.44,144.88,141.38,140.21,139.22,138.00,137.35,133.14,131.27,129.36,128.48,128.39,124.82,121.54,121.00,116.59,116.38,115.70,110.48,60.08,23.55.esi-msm/z410.1[m+h]+.
实施例11化合物(r)-4-(1-(1-(4-氟苯基)乙基)-1h-[1,2,3]三氮唑[4,5-c]喹啉-8-基)苯-1,2-二酚(13f)的制备
75mg(175μmol)的(r)-8-(3,4-二甲氧基苯基)-1-(1-(4-氟苯基)乙基)-1h-[1,2,3]三氮唑[4,5-c]喹啉、10ml二氯甲烷先后加入反应瓶中，冰水浴冷却。搅拌下慢慢滴入bbr3(101μl，1.05mmol)，滴毕，室温继续反应12h。蒸馏除去烷基溴之后，甲醇淬灭反应，再次减压蒸干溶剂得粗产品，柱层析分离得目标化合物(类白色粉末，11mg，15.69％收率)。1hnmr(400mhz,dmso)δ9.55(s,1h),9.31(s,1h),9.09(s,1h),8.32(s,1h),8.22(d,j＝8.7hz,1h),8.01(d,j＝8.5hz,1h),7.36–7.25(m,2h),7.25–7.11(m,3h),7.04–6.86(m,3h),2.20(d,j＝6.5hz,3h).esi-msm/z401.1[m+h]+.
实施例12(s)-1-(1-苯乙基)-8-(1h-吡咯并[2,3-b]吡啶-4-基)-1h-[1,2,3]三氮唑并[4,5-c]喹啉(14g)的制备
第一步：制备4-溴-1-苯磺酰基-1h-吡咯并[2,3-b]吡啶
4-溴-1h-吡咯并[2,3-b]吡啶(1g，5.08mmol)溶解于无水thf，置于冰水浴中保温，分批加入nah(608.97mg，15.23mmol)，加毕，搅拌10分钟。慢慢加入苯磺酰氯(986mg，5.58mmol)，加毕，继续搅拌20分钟。减压浓缩，加水萃取，收集有机相，碱水洗涤有机相，干燥有机相，过滤，收集滤液减压蒸干，再用石油醚、乙酸乙酯混合液洗涤得目标化合物。1hnmr(400mhz,dmso)δ8.25(d,j＝5.2hz,1h),8.17–8.09(m,2h),8.06(d,j＝4.1hz,1h),7.74(t,j＝7.5hz,1h),7.63(dd,j＝14.7,6.7hz,3h),6.80(d,j＝4.1hz,1h).esi-msm/z196.9[m+h]+.
第二步：制备1-苯磺酰基-1h-吡咯并[2,3-b]吡啶-4-硼酸频哪醇酯
4-溴-1-苯磺酰基-1h-吡咯并[2,3-b]吡啶(200mg，593.1μmol)、联硼酸频哪醇酯(225.9mg，889.7μmol)、醋酸钾(174.6mg，1.78mmol)以及pd(dppf)cl2(43.4mg，59.3μmol)依次加入烧瓶，在氮气保护下，二氧六环作溶剂于100℃搅拌8h。冷却至室温后，减压蒸干溶剂，柱层析分离得类白色粉末(156mg，68.4％收率)。1hnmr(400mhz,dmso)δ8.39(d,j＝4.7hz,1h),8.11–8.04(m,2h),7.98(d,j＝4.0hz,1h),7.71(t,j＝7.4hz,1h),7.61(t,j＝7.7hz,2h),7.48(d,j＝4.7hz,1h),6.97(d,j＝4.0hz,1h),1.33(s,12h).esi-msm/z385.1[m+h]+.
第三步：制备(s)-1-(1-苯基乙基)-8-(1-苯磺酰基-1h-吡咯并[2,3-b]吡啶-4-基)-1h-[1,2,3]三氮唑并[4,5-c]喹啉
以1-苯磺酰基-1h-吡咯并[2,3-b]吡啶-4-硼酸频哪醇酯、(s)-8-溴-1-(1-苯基乙基)-1h-[1,2,3]三氮唑[4,5-c]喹啉为起始原料，采用实施例相同的条件得到目标化合物。1hnmr(400mhz,dmso)δ9.68(s,1h),8.53(d,j＝4.8hz,1h),8.46(s,1h),8.35(d,j＝8.5hz,1h),8.20(d,j＝7.4hz,2h),8.08(d,j＝8.5hz,1h),8.02(d,j＝3.8hz,1h),7.79–7.73(m,1h),7.67(t,j＝7.5hz,2h),7.38–7.24(m,4h),7.10(d,j＝6.9hz,2h),6.88(d,j＝6.6hz,1h),6.64(d,j＝3.8hz,1h),2.18(d,j＝6.5hz,3h).esi-msm/z531.1[m+h]+.
第四步：制备(s)-1-(1-苯乙基)-8-(1h-吡咯并[2,3-b]吡啶-4-基)-1h-[1,2,3]三氮唑并[4,5-c]喹啉
向(s)-1-(1-苯基乙基)-8-(1-苯磺酰基-1h-吡咯并[2,3-b]吡啶-4-基)-1h-[1,2,3]三氮唑并[4,5-c]喹啉(50mg，94.23μmol)的乙醇溶液中加入50％的氢氧化钠水溶液，回流反应8h。冷却至室温后，减压挥发乙醇，再用乙酸乙酯萃取。合并有机相干燥，过滤，收集滤液并减压蒸干得粗品，再经柱层析分离纯化得目标化合物(白色粉末，28.1mg，76.4％收率)。1hnmr(400mhz,dmso)δ11.90(s,1h),9.69(s,1h),8.56(d,j＝1.4hz,1h),8.39(d,j＝8.4hz,1h),8.37(d,j＝6.0hz,1h),8.22(dd,j＝8.6,1.7hz,1h),7.57(t,j＝2.8hz,1h),7.36(t,j＝7.6hz,2h),7.29(t,j＝7.6hz,1h),7.14(d,j＝5.2hz,1h),7.12(d,j＝7.2hz,2h),6.90(q,j＝6.6hz,1h),6.37(dd,j＝3.6,1.6hz,1h),2.21(d,j＝6.8hz,3h).esi-msm/z:391.2[m+h]+.
实施例13(s)-4-(1-(1-(4-氟苯基)乙基)-1h-[1,2,3]三氮唑[4,5-c]喹啉-8-基)吗啉(15e)的制备
(s)-8-溴-1-(1-苯乙基)-1h-[1,2,3]三氮唑[4,5-c]喹啉(50mg，141.55μmol)、吗啉(123.32mg，1.42mmol)、pd2(dba)3(12.96mg，14.16μmol)以及k2co3(58.69mg，424.66μmol)加入叔丁醇中搅拌。n2置换三次后，混合液于100℃搅拌过夜。减压蒸干溶剂得粗产品，经柱层析分离纯化得到目标化合物(白色粉末，42.3mg，83.2％收率)。1hnmr(400mhz,dmso)δ9.33(s,1h),8.03(d,j＝9.2hz,1h),7.58(dd,j＝9.3,2.6hz,1h),7.34(d,j＝2.2hz,1h),7.26–7.16(m,4h),6.86(q,j＝6.8hz,1h),3.80(t,j＝4.8hz,3h),3.32–3.26(m,2h),3.19–3.10(m,2h),2.17(d,j＝6.8hz,3h).esi-msm/z378.2[m+h]+.
实施例14化合物10a–10d、10f–10k、10m、10n的制备
采用同实施例9类似的合成方法，自制的苯并噁唑-5-硼酸频哪醇酯与中间体7a–7d、7f–7k、7m、7n分别反应得对应产物10a–10d、10f–10k、10m、10n。
实施例15化合物11b、11c、11f–11h、11m、11n的制备
采用同实施例10类似的合成方法，自制的苯并噁唑-6-硼酸频哪醇酯与中间体7b、7c、7f–7h、7m、7n分别反应得对应产物11b、11c、11f–11h、11m、11n。
实施例16化合物12f、12g、12h的制备
3,4-二甲氧基苯硼酸分别与7f、7g、7h在实施例6条件下反应，得对应终产物12f、12g、12h。
实施例17化合物13g、13h的制备
12g、12h在实施例11条件下反应，得对应终产物13g、13h。
实施例18(s)-4-(1-(1-苯乙基)-1h-[1,2,3]三氮唑[4,5-c]喹啉-8-基)吗啉(15g)的制备
以吗啉、中间体7g为起始原料，采用实施例13的条件得到化合物15g。1hnmr(400mhz,dmso)δ9.33(s,1h),8.02(d,j＝9.2hz,1h),7.56(d,j＝9.2hz,1h),7.41–7.31(m,3h),7.27(t,j＝7.2hz,1h),7.17(d,j＝7.6hz,2h),6.83(q,j＝6.4hz,1h),3.78(t,j＝4.6hz,4h),3.31–3.21(m,2h),3.17–3.06(m,2h),2.18(d,j＝6.7hz,3h).esi-msm/z360.2[m+h]+.
实施例19化合物16c–16e的制备
3,5-二甲基异噁唑-4-硼酸与7c–7e为反应底物，采用实施例6的条件得到化合物16c–16e。
实施例20化合物17e–31e的制备
采用实施例6中的条件，中间体7e分别与不同的芳香硼酸(或酯)反应得化合物。
实施例21化合物26f、29g、30g、31g的制备
采用实施例6中的条件，中间体7f与(1-甲基-1h-吡唑-4-基)硼酸反应得26f，中间体7g分别与苯并呋喃-5-硼酸、苯并噻唑-6-硼酸、苯并噻唑-5-硼酸反应得到对应化合物29g、30g、31g。
实施例22激酶抑制实验
本实验的目的是检测本发明化合物对体外激酶的抑制活性，采用的方法为同位素标记法(标记atp上的γ磷酸基团)。本实验分别对357种激酶进行体外活性抑制测试。受试化合物的激酶抑制活性用ic50(半数抑制浓度)或受试化合物在10μm浓度下对激酶活性的抑制率来表示。ic50值可通过受试化合物在一系列不同浓度下对激酶活性的抑制率计算而获得。实验方法如下：在一个反应管中，依次加入缓冲液(8mmmops,ph7.0,0.2mmedta,10mmmncl2)，待测激酶(5-10mu)、待测激酶的底物，10mm的醋酸镁和γ33p-atp溶液，以及不同浓度的受试化合物。然后向反应中加入mgatp以启动酶反应过程，并在室温下孵育40分钟。最终用5μl的3％磷酸盐缓冲液终止反应，并把10μl的反应液滴定到filtermata膜上，用75mm的磷酸盐溶液洗三次，每次5分钟，再用甲醇洗一次。最后干燥filtermata膜并对其进行闪烁计数，闪烁计数值的大小反映了底物被磷酸化的程度，从而可以表征激酶活性被抑制情况。表1给出了部分受试化合物对clk1、dyrk1a达到50％抑制所需的浓度(ic50)。
表1.受试化合物对clk1、dyrk1a的抑制活性
表1的数据表明，部分受试化合物对于clk1、dyrk1a均具有很好的体外抑制活性，部分化合物对于clk1具有比较好的选择性。
表2给出了化合物8l在10μmol浓度下对于全激酶的抑制活性。表2中数据为给药组激酶活性相对于阴性对照组激酶活性的百分率，数值越小表明化合物对激酶的抑制越显著。
表2.化合物8l在10μm的浓度下对全激酶的抑制活性
表2的数据表明化合物8l具有良好的激酶选择性，主要抑制激酶为clk1、clk2、clk4、dyrk1a、dyrk1b、dna-pk、zak、pi3kc2γ、tech(h)activaed、fms(y969c)、flt3(d835y)、alk，化合物8l对其它靶点抑制较弱或没有抑制，较弱抑制的靶点包括lck、itk、trka、trkb、fms、flt3、sik2、pdgfrα(d842v)、pdgfrα(v561d)、mtor、mtor/fkbp12、mnk2、btk、bmx、melk等。
表3给出了化合物8e在10μmol浓度下对于全激酶的抑制活性。表3中数据为给药组激酶活性相对于阴性对照组激酶活性的百分率，数值越小表明化合物对激酶的抑制越显著。
表3.化合物8e在10μm的浓度下对全激酶的抑制活性
表3的数据表明化合物8e具有良好的激酶选择性，主要靶点为clk1、clk2、clk4、dyrk1a、dyrk1b，化合物8e对其它靶点抑制较弱或没有抑制，较弱抑制的激酶包括atm、dna-pk、irr、pim-1、melk、trka、trkb等。
表4给出了化合物10e对于全激酶的抑制活性。首先测试了10μmol的化合物10e对于全激酶的抑制率，对于抑制率超过大于50％的激酶，继续测试其ic50值。
表4.化合物10e全激酶的抑制活性(ic50)
表4的数据表明化合物10e具有良好的激酶选择性，主要靶点为clk1、clk2、clk4、dyrk1a，化合物10e对其它靶点抑制较弱或没有抑制，较弱抑制的激酶包括atm、dna-pk、trka、trkb、trkc、irr、dyrk1b、pask、pi3kc2γ、pka、pkg1α、pkg1β、prk2、prkg2、p70s6k、msk2、nek1。
实施例23细胞培养及转染
小鼠胚胎肝细胞株bnlcl.2细胞和人卵巢癌细胞株skov-3细胞分别用10％胎牛血清的dmem培养基(eagle基本培养基，品牌：gibco)和rpmi1640培养基(洛斯维公园纪念研究所研发的代号为1640的基本培养基，品牌：gibco)培养于37℃、5％co2环境中。注：skov-3和bnlcl.2细胞购自美国模式菌种收集中心(atcc)
转染前一天，将skov-3细胞接种于24孔爬片，待第二天细胞融合度为50％-70％，将培养基换成含ad-mrfp-gfp-lc3(编辑串联绿色荧光蛋白-哺乳动物红色荧光蛋白-轻链3融合蛋白的腺病毒，购自汉恒生物科技(上海)有限公司，使用时感染复数为100)和5μg/ml聚凝胺的250μl培养基37℃培养4个小时。弃去细胞上清，用新鲜培养基洗涤细胞3次后，用含化合物(10μm)或dmso(二甲亚砜)(0.1％)的培养基继续培养。
实施例24免疫印迹分析
用含pmsf(苯甲基磺酰氯)、蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂的ripa裂解液冰上裂解细胞15min，用刮板法收集细胞裂解液，经低温超声后，离心(4℃，13000rpm，15min)收集上清，将上清与sds-page(十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶)蛋白上样缓冲液(还原型)混合后置100℃恒温器上10min。蛋白样品经12％或10％sds-page电泳分离后转移至pvdf(聚偏二氟乙烯)膜。根据抗体说明书用相应的封闭液封闭，使用适宜浓度的抗体和pvdf膜4℃孵育过夜。分别用anti-lc3b(轻链3b蛋白抗体，购自novusbiologicals，货号：nb600-1384)和anti-sqstm1/p62(泛素结合蛋白p62蛋白抗体，购自proteintech)抗体标记lc3i/lc3ii(轻链3i/轻链3ii)和sqstm1/p62蛋白(泛素结合蛋白p62蛋白)，检测自噬的产生和自噬的降解程度。用anti-srproteins抗体(sr蛋白抗体，购自invitrogene，克隆号：1h4g7)来标记磷酸化的sr蛋白，检测sr蛋白的磷酸化水平。同时用anti-gapdh抗体(甘油醛-3-磷酸脱氢酶抗体，购自cst)标记gapdh(甘油醛-3-磷酸脱氢酶)作为蛋白上样量参照。辣根酸酶标记山羊抗兔免疫球蛋白g或山羊抗鼠免疫球蛋白g抗体进一步标记后，用含吐温-20的缓冲液洗涤，通过化学发光法使免疫印迹显色。使用photoshop软件对免疫印迹进行定量分析。
图1a、图1b分别表示化合物10e对于skov-3、bnccl.2两种细胞sr蛋白磷酸化的影响。在细胞内，clk1能够磷酸化sr蛋白。sr蛋白具有多个亚型，包括srp75、srp55、srp40、sc-35、sf2/asf、srp30c等，磷酸化的sr蛋白能够被单克隆抗体mab1h4g7特异性结合，再根据染色条带的深浅，可以判断细胞内各型sr蛋白的表达量。tg003为已知的clk1抑制剂，此处用作阳性对照。雷帕霉素为已知的自噬诱导剂。
图1表明，抑制clk1能够抑制sr蛋白的磷酸化。图1a、图1b显示，化合物10e在skov-3、bnlcl.2细胞中均能有效地阻断部分sr蛋白的磷酸化，且抑制作用具有一定的剂量依赖关系，表明化合物10e在活细胞内能够发挥clk抑制活性。
图2表示化合物10e对于skov-3细胞中lc3蛋白以及sqstm1/p62蛋白表达水平的影响。自噬发生时，胞浆中的lc3i转化成lc3ii，lc3ii参与自噬体的形成，因此lc3ii蛋白水平是自噬的检测指标之一。包裹内容物的自噬体会与溶酶体相融合，形成自噬溶酶体，使内容物发生降解。自噬流就是指自噬体产生到自噬溶酶体的形成并降解内容物的过程。sqstm1/p62蛋白是自噬的底物之一，因此，sqstm1/p62蛋白水平是检测自噬流是否发生障碍的指标之一。
总之，lc3ⅱ蛋白水平升高的同时伴随sqstm1/p62蛋白水平降低，表明细胞发生自噬且自噬过程顺畅。雷帕霉素是已报道的有效的自噬诱导剂，本实验以雷帕霉素作为自噬诱导的阳性化合物。tg003是已报道的clk1抑制剂，本实验以tg003作为clk1抑制剂的阳性对照。
图3、图4分别表示化合物10e的浓度以及作用时间对于bnlcl.2细胞中lc3ⅱ蛋白以及sqstm1/p62蛋白表达水平的影响。lc3ⅱ蛋白水平升高的同时伴随sqstm1/p62蛋白水平降低，表明细胞发生自噬且自噬过程顺畅。雷帕霉素是已报道的有效的自噬诱导剂，本实验以雷帕霉素作为自噬诱导的阳性化合物。tg003是已报道的clk1抑制剂，本实验以tg003作为clk1抑制剂的阳性对照。
图2、图3结果显示，化合物10e处理过的skov-3和bnlcl.2细胞中，lc3ii蛋白水平较对照组呈浓度依赖关系升高，表明，化合物10e能有效促进自噬的产生。同时，细胞经10e处理后，自噬底物sqstm1/p62蛋白水平降低，表明化合物10e不仅能促进自噬的产生，还能增强自噬流。图4结果表明，化合物10e促进自噬具有时间依赖关系，且6h时就能促进自噬。总而言之，化合物10e是一个有效的自噬诱导剂。
通过免疫印迹分析，除了化合物10e外，经检测化合物8d、8e、8h、8l、8n、9e、9q、10i、10k、11g等化合物也具有显著的体外促自噬作用，部分检测结果见图5。
实施例25免疫荧光和激光共聚焦
实验前一天将bnlcl.2和skov-3细胞接种于24孔爬片，第二天将细胞上清更换为含25或dmso的培养基继续培养24h小时。用pbs清洗细胞3次，每次3min。用经4％多聚甲醛溶液(pbs(磷酸盐缓冲溶液)配置)室温固定20min后，用pbs清洗细胞3次，每次3min。接着用0.5％tritonx-100(聚乙二醇辛基苯基醚)溶液(pbs配置)室温浸泡20min打孔后，pbs清洗4次，每次3min。用10％bsa(牛血清白蛋白)溶液(pbs配置)室温封闭30min后，直接用高浓度anti-srproteins抗体(mab1h4g7)4℃孵育过夜，标记磷酸化的sr蛋白。细胞用pbs清洗3次，每次3min。用cy3标记的山羊抗鼠免疫球蛋白g抗体避光室温孵育30min，用pbs清洗3次，每次3min。最后用dapi(4',6-二脒基-2-苯基吲哚)染核。细胞爬片用抗荧光淬灭封片剂封片。ad-mrfp-gfp-lc3(编辑串联绿色荧光蛋白-哺乳动物红色荧光蛋白-轻链3融合蛋白的腺病毒，购自汉恒生物科技(上海)有限公司，使用时感染复数为100)转染的细胞用pbs清洗后，经4％多聚甲醛溶液(pbs配置)固定，即可取出爬片用抗荧光淬灭封片剂封片。细胞爬片置于正置激光共聚焦显微镜下，用40倍或63倍油镜观察。
图6表现了化合物10e对skov-3、bnlcl.2细胞sr蛋白形态、定位的影响。在细胞中，clk1能够影响sr蛋白的形态和细胞定位。在细胞内，sr蛋白具有两种状态，一种为储存型，形态为染色质间颗粒聚集，在免疫荧光实验中呈现典型的颗粒状荧光；另一种为活化型，形态为染色质周的纤丝，在免疫荧光实验中呈现弥散状荧光。clk1的抑制后，sr蛋白由活化状态向储存状态转化，从而使sr蛋白染色出现亮斑。此外，clk1能够与sr蛋白上核定位结构域相互作用，在某些细胞中影响sr蛋白亚细胞定位。dapi用于dna染色，用于标记细胞核的位置。dmso为阴性对照，模拟不给药条件下sr蛋白的形态和定位。
图6结果显示，在skov-3和bnlcl.2细胞中，化合物10e能够促进sr蛋白由弥漫状向贮存颗粒状转化(相对于阴性对照出现更多显著的亮斑)，且促进sr蛋白由细胞核向细胞质转移(bnlcl.2细胞核中，dapi、sr蛋白染色并不完全重合)。图6结果表明，化合物10e作为clk1抑制剂，能够在活细胞内有效影响下游sr蛋白的形态与分布。
图7为共聚焦显微镜检测10e诱导的自噬与自噬流数据统计图，其原理如下：自噬的产生，除了用免疫印迹检测轻链3ii蛋白水平(图2、3、4)外，还需要其他方法共同验证，荧光检测自噬体的产生是常用的另一种方法。如图2中所描述的，自噬小体产生后，可与溶酶体结合，形成自噬溶酶体，降解自噬体包裹的内容物，此为自噬流。此实验采用编辑串联哺乳动物红色荧光蛋白-绿色荧光蛋白-轻链3融合蛋白的腺病毒(ad-mrfp-gfp-lc3，购自汉恒生物科技(上海)有限公司，使用时感染复数为100)感染skov-3细胞，使细胞表达的哺乳动物红色荧光蛋白-绿色荧光蛋白-轻链3融合蛋白。自噬发生时，哺乳动物红色荧光蛋白-绿色荧光蛋白-轻链3i(mrfp-gfp-lc3ⅰ)融合蛋白形成哺乳动物红色荧光蛋白-绿色荧光蛋白-轻链3ii(mrfp-gfp-lc3ⅱ)融合蛋白，并被招募参与自噬体形成。由于绿色荧光蛋白对酸敏感，当自噬溶酶体形成时，哺乳动物红色荧光蛋白-绿色荧光蛋白-轻链3ii(mrfp-gfp-lc3ⅱ)融合蛋白中的绿色荧光蛋白荧光发生淬灭。据此，在共聚焦显微镜下，通过观察不同荧光斑点的颜色可以区分细胞中自噬体和自噬溶酶体。对细胞中的自噬体和自噬溶酶体进行计数，当自噬溶酶体数量大于自噬体的数量时，表明自噬流是顺畅的，反之，则表明自噬流的阻碍的。试验中，dmso为阴性对照。
对对照组和10e处理组中的自噬体的数量、自噬溶酶体的数量以及自噬溶酶体和自噬体数量的比值进行显著性差异分析，结果显示，10e处理后自噬体和自噬溶酶体的数量显著增加，说明化合物10e能明显诱导自噬的产生。10e处理后自噬溶酶体和自噬体数量的比值较对照组也显著升高，则表明化合物10e能增强自噬流。本实验统计结果为3次独立实验的结果(平均值±标准误差)，每次独立实验至少统计80个细胞，每组对40个以上细胞进行统计。按照斯图登检查方法(student’st-test)进行显著性差异分析，*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001.
实施例26体内研究
4周龄雄性c57bl/6小鼠(购自成都达硕生物科技有限公司)在sfp级(无特定病原体级)动物房适应性饲养1周后，实验前一天晚上禁食不禁水。第二天对小鼠随机分组，每组3只，根据体重腹腔注射apap(500mg/kg)诱导急性肝损伤或注射等量0.9％nacl溶液作为对照。在注射apap之后，立即对小鼠另一侧腹腔注射化合物溶液(1,25，雷帕霉素，tg003)或溶剂(12.5％乙醇,12.5％蓖麻油,75％生理盐水，20μl/g)。apap注射后正常饲养小鼠6h，取小鼠血清用于alt(谷丙转氨酶)和ast(谷草转氨酶)活性测试，对小鼠进行解剖、分离小鼠肝脏用于h&e(苏木精-伊红)染色分析。
图8结果显示，apap处理后，小鼠的肝组织可见明显的大块坏死区域，且肝功能指标谷丙转氨酶(alt)和谷草转氨酶(ast)也明显升高并超出正常范围，表明apap诱导后小鼠肝发生明显的损伤。而经10e治疗后，apap诱导的小鼠肝组织无明显的损伤，且肝功能指标明显下降至与正常小鼠相当的水平。可见化合物10e作为自噬诱导剂，体内毒性较小，在apap诱导的急性肝损伤中，能够有效保护小鼠肝脏细胞的形态与功能。本实验每组至少3只小鼠，统计结果用平均值±标准误差表示，按照斯图登检查方法(student’st-test)对数据进行显著性差异分析，*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001.
图9结果显示，化合物8l作为自噬诱导剂，体内毒性较小，在apap诱导的急性肝损伤中，能够有效保护小鼠肝脏细胞。