本申请大体涉及生物学和免疫学领域，具体而言，本申请提供了刺激免疫细胞活化的多肽、融合蛋白及其制备方法，以及其医学和生物学用途。
背景技术：
：生物细胞免疫治疗是从患者体内提取免疫细胞在实验室中进行培养后获得的一群抑制细胞，该细胞对肿瘤细胞识别能力很强，如同细胞导弹能精确点射肿瘤细胞，被誉为绿色疗法。细胞免疫治疗技术被称为继手术、放疗、化疗之后的第四种治疗方法：通过采集患者自身免疫细胞，经过体外培养扩增，再回输至患者体内以杀灭癌细胞、病原体，激活人体免疫能力，从而预防肿瘤复发和转移，可在一定程度上解决患者放化疗后免疫力差、生活质量下降的弊端。细胞免疫疗法在国际上已逐渐成为治疗癌症的新趋势。在生物多细胞免疫治疗之前，免疫治疗中回输到患者体内的“抗肿瘤细胞”主要是树突状细胞(dc)和细胞因子诱导的杀伤细胞(cik)两种。现在，用于患者治疗的“抗肿瘤细胞”增加到了6种：高纯度dc、cik、自然杀伤细胞(nk)、cd3抗体激活的杀伤细胞(cd3ak)、嵌合抗原受体t细胞(car-t)和自然杀伤t细胞(nkt)。目前，nkt细胞是从人外周血或脐带血经体外分离获得单个核细胞，经刺激后连续培养而获得的。nkt细胞受到刺激后，可以分泌大量的il-4、ifn-γ、gm-csf、il-13和其它细胞因子和趋化因子，发挥免疫调节作用，nkt细胞是联系固有免疫和获得性免疫的桥梁之一。技术实现要素：第一方面，本申请提供了多肽，其包含选自以下的序列或由选自以下的序列组成：(a)如seqidno：1所示的氨基酸序列，以及(b)由(a)所述的序列经过取代、缺失或添加至少一个氨基酸后得到的且具有刺激免疫细胞活化功能的序列。在一些实施方案中，本申请的多肽包含seqidno：1所示的氨基酸序列。在一些具体的实施方案中，本申请的多肽由seqidno：1所示的氨基酸序列组成。在本文中，由seqidno：1所示的氨基酸序列组成的多肽被命名为nktp肽。在一些实施方案中，本申请的多肽序列为由上述(a)所述的序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸后得到的序列，而且经过上述取代、缺失或添加得到的多肽仍具有刺激免疫细胞活化功能。第二方面，本申请提供了融合蛋白，其包含第一方面所述的多肽以及一个或多个融合伴侣；任选地，所述融合蛋白还包含连接子。在一些实施方案中，所述融合伴侣包含选自β2-微球蛋白(简称β2m)、fc区或其部分、免疫球蛋白重链恒定区、蛋白标签、神经酰胺样糖脂抗原中的一个或多个。在一些实施方案中，所述连接子包含甘氨酸/丝氨酸间隔子。在一些实施方案中，所述融合伴侣包含β2-微球蛋白、和/或fc区或其部分、和/或蛋白标签。在一些具体的实施方案中，所述融合蛋白的氨基酸序列如seqidno：5所示。在一些实施方案中，所述融合蛋白的氨基酸序列为与seqidno：5所示的序列相差至少一个氨基酸的取代、缺失或添加且具有刺激免疫细胞活化功能的蛋白。第三方面，本申请了提供了多核苷酸，其编码第一方面所述的多肽。在一些实施方案中，本申请的多核苷酸包含seqidno：6所示的核苷酸序列。在一些具体的实施方案中，本申请的多核苷酸由seqidno：6所示的核苷酸序列组成。第四方面，本申请提供了核酸分子，其编码第二方面所述的融合蛋白。在一些实施方案中，所述核酸分子包含seqidno：7所示的核苷酸序列。在一些具体的实施方案中，所述核酸分子由seqidno：7所示的核苷酸序列组成。第五方面，本申请提供了重组载体，其包含第三方面所述的多核苷酸或第四方面所述的核酸分子。在一些实施方案中，本发明的重组载体还包含调节多核苷酸表达的调控序列，其中多核苷酸与调控序列可操作地连接。第六方面，本申请提供了宿主细胞，其包含第一方面所述的多肽、第二方面所述的融合蛋白、第三方面所述的多核苷酸、第四方面所述的核酸分子或第五方面所述的重组载体。第七方面，本申请提供了第二方面所述的融合蛋白的制备方法，包括：将第四方面所述的核酸分子转入宿主细胞中，培养所述宿主细胞；以及收获所述融合蛋白。在一些实施方案中，所述制备方法还包括纯化所述融合蛋白。第八方面，本申请提供了第一方面所述的多肽、第二方面所述的融合蛋白、第三方面所述的多核苷酸，或第四方面所述的核酸分子在制备用于调节个体免疫反应、或在制备用于细胞免疫疗法的药物中的用途。附图说明图1为融合蛋白的编码序列的结构示意图。图2为载体pcdna3.1(+/-)的结构示意图。图3为酶切后的编码β2m+连接子1的dna片段的琼脂糖凝胶电泳图。其中，泳道1为dl1,000dnamarker(条带大小：a为1000bp、b为700bp、c为500bp、d为400bp、e为300bp、f为200bp和g为100bp)，泳道2为酶切后的编码β2m+连接子1的dna片段。图4为酶切后的编码nktp肽+higg1+连接子2+briatag的dna片段的琼脂糖凝胶电泳图。其中，泳道1为dl1kbdnamarker(条带大小：a为5000bp、b为4000bp、c为3000bp、d为2000bp和e为1000bp)，泳道2为酶切后的编码nktp肽+higg1+连接子2+briatag的dna片段。图5为重组载体pcdna3.1(-)-融合蛋白使用xbai和bamhi双酶切的琼脂糖凝胶电泳图。其中，泳道1为dl1,000dnamarker(条带大小：a为1000bp、b为700bp、c为500bp和d为400bp)，泳道2为酶切后的重组载体pcdna3.1(-)-融合蛋白-1，泳道3为酶切后的重组载体pcdna3.1(-)-融合蛋白-2，泳道4为酶切后的重组载体pcdna3.1(-)-融合蛋白-3，泳道5为1kbdnamarker(条带大小：a为7000bp、b为6000bp、c为5000bp、d为4000bp、e为3000bp、f为2000bp和g为1000bp)。图6为重组载体pcdna3.1(-)-融合蛋白使用hindiii和bamhi双酶切的琼脂糖凝胶电泳图。其中，泳道1为酶切后的重组载体pcdna3.1(-)-融合蛋白-1，泳道2为酶切后的重组载体pcdna3.1(-)-融合蛋白-2，泳道3为酶切后的重组载体pcdna3.1(-)-融合蛋白-3，泳道4为1kb的dnamarker(条带大小：a为6000bp、b为5000bp、c为4000bp、d为3000bp、e为2000bp和f为1000bp)。图7为转染了重组载体pcdna3.1(-)-融合蛋白的293t细胞扩增编码nktp肽+higg1的dna片段的琼脂糖凝胶电泳图。其中，泳道1为dnamarker(条带大小：a为6000bp、b为5000bp、c为4000bp、d为3000bp、e为2000bp和f为1000bp)，泳道2为未转染重组载体pcdna3.1(-)-融合蛋白的293t细胞的扩增产物，泳道3为转染了重组载体pcdna3.1(-)-融合蛋白的293t细胞的扩增产物，泳道4为阴性对照。图8为鉴定融合蛋白的westernblot实验结果。其中，泳道1为重组载体pcdna3.1(-)-融合蛋白转染293t细胞的上清，泳道2为蛋白预染marker(条带大小：a为250kd、b为130kd、c为95kd、d为72kd和e为55kd)，泳道3为未转染重组载体pcdna3.1(-)-融合蛋白的293t细胞的上清。图9为2-9号转染了重组载体pcdna3.1(-)-融合蛋白的cho-k1细胞培养液上清的westernblot实验结果。其中，泳道1为蛋白预染marker(条带大小：a为250kd、b为130kd、c为95kd、d为72kd、e为55kd和f为36kd)，泳道2为2号细胞培养液上清，泳道3为3号细胞培养液上清，泳道4为4号细胞培养液上清，泳道5为9号细胞培养液上清，泳道6为5号细胞培养液上清，泳道7为6号细胞培养液上清，泳道8为7号细胞培养液上清，泳道9为8号细胞培养液上清。图10为采用protiena柱进行纯化融合蛋白的图，其中方框所示即为融合蛋白纯化峰。图11为融合蛋白纯化样品的westernblot实验结果。其中，泳道1为蛋白预染marker(条带大小：a为250kd、b为130kd、c为95kd、d为72kd和e为55kd)，泳道2为融合蛋白纯化样品。图12为鉴定生物素化的融合蛋白的westernblot实验结果。其中，泳道1为和泳道2为不同批次纯化收集的融合蛋白样品，泳道3为蛋白预染marker(条带大小：a为250kd、b为130kd、c为95kd、d为72kd、e为55kd、f为36kd和g为28kd)。发明详述提供以下定义和方法用以更好地界定本申请以及在本申请实践中指导本领域普通技术人员。除非另作说明，术语按照相关领域普通技术人员的常规用法理解。本文所引用的所有专利文献、学术论文及其他公开出版物，其中的全部内容整体并入本文作为参考。定义如本文所用术语“免疫细胞”，是指参与免疫应答或与免疫应答相关的细胞，包括淋巴细胞、树突状细胞、单核/巨噬细胞、粒细胞、肥大细胞等。如本文所用术语“免疫细胞活化”，是指免疫细胞通过抗原或刺激因子的刺激进行增殖并分化的现象。如本文所用术语“融合蛋白”，是指通过dna重组技术得到的基因重组后的表达产物，例如将两个或多个基因的编码区首尾连接，由同一调控序列控制构成的基因表达产物。如本文所用术语“融合伴侣”，是指基本上不抑制目的多肽的活性并且具有一定功能的任何合适的部分。融合伴侣可以具有下述至少一项作用：增强多肽的稳定性和/或效力，实现多肽的多价化和/或有利于多肽的纯化，有助于多肽引入功能化基团，增强或参与多肽的作用等。如本文所用术语“蛋白标签”，是指利用dna体外重组技术，与目的蛋白一起融合表达的一种多肽或者蛋白，以便于目的蛋白的表达、检测、示踪和纯化等。常用的蛋白标签包含avi-tag、trxhis标签、flag标签、麦芽糖结合蛋白(mbp)标签、谷胱甘肽巯基转移酶(gst)标签、ha标签、c-myc标签、egep标签、eyfp标签、ecfp标签、snap-tag、halotag、泛素样修饰蛋白(sumo)标签等。如本文所用术语“连接子”，又称接头序列(linker)。接头序列设计为融合蛋白制备中的常用技术，即通过一段适当的核苷酸序列将不同的目的基因连接起来，使其在适当的生物体内表达成为一条肽链，其中起连接作用的氨基酸称为连接子。具体实施方式第一方面，本申请提供了多肽，其包含选自以下的序列或由选自以下的序列组成：(a)如seqidno：1所示的氨基酸序列，以及(b)由(a)所述的序列经过取代、缺失或添加至少一个氨基酸后得到的且具有刺激免疫细胞活化功能的序列。在一些实施方案中，本申请的多肽包含seqidno：1所示的氨基酸序列。在一些具体的实施方案中，本申请的多肽由seqidno：1所示的氨基酸序列组成。在本文中，由seqidno：1所示的氨基酸序列组成的多肽被命名为nktp肽。本申请发明人将nktp肽用于人外周血或脐带血经体外分离获得的单个核细胞的连续培养，然后通过流式细胞术检测，结果表明，nktp肽能够激活单个核细胞中的nkt细胞。活化后的nkt细胞能够快速、大量地分泌th1(ifn-7等)、th2(il4等)类细胞因子，从而强有力地影响免疫反应类型，实现对免疫应答和自身免疫的调节。因此，本申请发明人经实验证实了本申请多肽刺激免疫细胞活化的功能。在一些实施方案中，本申请的多肽序列为由上述(a)所述的序列经过取代、缺失或添加一个或几个，例如1个～10个，优选1个～5个，更优选1个～3个氨基酸后得到的序列。在一些实施方案中，本申请的多肽序列为由上述(a)所述的序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸后得到的序列，而且经过上述取代、缺失或添加得到的多肽仍具有刺激免疫细胞活化功能。在一些实施方案中，上述多肽变体与seqidno：1所示的氨基酸序列相差约1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸的取代、缺失和/或添加。在一些实施方案中，上述多肽变体与seqidno：1所示的氨基酸序列相差约1、2、3、4或5个氨基酸的取代、缺失或添加。在一些实施方案中，seqidno：1所示的氨基酸序列的变体与seqidno：1具有至少80％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％以上的同源性。在一些实施方案中，多肽变体与seqidno：1所示的氨基酸序列具有99％以上的同源性。本文所述的“同源性”被定义为经过序列比对和引入空位后，氨基酸或核苷酸序列变体中相同残基的百分比，如果需要，达到最大百分比的同源性。用于比对的方法和计算机程序在本领域内是公知的。在一些实施方案中，nktp肽序列的c端或n端区域还可以被截短或添加约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25或更多个氨基酸。在一些实施方案中，seqidno：1所示的氨基酸序列的变体是在seqidno：1所示的氨基酸序列中包含一个或几个保守性氨基酸取代的序列，其中经取代后的序列具有与nktp肽类似的功能。被称为“保守氨基酸取代”的某些氨基酸取代能够在蛋白质中频繁出现，但不改变该蛋白质的构象或功能，这是蛋白质化学中已建立的法则。本申请中的保守氨基酸取代包括但不限于用甘氨酸(g)、丙氨酸(a)、异亮氨酸(i)、缬氨酸(v)和亮氨酸(l)中的任一个取代这些脂肪族氨基酸的任何另外一个；用丝氨酸(s)取代苏氨酸(t)，反之亦然；用天冬氨酸(d)取代谷氨酸(e)，反之亦然；用谷氨酰胺(q)取代天冬酰胺(n)，反之亦然；用赖氨酸(k)取代精氨酸(r)，反之亦然；用苯丙氨酸(f)、酪氨酸(y)和色氨酸(w)取代这些芳香族氨基酸中的任何另外一个；以及用甲硫氨酸(m)取代半胱氨酸(c)，反之亦然。其他的取代也可以被视为是保守性的，这取决于特定氨基酸环境和它在蛋白三维结构中的作用。例如，甘氨酸(g)和丙氨酸(a)经常可以互换，如同丙氨酸(a)和缬氨酸(v)可以互换。相对疏水的甲硫氨酸(m)可以经常与亮氨酸和异亮氨酸互换，以及有时与缬氨酸互换。赖氨酸(k)和精氨酸(r)经常在以下位置互换：其中氨基酸残基的重要特征是其电荷，以及这两种氨基酸残基的不同pk并不明显。第二方面，本申请提供了融合蛋白，其包含第一方面所述的多肽以及一个或多个融合伴侣；任选地，所述融合蛋白还包含连接子。在一些实施方案中，所述融合伴侣包含选自β2-微球蛋白(简称β2m)、fc区或其部分、免疫球蛋白重链恒定区、蛋白标签、神经酰胺样糖脂抗原中的一个或多个。在一些实施方案中，所述融合伴侣包含β2-微球蛋白、和/或fc区或其部分、和/或蛋白标签。在一些具体的实施方案中，所述β2-微球蛋白(简称β2m)包含或由如seqidno：2所示的氨基酸序列组成。在一些实施方案中，所述fc区或其部分包含iga、igd或igg区(铰链-ch2-ch3)；更进一步地，所述fc区或其部分包含iggfc区，例如igg1fc区或igg4fc区。在一些具体的实施方案中，所述fc区为人igg1fc区(简称higg1)。在一些具体的实施方案中，所述fc区或其部分包含或由如seqidno：3所示的序列组成。在一些具体的实施方案中，所述蛋白标签为实现蛋白质生物素化的标签，例如briatag。在一些具体的实施方案中，所述蛋白标签包含或由如seqidno：4所示的氨基酸序列组成。本发明的多肽以及一个或多个融合伴侣可经由连接子(即柔性分子连接，如柔性多肽链)连接。连接子可为不影响多肽功能的任何合适的连接子，其长度可以为，例如：至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少20个、至少25个或至少30个氨基酸。在一些实施方案中，所述连接子包含甘氨酸/丝氨酸间隔子。在一些实施方案中，合适的连接子的实例包括但不限于包含一个或多个(例如2、3、4、5或6个)g4s基序的连接子。在一些实施方案中，所述融合蛋白可具有下述任一种构型：(融合伴侣)-(任选的连接子)-(本申请的多肽)、(本申请的多肽)-(任选的连接子)-(融合伴侣)、(第一融合伴侣)-(任选的连接子)-(本申请的多肽)-(第二融合伴侣)、(第一融合伴侣)-(任选的第一连接子)-(本申请的多肽)-(任选的第二连接子)-(第三融合伴侣)、(本申请的多肽)-(第二融合伴侣)-(任选的连接子)-(第三融合伴侣)、(第一融合伴侣)-(任选的第一连接子)-(本申请的多肽)-(第二融合伴侣)-(任选的第二连接子)-(第三融合伴侣)。在一些具体的实施方案中，融合伴侣可以是β2-微球蛋白(简称β2m)、fc区或其部分、或蛋白标签。融合伴侣例如β2-微球蛋白可以增强或参与目的多肽的生物活性(例如免疫反应)，或者增强多肽的稳定性和/或效力；fc区或其部分可以实现多肽的多价化和/或有利于多肽的纯化；蛋白标签有助于多肽引入功能化基团。在一些具体的实施方案中，上述第一融合伴侣为β2-微球蛋白，第二融合伴侣为fc区或其部分，第三融合伴侣为蛋白标签。在一些具体实施方案中，所述融合蛋白的构型如下：(第一融合伴侣)-(任选的第一连接子)-(本申请的多肽)-(第二融合伴侣)-(任选的第二连接子)-(第三融合伴侣)。在一些具体的实施方案中，第一连接子为β2-微球蛋白与nktp肽之间的连接子，命名为连接子1。在一些具体的实施方案中，所述连接子1包含或由如seqidno：8所示的氨基酸序列组成，记为(g4s)3。在一些具体的实施方案中，所述第二连接子为higg1与briatag之间的连接子，命名为连接子2。在一些具体的实施方案中，连接子2包含或由如seqidno：8所示的氨基酸序列组成，记为(g4s)3。在一些具体的实施方案中，所述融合蛋白的构型如下：β2m-连接子1-nktp肽-higg1-连接子2-briatag。在一些具体的实施方案中，所述融合蛋白的氨基酸序列如seqidno：5所示。在一些实施方案中，所述融合蛋白的氨基酸序列为与seqidno：5所示的序列相差至少一个氨基酸的取代、缺失或添加且具有刺激免疫细胞活化功能的蛋白。上文中，所述免疫细胞可以选自自然杀伤t细胞、外周血单个核细胞、脐带血单个核细胞或cd8+t细胞。第三方面，本申请了提供了多核苷酸，其编码第一方面所述的多肽。在一些实施方案中，本申请的多核苷酸包含seqidno：6所示的核苷酸序列。在一些实施方案中，上述多核苷酸编码seqidno：1所示的氨基酸序列即nktp肽，或其功能等同变体。在一些实施方案中，本申请的多核苷酸与编码nktp肽及其功能等同变体的多核苷酸具有至少80％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的同源性。在一些实施方案中，本申请的多核苷酸包含与seqidno：6所示的核苷酸序列具有至少80％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同源性的核苷酸序列。在一些实施方案中，本申请的多核苷酸由与seqidno：6所示的核苷酸序列具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同源性的核苷酸序列组成。在一些具体的实施方案中，本申请的多核苷酸由seqidno：6所示的核苷酸序列组成。在一些实施方案中，本申请的多核苷酸包含与编码nktp肽及其功能等同变体的核苷酸序列在严格条件下杂交的核苷酸序列，或者由与编码nktp肽及其功能等同变体的核苷酸序列特异性杂交且编码与nktp肽在功能上等同的多肽的核苷酸序列组成。本领域技术人员可以常规选择dna杂交的严格条件。通常较长的探针需要较高的温度，以便进行适当的退火，而较短的探针需要较低的温度。杂交通常取决于当互补链处于低于其解链温度的环境时变性dna的重退火能力。探针与可杂交序列之间同源性程度越高，所能采用的相对温度越高。于是，较高的相对温度往往使反应条件更严格，而在较低的温度下，则严格度较低。关于杂交反应严格条件的详细描述，可参阅ausubel等，currentprotocolsinmolecularbiology,wileyintersciencepublishers,(1995)。在一些实施方案中，dna杂交采用的严格条件包括：1)洗涤时采用低离子强度和高温，例如50℃下的0.015m氯化钠/0.0015m柠檬酸钠/0.1％十二烷基硫酸钠；2)杂交时采用甲酰胺等变性剂，例如42℃下50％(v/v)甲酰胺加0.1％牛血清白蛋白/0.1％ficoll/0.1％聚二烯吡咯烷酮/ph6.5的50mm磷酸钠缓冲液以及750mm氯化钠、75mm柠檬酸钠；或3)在42℃下过夜杂交，杂交溶液含50％甲酰胺，5xssc缓冲液(0.75m氯化钠，0.075m柠檬酸钠)、50mm磷酸钠(ph6.8)、0.1％焦磷酸钠、5xdenhardt’s溶液、超声波处理的鲑鱼精子dna(50.mu.g/ml)、0.1％sds和10％硫酸葡聚糖，然后在0.2xssc缓冲液(氯化钠/柠檬酸钠)中于42℃洗涤10分钟，再以含有edta的0.1xssc缓冲液于55℃进行高严格度洗涤。专业人员将会根据探针长度等因素调节温度、离子强度等。杂交核酸时的严格度取决于核酸分子长度和互补程度，以及其它本领域内众所周知的变量。两个核苷酸序列之间的相似性或同源性越大，则含有这些序列的核酸杂合体的tm越大。核酸杂交的相对稳定性(对应于较高的tm)以下列顺序递减：rna：rna、dna：rna、dna：dna。优选地，可杂交核酸的最低长度至少约为12个核苷酸，优选至少约为16个、更优选至少约为24个、最优选至少约为36个核苷酸。第四方面，本申请提供了核酸分子，其编码第二方面所述的融合蛋白。在一些实施方案中，所述核酸分子包含seqidno：7所示的核苷酸序列。在一些具体的实施方案中，所述核酸分子由seqidno：7所示的核苷酸序列组成。第四方面所述的核酸分子包含第三方面所述的多核苷酸(seqidno：6)、编码所述β2m的dna序列(seqidno：9)、编码所述higg1的dna序列(seqidno：10)、编码所述briatag的dna序列(seqidno：11)、编码所述连接子1的dna序列(seqidno：12)和编码所述连接子2的dna序列(seqidno：13)。核酸分子的总长度优选地受预期重组dna方案中制备和使用的便利性的限制。可以利用本领域内已知的和可获得的多种成熟技术中的任何一种来制备、操控和/或表达多肽及其融合物。例如，编码本发明的多肽或融合蛋白的多核苷酸序列可以用于重组dna分子中以指导多肽或融合蛋白在适当的宿主细胞中表达。由于遗传密码子固有的简并性，编码基本上相同或在功能上等同的氨基酸序列的其他dna序列也可以用于本发明中，并且这些序列可以用于克隆和表达给定的多肽或蛋白。在一些实施方案中，本申请的第三方面所述的多核苷酸或第四方面所述的核酸分子可以通过人工合成产生，例如直接的化学合成或酶合成。在可选的实施方案中，上述多核苷酸或核酸分子通过重组技术产生。在一些具体的实施方案中，通过重叠pcr(overlap-pcr)、酶切和连接的方法，将编码β2m的核苷酸序列、编码连接子1的核苷酸序列、编码第一方面所述多肽的核苷酸序列、编码higg1的核苷酸序列、编码连接子2的核苷酸序列和编码briatag的核苷酸序列串联重复在一起。第五方面，本申请提供了重组载体，其包含第三方面所述的多核苷酸或第四方面所述的核酸分子。在一些实施方案中，本发明的重组载体还包含调节多核苷酸表达的调控序列，其中多核苷酸与调控序列可操作地连接。本发明所述的“重组载体”是重组或合成产生的核酸构建体，其具有一系列允许特定的核酸在宿主细胞中转录的特异性核酸元件。在一些实施方案中，用于构建所述重组载体的表达载体为pcdna3.1(-)、phcmv/zeo、pcr3.1、pef1/his、pind/gs、prc/hcmv2、psv40/zeo2、ptracer-hcmv、pub6/v5-his、pvax1、pzeosv2、pci、psvl、pksv-10、pbpv-1、pml2d、ptdt1、pmig、pll3.7、pdc315、aav，或者是本领域熟知的其它载体。在一个具体的实施方案中，用于克隆本文第四方面所述的核酸分子的表达载体为质粒载体，例如pcdna3.1(-)。在一些实施方案中，利用本领域的技术人员熟知的方法构建编码第二方面所述的融合蛋白的核酸分子和合适的转录/翻译调控元件的表达载体。这些方法包括体外重组dna技术、dna合成技术、体内重组技术等(sambroook,etal.molecularcloning,alaboratorymanual,coldspringharborlaboratory.newyork,1989)。核苷酸序列可操作地连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mrna合成。这些启动子的代表性实例包括：cmv立即早期启动子、大肠杆菌的lac或trp启动子；λ噬菌体的pl启动子；真核启动子包括hsv胸苷激酶启动子、早期和晚期sv40启动子、反转录病毒的ltrs和其它一些已知的可控制基因在原核细胞或真核细胞或其病毒中表达的启动子。在一个具体的实施方案中，通过t4连接酶将重组核苷酸序列连接到载体中，例如将第四方面所述的核酸分子连接到表达载体pcdna3.1(-)中，命名为重组载体pcdna3.1(-)-融合蛋白。此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如真核细胞培养用的g418(遗传霉素)抗性、新霉素抗性、二氢叶酸还原酶以及绿色荧光蛋白(gfp)，或用于大肠杆菌的四环素或氨苄青霉素抗性等。在一个具体的实施方案中，包含第四方面所述的核酸分子的重组载体pcdna3.1(-)-融合蛋白的构建方法如下：1)采用引物primer1f(seqidno：14)/primer2r(seqidno：15)扩增编码部分β2m+连接子1的dna片段；2)采用引物primer1f/primer3r(seqidno：16)以步骤1)的产物为模版扩增编码完整β2m+连接子1的dna片段；3)采用引物primer4f(seqidno：17)/primer5r(seqidno：18)扩增编码nktp肽的dna片段；4)采用引物primer6f(seqidno：19)/primer7r(seqidno：20)扩增编码higg1的dna片段；5)按照下述dna序列直接合成连接子2+briatag的dna序列：ggtggtgggggttcgggcggcgggggctcgggaggagggggatcgggcctcaacgacatcttcgaagcacaaaaaatcgaatggcac采用引物primer8f(seqidno：21)/primer9r(seqidno：22)扩增编码连接子2+briatag的dna片段；6)采用引物primer6f/primer9r以步骤4)、5)的扩增产物为模版，扩增获得编码higg1+连接子2+briatag的dna片段；7)采用引物primer4f/primer9r以步骤3)、6)的扩增产物为模版，扩增获得编码nktp肽+higg1+连接子2+briatag的dna片段；8)对步骤2)扩增产物用xbai和bamhi酶切，获得酶切后的编码β2m+连接子1的dna片段；对步骤7)产物用bamhi和hindiii酶切，获得酶切后的编码nktp肽+higg1+连接子2+briatag的dna片段；将载体pcdna3.1(-)用xbai和hindiii酶切，获得载体骨架；将酶切后的编码β2m+连接子1的dna片段、酶切后的编码nktp肽+higg1+连接子2+briatag的dna片段和载体骨架采用t4连接酶进行连接，获得重组载体pcdna3.1(-)-融合蛋白。所用酶切位点及其序列如下：xbai:tctagabamhi:ggatcchindiii：aagctt第六方面，本申请提供了宿主细胞，其包含第一方面所述的多肽、第二方面所述的融合蛋白、第三方面所述的多核苷酸、第四方面所述的核酸分子或第五方面的所述重组载体。在一些实施方案中，将编码融合蛋白的核酸分子或含有该核酸分子的表达载体转化或转导入宿主细胞，获得含有该核酸分子或表达载体的基因工程化宿主细胞。本文所用的宿主细胞可以是本领域技术人员熟知的任一种宿主细胞，包括真核细胞、原核细胞，例如哺乳动物细胞、细菌细胞、真菌细胞、酵母细胞、昆虫细胞或植物细胞等。选择合适的宿主细胞在本领域技术人员的能力范围内。在一些实施方案中，所述宿主细胞为哺乳动物细胞。在一些实施方案中，所述宿主细胞可以为cho细胞、293t细胞、jy细胞、bm92细胞、win细胞、moc细胞、mg细胞、nso细胞、sp2细胞、bhk细胞、cos细胞、hepg2细胞、a549细胞、hela细胞、cvi细胞、cos细胞、r1610细胞、balbc/3t3细胞、hak细胞、sp2/o细胞、p3x63-ag3.653细胞、bfa-1c1bpt细胞或raji细胞。可以利用本领域已知的任何技术将表达载体导入宿主细胞中，包括转化、转导、转染、病毒感染、基因枪或ti介导的基因转移。具体的方法包括磷酸钙转染、deae-葡聚糖介导的转染、脂转染或电穿孔等(davis,l.,dibner,m.,battey,i.,basicmethodsinmolecularbiology,(1986))。在一个具体的实施方案中，所述宿主细胞为cho-k1细胞，将重组载体pcdna3.1(-)-融合蛋白通过磷酸钙转染法导入宿主细胞中进行培养表达，所述宿主细胞在导入重组载体前本身不含有或不表达本申请所述融合蛋白。第七方面，本申请提供了第二方面所述的融合蛋白的制备方法，包括：将第四方面所述的核酸分子转入宿主细胞中，培养所述宿主细胞；以及收获所述融合蛋白。在适于宿主细胞生长或对其进行诱导表达的培养基中进行宿主细胞培养。根据所用的宿主细胞，可以选择各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。优选地，工程化的宿主细胞可以在被修饰适于激活启动子的常规营养培养基中进行培养，以筛选转化子或扩增本发明的多核苷酸。转化合适的宿主细胞并当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，将细胞扩大培养，以允许其生产目的多肽或蛋白。在一些实施方案中，所述制备方法还包括纯化所述融合蛋白。在一些实施方案中，宿主细胞生产的重组多肽可包被于细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。例如，表达的蛋白可以通过本领域熟知的以下方法从重组细胞培养物中回收并纯化：常规的复性处理、蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超声波处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(hplc)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。根据所述融合蛋白的纯化蛋白标签，进行所述融合蛋白的纯化。在一个具体的实施方案中，所述融合蛋白包含人igg1fc区(简称higg1)或其部分可以作为纯化蛋白标签，采用proteina亲和层析或proteing亲和层析进行纯化。第八方面，本申请提供了第一方面所述的多肽、第二方面所述的融合蛋白、第三方面所述的多核苷酸、或第四方面所述的核酸分子在制备用于调节个体免疫反应、或在制备用于细胞免疫疗法的药物中的用途。本申请所述融合蛋白可以是单体、二聚体、三聚体、四聚体及其他多聚体。因此，本申请提供的一种刺激免疫细胞活化的融合蛋白及其制备方法，至少具有以下优势：将本申请的融合蛋白单独地，或与其他物质例如与α-半乳糖神经鞘胺醇、人重组白介素2共同作用于人外周血或脐带血经体外分离获得的单个核细胞，可以快速获得大量活化的nkt细胞。nkt细胞被激活后，分泌大量的il-4、ifn-γ、gm-csf和其它细胞因子以及趋化因子(如il-2、il-13、il-17、il-21、肿瘤坏死因子-α)，发挥免疫调节作用。nkt细胞是联系固有免疫和获得性免疫的桥梁之一。此外，活化后的nkt细胞不但能分泌th1和th2细胞因子，同时还具有与cd8+杀伤性t细胞相同的杀伤靶细胞作用，nkt细胞在免疫调节系统中占有重要位置。因此，本申请的融合蛋白在细胞免疫治疗中具有广阔的发展前景。实施例实施例1重组载体pcdna3.1(-)-融合蛋白的构建使用的外周血由志愿者提供，所有志愿者均已签署知情同意书。志愿者的纳入标准为：1)年龄大于18周岁；2)无hiv、hbv感染；3)血常规检测正常；4)非孕妇或哺乳期妇女。1、分离外周血单个核细胞(pbmc)，采用triol试剂盒提取rna，反转录为cdna，以该cdna为模板，使用引物primer1f(seqidno：14)/primer2r(seqidno：15)进行第一轮扩增；以第一轮扩增产物为模板，使用引物primer1f/primer3r(seqidno：16)进行第二轮扩增，获得编码β2m+连接子1的dna片段；2、分离外周血单个核细胞(pbmc)，采用triol提取rna，反转录为cdna，以该cdna为模板，使用引物primer4f(seqidno：17)/primer5r(seqidno：18)进行扩增，获得编码nktp肽的dna片段；3、以提取的上述志愿者的pbmc细胞的dna为模板，使用引物primer6f(seqidno：19)/primer7r(seqidno：20)进行扩增，获得编码higg1的dna片段；4、按照下述dna序列直接合成连接子2+briatag的dna序列：ggtggtgggggttcgggcggcgggggctcgggaggagggggatcgggcctcaacgacatcttcgaagcacaaaaaatcgaatggcac使用引物primer8f(seqidno：21)/primer9r(seqidno：22)，以直接合成的连接子2+briatag的dna序列为模板进行扩增，获得编码连接子2+briatag的dna片段；5、以步骤3的编码higg1的dna片段和步骤4的连接子2+briatag的扩增产物为模板，使用引物primer6f/primer9r进行扩增，获得编码higg1+连接子2+briatag的dna片段；6、将步骤2和步骤5获得dna片段进行混合，使用引物primer4f/primer9r进行重叠pcr扩增，获得编码nktp肽+higg1+连接子2+briatag的dna片段；7、对载体pcdna3.1(-)使用酶xbai和hindiii酶切，获得载体骨架；对步骤1的编码β2m+连接子1的dna片段使用xbai和bamhi酶切，获得酶切后的编码β2m+连接子1的dna片段，其大小为399bp(图3)；对步骤6的nktp肽+higg1+连接子2+briatag的dna片段使用bamih和hindiii酶切，获得酶切后的编码nktp肽+higg1+连接子2+briatag的dna片段，其大小为1862bp(图4)；将酶切后的编码β2m+连接子1的dna片段、酶切后的编码nktp肽+higg1+连接子2+briatag的dna片段和载体骨架采用t4连接酶进行连接，获得重组载体pcdna3.1(-)-融合蛋白。对于获得的三个重组载体，分别标记为重组载体pcdna3.1(-)-融合蛋白-1、重组载体pcdna3.1(-)-融合蛋白-2和重组载体pcdna3.1(-)-融合蛋白-3，并分别进行酶切验证，采用xbai和bamhi双酶切后进行琼脂糖凝胶电泳，三个重组载体均分别出现大小为399bp，800bp和6411bp的三条带，电泳结果分析酶切片段大小符合预期(图5)；对于获得的三个重组载体pcdna3.1(-)-融合蛋白-1、pcdna3.1(-)-融合蛋白-2和pcdna3.1(-)-融合蛋白-3分别进行酶切验证，采用hindiii和bamhi双酶切后进行琼脂糖凝胶电泳，三个重组载体均分别出现大小为1871bp和5800bp的两条带，电泳结果分析酶切片段大小符合预期(图6)。根据xbai和bamhi双酶切结果以及hindiii和bamhi双酶切结果证实重组载体pcdna3.1(-)-融合蛋白-1、pcdna3.1(-)-融合蛋白-2和pcdna3.1(-)-融合蛋白-3均构建成功。实施例2融合蛋白的鉴定提取浓度为1μg/μl的重组载体pcdna3.1(-)-融合蛋白，利用磷酸钙转染法将所构建的重组载体转染293t细胞，转染293t细胞48小时后提取rna，反转录成cdna，采用引物primer4f(seqidno：17)和primer7r(seqidno：20)扩增编码nktp肽+higg1的dna片段。将扩增后的编码nktp肽+higg1的dna片段进行琼脂糖凝胶电泳鉴定所构建的重组载体是否能够在真核细胞293t细胞中正确表达。结果如图7所示：转染了重组载体pcdna3.1(-)-融合蛋白的293t细胞的扩增产物中能检测到编码nktp肽+higg1的dna片段，未转染重组载体pcdna3.1(-)-融合蛋白的293t细胞的扩增产物和阴性对照(转染载体pcdna3.1(-)的293t细胞)中未检测到编码nktp肽+higg1的dna片段。收集转染了重组载体pcdna3.1(-)-融合蛋白的293t细胞培养液上清和未转染重组载体pcdna3.1(-)-融合蛋白的293t细胞培养液上清，进行westernblot实验，具体实验步骤如下：1)将转染了重组载体pcdna3.1(-)-融合蛋白的293t细胞培养液上清和未转染重组载体pcdna3.1(-)-融合蛋白的293t细胞培养液上清进行8％的sds-page凝胶电泳，上样量均为20μl，预染marker上样量为5μl。浓缩胶电泳条件为：80v，45分钟；分离胶电泳条件为：120v，45分钟。2)电泳结束后剥下凝胶，并将硝酸纤维素膜铺在凝胶上，在凝胶/滤膜外再包滤纸(预先用电转缓冲液浸湿)，进行转膜，转膜缓冲液温度保持在4～6℃，200ma约2小时。3)转膜结束后，取出硝酸纤维素膜，弃去凝胶。4)用去离子水洗涤硝酸纤维素膜1次后，用封闭液(8％的脱脂牛奶)进行封闭，37℃进行2小时或4℃过夜。5)封闭结束后，用pbst洗涤液洗涤硝酸纤维素膜1次，将hrp标记山羊抗人igg按1:2000稀释于封闭液中，并将硝酸纤维素膜浸泡其中，置于脱色摇床上室温震荡1小时。6)然后用pbst洗涤液洗涤硝酸纤维素膜3次，每次10分钟。用dab试剂进行避光显色5～10分钟(显色以目的蛋白分子量处出现条带，且没有其他杂带时为最好)，然后加入蒸馏水终止反应。7)使用bio-rad凝胶成像系统进行拍照。实验结果如图8所示，westernblot实验结果显示，在该融合蛋白的二聚体大小处有明显条带(如图8中泳道1所显示的条带)，证明构建的重组载体可以在293t细胞中正确表达为目的蛋白。实施例3融合蛋白稳定细胞株的制备将cho-k1细胞铺6孔板，过夜培养，采用含10％fbs的f12k培养基进行培养。待第二天细胞融合度达到80％时，采用磷酸钙转染法，用浓度为1μg/μl的重组载体pcdna3.1(-)-融合蛋白转染cho-k1细胞。转染1周后，添加浓度为700μg/ml的g418进行筛选，筛选10天左右大量细胞死亡，少量细胞由于整合重组载体pcdna3.1(-)-融合蛋白中的抗性基因具有抗性存活，将存活细胞分到96孔板，每孔少于或等于1个细胞。培养20～30天后可以观察到部分96孔板中长满单个细胞，应及时扩大培养。采用westernblot和elasia检测表达融合蛋白的细胞系。westernblot的实验步骤同实施例2，只是上样样品为2-9号转染了重组载体pcdna3.1(-)-融合蛋白的cho-k1细胞培养液上清，采用6％的sds-page凝胶进行电泳，其中泳道2为2号细胞培养液上清，泳道3为3号细胞培养液上清，泳道4为4号细胞培养液上清，泳道5为9号细胞培养液上清，泳道6为5号细胞培养液上清，泳道7为6号细胞培养液上清，泳道8为7号细胞培养液上清，泳道9为8号细胞培养液上清。结果如图9所示，9号cho-k1细胞株可以表达融合蛋白，如图9中泳道5所显示的条带。将9号cho-k1细胞株扩大培养，取细胞培养液上清250ml经1000g离心20分钟，收集上清；将收集的上清用15ml的100kd的超滤离心管4000g离心20分钟，收集超滤浓缩液(约30ml)，将超滤浓缩液采用0.45μm的滤膜过滤，得到9号cho-k1细胞培养液上清浓缩液。将9号cho-k1细胞培养液上清浓缩液使用protiena柱进行纯化，收集9号cho-k1细胞株纯化后的融合蛋白(图10)。elasia检测的实验步骤如下：1)将来自1-10号转染了重组载体pcdna3.1(-)-融合蛋白的cho-k1细胞培养液上清、未转染重组载体pcdna3.1(-)-融合蛋白的cho-k1细胞培养液上清(阴性对照)和来自9号cho-k1细胞株纯化后的融合蛋白样品在37℃包被elisa板(样品排布见表1)1.5小时，每孔100μl。其中9-1、9-2、9-3和9-4分别为来自9号cho-k1细胞株的纯化后的融合蛋白样品的平行实验。2)包被结束后，用tbst洗涤3次，然后在4℃用5％bsa封闭过夜，每孔200μl。3)封闭结束后，用tbst洗涤3次，然后用1％bsa按照2000:1的比例稀释二抗(hrp标记的山羊抗人igg)，100μl/孔，37℃孵育50分钟。4)孵育结束后，用tbst洗涤5次，然后加入tmb显色液，100μl/孔；37℃孵育15分钟后，加入终止液，50μl/孔，在450nm处读取吸光值。实验结果见表1：9号cho-k1细胞培养液上清的od值最高，并且对于9号cho-k1细胞株培养液浓缩后纯化的结果，获得的样品中融合蛋白含量较高。表1样品编号od450样品编号od4501号0.0739号0.1872号0.09810号0.1073号0.083阴性对照0.1304号0.082阴性对照0.1195号0.0909-13.7816号0.0769-23.2597号0.1069-33.5198号0.0889-43.717根据上述westernblot和elasia检测结果，获得了稳定表达融合蛋白的cho-k1细胞株，命名为9号细胞株。将9号细胞株扩大培养后，将细胞培养液上清经protiena柱纯化后获得的融合蛋白纯化样品进行westernblot实验鉴定(二抗为hrp标记的山羊抗人igg)，结果如图11所示，融合蛋白纯化样品中存在融合蛋白，大小符合预期，9号细胞株为表达融合蛋白的稳定细胞株。将protiena柱纯化后的融合蛋白纯化样品先进行生物素化：各洗脱峰取74μl样品液，每管分别加入10μl的10×biotinligasebuffera，10μl的10×biotinligasebufferb，6μl的biotinligase(750u/μl)，共100μl。置于室温，反应过夜(16小时)，得到各洗脱峰生物素化后的样品。随后将各洗脱峰生物素化后的样品进行westernblot实验鉴定(抗体为hrp标记的链霉亲和素1:1000)。结果如图12所示，纯化后的融合蛋白大小符合预期，9号细胞株为表达融合蛋白的稳定细胞株。实施例4融合蛋白的功能将实施例3中9号细胞株的细胞培养液上清纯化后获得的融合蛋白用于人外周血经体外分离获得的单个核细胞的连续培养，然后通过流式细胞术进行检测，结果显示，本申请的融合蛋白能够激活单个核细胞中的nkt细胞。nkt细胞被激活后，分泌了大量的il-4、ifn-γ、gm-csf、il-13、肿瘤坏死因子-α等细胞因子，发挥免疫调节作用。因此，该实施例表明，本申请的融合蛋白具有刺激免疫细胞例如nkt细胞活化的功能。虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。序列表<110>拜西欧斯（北京）生物技术有限公司<120>刺激免疫细胞活化的多肽、融合蛋白及其制备方法<130>16c11252cn<160>22<170>patentinversion3.5<210>1<211>281<212>prt<213>智人（homosapiens）<400>1valproglnargleupheproleuargcysleuglnileserserphe151015alaasnsersertrpthrargthraspglyleualatrpleuglyglu202530leuglnthrhissertrpserasnaspseraspthrvalargserleu354045lysprotrpserglnglythrpheseraspglnglntrpgluthrleu505560glnhisilepheargvaltyrargserserphethrargaspvallys65707580gluphealalysmetleuargleusertyrproleugluleuglnval859095seralaglycysgluvalhisproglyasnalaserasnasnphephe100105110hisvalalapheglnglylysaspileleuserpheglnglythrser115120125trpgluprothrglnglualaproleutrpvalasnleualailegln130135140valleuasnglnasplystrpthrarggluthrvalglntrpleuleu145150155160asnglythrcysproglnphevalserglyleuleugluserglylys165170175sergluleulyslysglnvallysprolysalatrpleuserarggly180185190proserproglyproglyargleuleuleuvalcyshisvalsergly195200205phetyrprolysprovaltrpvallystrpmetargglygluglnglu210215220glnglnglythrglnproglyaspileleuproasnalaaspgluthr225230235240trptyrleuargalathrleuaspvalvalalaglyglualaalagly245250255leusercysargvallyshisserserleugluglyglnaspileval260265270leutyrtrpglyglysertyrthrser275280<210>2<211>118<212>prt<213>智人（homosapiens）<400>2metserargservalalaleualavalleualaleuleuserleuser151015glyleuglualaileglnargthrprolysileglnvaltyrserarg202530hisproalagluasnglylysserasnpheleuasncystyrvalser354045glyphehisproseraspilegluvalaspleuleulysasnglyglu505560argileglulysvalgluhisseraspleuserpheserlysasptrp65707580serphetyrleuleutyrtyrthrgluphethrprothrglulysasp859095glutyralacysargvalasnhisvalthrleuserglnprolysile100105110vallystrpaspargasp115<210>3<211>239<212>prt<213>智人（homosapiens）<400>3aspproserserar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