高效增殖杆状病毒的昆虫细胞株及其构建方法和应用与流程

本发明涉及昆虫细胞株，具体涉及高效增殖杆状病毒的昆虫细胞株及其构建方法和应用，属于基因工程、细胞工程技术领域。

背景技术：

杆状病毒表达系统(baculovirusexpressionvectorsystem，bevs)是将外源基因整合到杆状病毒基因组上形成重组杆状病毒，在昆虫细胞或虫体中表达外源蛋白的一种真核表达系统，它被越来越多地应用于表达生产抗体、受体、基因疫苗以及重组药物蛋白等方面。与原核表达系统相比，杆状病毒/昆虫细胞表达系统具有翻译后修饰的能力；而与哺乳动物细胞表达系统相比，杆状病毒/昆虫细胞表达系统表达效率高。

在众多昆虫细胞株中，草地夜蛾卵巢细胞(spodopterafrugiperda，sf9)是常用来表达重组蛋白的昆虫细胞株。它既可以贴壁培养也可以悬浮培养，并可以在无血清培养基中生长良好，因此是大规模培养生产，增殖重组外源蛋白的常用昆虫细胞株。

由于杆状病毒感染昆虫细胞会引起昆虫细胞的裂解与凋亡，因此昆虫细胞的生长状态对于重组杆状病毒增殖十分重要，是重组蛋白获得高产量的重要条件之一。

技术实现要素：

本发明的主要目的是公开一种昆虫细胞株及其构建方法，该昆虫细胞株具有良好的生长状态，能够满足重组蛋白高产量表达的需要。

为了实现这一目的，我们公开了一种高效增殖杆状病毒的昆虫细胞株，该昆虫细胞株名称为sf9-op-bmbdv-ns1，于2016年11月22日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称cgmcc），保藏编号为cgmccno.13289，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，分类命名为草地贪夜蛾（spodopterafrugiperda）卵巢细胞系。

为了实现这一目的，我们公开了一种高效增殖杆状病毒的昆虫细胞株，该昆虫细胞株名称为sf9-op-bmbdv-ns1，于2016年11月22日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称cgmcc），保藏编号为cgmccno.13289，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，分类命名为草地贪夜蛾（spodopterafrugiperda）卵巢细胞系。

该昆虫细胞株中携带有重组优化的家蚕二分浓核病毒（bombyxmoribidensovirus,bmbdv）的ns1蛋白基因，其核苷酸序列如seqidno.1所示。

本发明所公开高效增殖杆状病毒的昆虫细胞株的构建方法是将经过优化的ns1基因插入已知的表达载体，并将这一载体转染sf9细胞后，通过抗性筛选获得稳定表达ns1蛋白的重组昆虫细胞株sf9-op-bmbdv-ns1。具体包括以下步骤：

（1）由bmbdv病毒中获得ns1基因，并通过对其优化获得op-bmbdv-ns1基因；

（2）将所获得的op-bmbdv-ns1基因插入已知表达载体，从而获得重组表达载体；

（3）用重组表达载体转染sf9细胞；

（4）博来霉素zeocin抗性筛选获得稳定表达ns1蛋白的重组昆虫细胞株sf9-op-bmbdv-ns1。

其中步骤（2）可以进一步描述为：将所述基因op-ns1插入pizt-v5/his载体，转化入dh5ɑ感受态细胞，采用抗生素平板筛选获得重组子，将该重组子进行酶切、电泳，鉴定为阳性的重组子所含有的重组质粒即为重组转移载体pizt-v5/his-op-bmbdv-ns1；

同时，进一步地，步骤（3）中pizt-v5/his-op-bmbdv-ns1载体通过cellfectinⅱ转染sf9昆虫细胞。

另外，在本发明中还公开了上述公开的重组昆虫细胞株sf9-op-bmbdv-ns1在杆状病毒生产中的应用。

相应地，由于本发明中所公开的重组昆虫细胞株sf9-op-bmbdv-ns1可以显著提高杆状病毒的增殖外源蛋白的能力，因而其必然地也可以被应用于以杆状病毒为表达系统生产的病毒样颗粒疫苗或重组蛋白疫苗的生产过程。

优选地，这里所说的杆状病毒为rac-ha(表达流感病毒ha蛋白)和rac-pcv2-orf2(表达猪圆环病毒orf2蛋白)。

另一方面，本发明同时还公开了如seqidno.2所示的ns1基因在构建具有较强抗凋亡特性的细胞株中的应用。这里的细胞株优选的是指昆虫细胞株。

本发明所公开的昆虫细胞株sf9-op-bmbdv-ns1具有增殖重组杆状病毒表达外源蛋白的特性，该细胞株能够显著提高外源蛋白的表达量，其表达的外源病毒蛋白或病毒样颗粒产物具有较强的生物活性，符合疫苗的生产要求；经过外源病毒检测、支原体检测、无菌检测、外源因子检测后，该细胞株的各种指标均符合疫苗生产用细胞基质的要求；可应用于杆状病毒和疫苗的生产。

附图说明

图1为质粒pizt-v5/his-op-bmbdv-ns1酶切后的电泳图，其中dl15000是分子量mark。

图2为sf9-op-bmbdv-ns1细胞株基因组dna的提取与电泳鉴定图。

图3为sf9-op-bmbdv-ns1细胞株olypusix71倒置相差显微镜图。

图4为sf9-op-bmbdv-ns1细胞株生长曲线图。

图5为sf9-op-bmbdv-ns1细胞与原始sf9增殖重组杆状病毒rac-ha表达流感病毒ha蛋白表达量的比较结果图。

图6为sf9-op-bmbdv-ns1细胞与原始sf9增殖重组杆状病毒rac-pcv2-orf2表达猪圆环病毒orf2蛋白表达量的比较结果图。

具体实施方式

为了更好的理解本发明，下面我们结合具体的实施例对本发明进行进一步的阐述。

实施例1高效增殖杆状病毒的重组昆虫细胞株的构建

1.1bmbdv病毒ns1基因的获得与改造

提取bmbdv病毒基因组，以bmbdv病毒基因组为模板，用primestartaq高保真酶，分别用f1和f2扩增片段。pcr产物进行凝胶电泳，切胶回收pcr产物。pcr产物切胶回收，连接pgem-teasyvector，转化dh5ɑ感受态细胞，在含50ug/ml氨苄青霉素amp的lb培养基上过夜，经菌落pcr鉴定正确后送测序，序列为seqidno.2。

对获得的基因片段进行分析，在http://sg.idtdna.com/site对其进行优化，最终将优化后的片段op-bmbdv-ns1进行序列合成，序列为seqidno.1。

1.2重组表达质粒pizt-v5/his-op-bmbdv-ns1的构建和鉴定

xhoi与xbai双酶切t-op-bmbdv-ns1载体，获得两端带酶切位点的op-bmbdv-ns1基因片段；同样用xhoi与kpni双酶切pizt/v5-his载体，酶切产物进行电泳并回收，用t4dna连接酶连接酶切下来的op-bmbdv-ns1基因片段与酶切处理过的pizt/v5-his载体。连接产物转化top10感受态细胞，在含博来霉素zeocin(50ug/ml)的lb低盐固体培养基上培养过夜，挑选单菌落接种于含zeocin(50ug/ml)的lb低盐液体培养基中，提取质粒，经pcr与双酶切验证正确后送测序，测序结果正确即获得重组pizt-v5/his-op-bmbdv-ns1重组载体。

1.3细胞转染

将1×10⁶个昆虫sf9细胞接种于6孔板中，待细胞贴壁后，吸除培养基，用1ml无血清培养基sf-900iiisfm洗涤3次。将所提50ulpizt-v5/his-op-bmbdv-ns1载体加入50ul无血清培养基中，混匀；取8ulcellfectinⅱ加入到92ul无血清培养基中，混匀；将两个混合液混匀后静置30min使脂质体充分包裹dna；将混合液逐滴均匀加入6孔板中；27℃温育4h后，用新鲜培养基洗两次，加2ml含血清培养基继续培养。

1.4博来霉素zeocin抗性筛选稳定转染的sf9细胞株

转染完成72~96h后(视细胞生长状况而定)，换入1ml新鲜培养基，将贴壁细胞轻轻吹打下来，按1∶5的比例分到5个培养皿当中，每个培养皿再加入1ml新鲜培养基，静置1~2h待细胞贴壁，然后加入zeocin，每隔3~4day更换培养基，筛选过

程中zeocin终浓度一直维持在400ug/ml。

1.5稳定表达op-bmbdv-ns1的单克隆细胞株的获得

采用有限稀释法获得单克隆细胞株：将稳定转染后的sf9细胞株自培养孔内吸出并作细胞计数，计出1ml的细胞数。sf-900iiisfm培养液稀释，使细胞浓度为50~60个/ml，于96孔培养板中每孔加0.1ml(五、六个细胞/孔)种2排，剩余细胞悬液用sf-900iiisfm培养液作倍比稀释，再接种2排，如此类推，直至使每孔含0.5~1个细胞。培养7~10day后，选择单个克隆生长的阳性孔进行扩增。

1.6高效表达op-bmbdv-ns1的sf9细胞株的鉴定与筛选

鉴定：提取单克隆细胞株细胞基因组及正常细胞的基因组，用opie2f/r进行pcr扩增，正常细胞的基因组作为对照，对转基因细胞进行鉴定，检测基因组中是否成功转入op-bmbdv-ns1基因。

筛选：将筛选出的sf9细胞和母本sf9细胞调整至相同细胞密度，使用trizolreagent提取细胞总rna，具体方法参照trizolreagent说明书，并按常规方法将其反转录成cdna，qrt-pcr的引物见表1。

表1：op-bmbdv-ns1基因和内参基因actinqrt-pcr的引物

每个样品设计作3个平行对照，同时以灭菌的超纯水代替cdna模板作为空白对照。反应结束后，直接由软件7300systemsdssoftware计算出ct值，然后参照按公式（△ct=试验组目的基因ct–试验组内参基因ct）计算目的基因的相对变化倍数，找出基因表达量最高的细胞株，命名为sf9-op-bmbdv-ns1，mrna的表达情况如表2：

表2：筛选出的表达最高的细胞株与母本细胞株中op-bmbdv-ns1基因mrna的表达情况

实施例2重组昆虫细胞株的生物学特性和抗凋亡检测

2.1重组昆虫细胞株的生物学特性

2.1.1细胞形态观察：27℃条件下培养，在olypusix71倒置相差显微镜下观察昆虫细胞sf9-op-bmbdv-ns1形态并拍照，结果见图3。

2.1.2细胞生长曲线的测定：取对数生长期细胞，用血球计数板计数后，用无血清培养基将昆虫细胞sf9-op-bmbdv-ns1稀释到1×10⁶cells/ml的浓度，加到150ml摇瓶中，28℃条件下培养。每天取样，用血球计数板计数，计算细胞的平均浓度，绘出细胞生长曲线，见图4。

2.1.3微生物污染检测

2.1.3.1细菌、真菌检测传代细胞均用无抗生素的培养基。在培养过程中肉眼观察培养基是否出现浑浊现象，并在显微镜下观察有无活动的黑色颗粒；从培养瓶中取2ml细胞培养基分别加入thio和tsb培养基中，培养14day观察结果。结果显示：各个代次细胞均无细菌、真菌污染。

2.1.3.2病毒检测利用直接观察法、细胞培养法及红细胞吸附法检测。结果显示：无病毒污染。

2.1.3.3支原体检测运用培养法及dna荧光染色法对细胞进行检测。结果显示：无支原体污染。

2.2重组昆虫细胞株的抗凋亡检测

将处于对数生长期的

sf9-op-bmbdv-ns1细胞和母本细胞株分别以6×10⁴个细胞数接种至96孔板，细胞贴壁生长后加入终浓度分别为0、0.25、0.5、1、2、4ug/ml的actd，分别在接种后0、12、24、36、48、60h。mtt法检测两种细胞存活率，确定最佳诱导剂量和诱导时间。在培养结束前4h加入5mg/ml的mtt溶液(终浓度为0.5mg/ml)，37℃培养至结束。吸净旧培养基和mtt，再加150uldmso重悬细胞，脱色摇床上震荡10min，充分溶解mtt结晶物，选择570nm波长在酶标仪上测定d值。每实验组设6个复孔，重复3次。按细胞存活率d=(实验组/对照组)×100%进行计算。由表2可以看出重组后的昆虫细胞株在不同浓度诱导剂和不同诱导时间均相对原细胞株具有显著地提高抗细胞凋亡性能。

实施例3重组昆虫细胞株的增殖重组杆状病毒表达外源蛋白及应用

在无菌转瓶中，用sf-900iiisfm培养基悬浮培养从液氮储存取出的初始sf9-op-bmbdv-ns1细胞培养物，其间恒速振荡。在含有25-125mlsf-900iiisfm无血清培养基的100ml-250ml转瓶中培养该培养物。当细胞倍增至细胞密度为2~6×10⁶cell/ml时，将它们分接种至新容器中，接种密度为5×10⁵cell/ml。在体积15升的applikon生物反应器中25-29℃培养扩增培养物2-7day。说明本发明的规模可以从小规模生产重组杆状病毒扩大到大规模生产。

3.1重组昆虫细胞株增殖重组杆状病毒rac-ha表达流感病毒ha蛋白

将3000mlsf-900iiisfm培养基含5×10⁵cell/ml的sf9-op-bmbdv-ns1细胞接种到15000mlapplikon生物反应器中。27℃培养2~3day后将50~500ml表达流感病毒ha蛋白杆状病毒加入3000mlsf-900iiisfm培养基中。27℃，100rpm振荡培养7day。从感染后第4day开始，每24h从生物反应器中提取一次样品，离心各样品。保存样品上清液，裂解细胞后，ha检测蛋白表达量。

作为对比，平行选取原始sf9细胞代替sf9-op-bmbdv-ns1细胞，进行对照试验。

实验结果见图5由图5可以明显看出在sf9-op-bmbdv-ns1中表达ha蛋白量相对于原始sf9细胞提高8倍。

3.2重组昆虫细胞株增殖重组杆状病毒rac-pcv2-orf2表达猪圆环病毒orf2蛋白

将3000mlsf-900iiisfm培养基含5×10⁵cell/ml的sf9-op-bmbdv-ns1细胞接种到15000mlapplikon生物反应器中。27℃培养2~3day后将50~500ml表达pcv2orf2杆状病毒加入3000mlsf-900iiisfm培养基中。27℃，100rpm振荡培养7day。从感染后第4day开始，每24h从生物反应器中提取一次样品，离心各样品。保存样品上清液，然后用elsae检测orf2含量。

作为对比，平行选取原始sf9细胞代替sf9-op-bmbdv-ns1细胞，进行对照试验。

实验结果见图6，由图6明显看出在sf9-op-bmbdv-ns1中表达猪圆环病毒orf2蛋白相对于原始sf9细胞提高10倍。

sequencelisting

<110>江苏省农业科学院

<120>高效增殖杆状病毒的昆虫细胞株及其构建方法和应用

<160>2

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<212>dna

<213>人工合成

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