一种简便快捷的羊水干细胞培养方法与流程

本发明涉及生物工程技术领域，特别涉及一种简便快捷的羊水干细胞培养方法。

背景技术：

细胞治疗，再生医学和干细胞研究中的最新进展已经显着增加了对各种类型的容易获得的细胞悬浮液的需求，特别是对多潜能基质细胞(mesenchymalstemcells，mscs)的需要。mscs在当前医学实践中受欢迎的主要原因是它们独特的免疫调节性质。但是mscs的生长能力和分化能力的随年龄增长而降低，成体组织中例如脂肪、真皮、骨、滑膜和骨髓中获得的细胞的细胞活性、分化能力等远不如胎儿来源的细胞，且在这些成体干细胞在分离，纯化和维持性上有一定难度，难以达到移植应用时所需的数量。因此胎儿组织例如脐带血，沃顿氏胶，羊膜和羊水被认为是更加有效的来源。

人类羊水干细胞(humanamnioticfluid-derivedstemcells，hafscs)易于获取，可以从产前诊断的少量羊水中提取；也可以从产后的羊水中分离。而且抽取羊水不会损害母体，也不会对胚胎造成影响，也就不存在伦理和道德上的问题。羊水中的细胞是一群处于胚胎发育早期的细胞群，从中分离的人羊水干细胞细胞是介于胚胎干细胞(embryonicstemcells，es)和成体干细胞之间的细胞类型，表达es细胞和成体干细胞的标志，具有相似的多向分化潜能，在不同的生长因子、培养基等的刺激下，可以分化为三个胚层来源的不同细胞。与胚胎干细胞不同的是，afscs在体内不形成肿瘤或畸胎瘤，且afscs不存在组织相容性和免疫排斥等问题。在未来治疗应用，再生医学以及研究中，使用afscs将会更加有利。

目前羊水干细胞的分选纯化方法主要有以下四种:机械分离法、差异贴壁分选法、免疫磁珠分选法和流式细胞仪分选法，但是费时费力，步骤较为繁琐导致培养过程中如需细胞转移时，被污染的可能性增大且这些方法所需仪器耗材成本较高。因此寻找出简便快捷的羊水干细胞培养方法成为一个重要课题。

技术实现要素：

为了克服现有的羊水干细胞培养步骤繁琐不方便操作以及成本过高，或可能存在未知病原体感染风险的问题，本发明在更简便、节约成本的操作下确保获得具有良好生长活性且保持羊水干细胞应有的生物学特性，应用前景广阔。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一种简便快捷的羊水干细胞培养方法，包括以下步骤：

(1)羊水干细胞的原代培养：

将羊水与加有edta的pbs1：1稀释，随后以1200r/min离心5min，弃上清后加入羊水专用培养基反复吹打混匀；然后接种在明胶包被的培养皿，以37℃、5％co2的环境条件培养4-5天；

(2)羊水干细胞的传代培养：

当原代培养的羊水干细胞达到80～90％汇合时，弃去细胞培养液；用pbs洗涤三次；用含有0.02％edta的0.25％胰蛋白酶覆盖细胞使细胞得到解离；待细胞回缩变圆并从培养皿上开始脱落时用含有10％胎牛血清的完全培养基终止消化；将混合液反复吹打直至贴壁细胞从培养皿上脱落形成细胞悬液1200rpm下离心5分钟；弃去液体后加入培养基轻柔吹匀使细胞散开。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

(1)本发明打破了传统的机械分离法、差异贴壁分选法、免疫磁珠分选法和流式细胞仪分选法，简化了实验操作步骤，节省了时间，降低实验成本；

(2)本发明避免了实验步骤繁琐时，转移样品过程中造成的污染；

(3)本发明中培养出的细胞仍具有良好的活性且具有应有的生物学特性。

附图说明

图1是实施例2羊水干细胞传代培养的的生长曲线图；

图2是实施例3羊水干细胞表面标志物的免疫荧光鉴定结果图；

图3是实施例4羊水干细胞的成骨分化结果图；

图4是实施例4羊水干细胞的成脂分化结果图；

图5是实施例4羊水干细胞的对照结果图；

图6是实施例5羊水干细胞的流式细胞分析图。

具体实施方式

下面通过具体实施方式结合附图对本发明作进一步详细说明。但本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例1：羊水干细胞的分离培养

(1)羊水干细胞的原代培养：

羊水样品与加有edta的pbs1：1稀释；1200r/min离心5min；弃上清，加入羊水专用培养基反复吹打混匀；接种在明胶包被的培养皿；以37℃，5％co2的环境条件培养4-5天即可观察到羊水干细胞生长。

(2)羊水干细胞的传代培养：

当原代培养的羊水干细胞达到80～90％汇合时，弃去细胞培养液；用pbs洗涤三次；用含有0.02％edta的0.25％胰蛋白酶覆盖细胞使细胞得到解离；待细胞回缩变圆并从培养皿上开始脱落时用含有10％胎牛血清的完全培养基终止消化；将混合液反复吹打直至贴壁细胞从培养皿上脱落形成细胞悬液1200rpm下离心5分钟；弃去液体后加入培养基轻柔吹匀使细胞散开，从而对培养的羊水干细胞进行传代培养。

所述羊水专用培养基购于bi公司；所述的所述的胰酶购于gibco公司。

实施例2：羊水干细胞生长曲线的绘制

通过传代培养获得第3代、第6代的羊水干细胞，进行计数，并根据所得数据绘制生长曲线，以1×10⁴接种至24孔板内，每间隔24小时取三个孔，并记下平均数。得如图1所示的羊水干细胞生长曲线图。

实施例3：羊水干细胞的免疫荧光鉴定

(1)通过传代培养获得第3代的羊水干细胞，接种在明胶包被的24孔板上，待达到70％融合时，弃去培养液，用pbs洗涤2遍；

(2)在24孔板内加入3.7％多聚甲醛溶液固定30分钟，并用含有5％fbs的pbs洗涤细胞三次(每次洗涤10分钟)；

(3)在24孔板内加入透化剂(0.1％tritonx-100，pbs)，室温孵育15min后弃去，用pbs洗三遍，每次5min；

(4)在24孔板内加入封闭液(10％fbs:pbs)37℃封闭1h后弃去，pbs洗三遍，每次5min；

(5)在4℃下与针对cd34、cd44和cd90(1:200，santacruz，ca)的一抗孵育过夜，除去一抗后，用含有5％fbs的pbs洗涤细胞三次(每次洗涤10分钟)；

(6)室温下在黑暗中，加入用fitc标记的二抗(1：500，santacruz，ca)1小时，用pbs洗三遍，每次5min；

(7)最后将样品在避光条件下用dapi孵育5分钟，用pbs洗三遍，每次5min；

(8)加入抗荧光淬灭剂后在荧光显微镜下得到如图2所示的免疫荧光鉴定图，可知cd34不表达，cd44、cd90可表达。

所述dapi购于invitrogen公司。

实施例4：羊水干细胞的多向分化

通过传代培养，在第3次传代时以相同密度接种至六孔板的其中三个孔内，标记1、2、3，其中1、2两孔为实验组，3孔为对照，当细胞生长至80％的汇合时，去除培养基，然后用pbs洗涤细胞3次。

(1)将脂肪形成分化诱导培养基加入1孔中；

(2)将成骨分化诱导培养基加入2孔中；

(3)将完全培养基中加入3孔对照组细胞中。

培养基每3-4天完全更换。在诱导17天后，观察到1孔出现明显的大量钙结节时通过茜素红染色测定成骨能力，在诱导17天后观察到2孔中产生大量油脂时通过油红o染色评价脂肪生成能力。在光学显微镜下观察并拍照，得到如图3、4所示的分化结果图，以及图5所示的对照组。

所述脂肪形成分化诱导培养基(adm)和成骨分化诱导培养基(odm)购于gibco公司；所述油红o、茜素红染色液购于solarbio公司。

实施例5：流式细胞分析

(1)取第3代羊水干细胞(p3)、0.25％胰蛋白酶消化收集细胞，调节细胞浓度1×10⁶个/ml；

(2)1500r/min，离心5min，细胞沉淀重悬于100μlpbs中；

(3)加入相应检测细胞表面抗体hla-abc、hla-dr以及对应的同型对照igg1、igg2，室温避光放置30min；

(4)pbs清洗2次，1000r/min，离心5min，弃上清，加入500μlpbs重悬细胞，流式细胞仪检测。

所述hla-abc、hla-dr、同型对照igg1、igg2抗体购于bd公司。

如图6所示，结果表明羊水干细胞具有免疫抑制作用，而且其低表达hla-abc和hla-dr表面抗原，表现出低免疫源性和免疫抑制作用，证明羊水干细胞是较为理想的免疫赦免细胞。