一种筛选棉花抗旱相关基因的方法与流程

本发明属于生物技术领域，涉及一种筛选棉花抗旱相关基因的方法，特别涉及一种通过检测经和未经干旱胁迫处理的棉花基因组甲基化水平的变化来筛选棉花抗旱相关基因的方法。

背景技术：

全球气候变化加剧，水资源缺乏，温室效应加剧，土壤盐渍化严重，已严重制约我国农业生产。从世界范围内来看，干旱是影响面积最广，造成经济损失最为严重，被认为是世界上最严重的自然灾害之一。全世界土地28％干旱，我国有2/3土地干旱。随着我国粮棉争地的矛盾日益突出，棉花、马铃薯等经济作物的生产形势起伏不定，不容乐观。针对棉花的抗旱性研究，一直都是国内外学者研究的热点，更是增加棉花单位面积产量、提高棉花品质，解决棉花产能不足的关键所在。据统计，我国旱地总面积约为7.58×10⁷hm²，占我国总耕地面积的73.70％，截止2010年我国共有5.5×10⁵hm²耕地受旱，每年造成的经济损失约占总自然灾害的70％以上。因此，开展干旱胁迫对我国经济作物的影响研究，合理开发利用旱地，对我农业生产和经济发展具有重要战略意义。

棉花因具有较强的抗逆性，而被誉为盐碱地的先锋作物。研究棉花的抗旱性，挖掘抗旱相关基因，提高棉花抗逆性，具有重要意义。DNA甲基化是表观遗传学现象的重要内容之一，与动植物的正常生长发育、植物防御、逆境胁迫等许多生命活动有密切联系，在整个生命过程中都发挥着重要作用。在正常情况下，开花被子植物基因组中有20-30％的胞嘧啶残基会发生甲基化，最近研究表明，这个比例还会更高，绝大部分都发生在CG二核苷酸和CNG三核苷酸中，其它位点相对较少。DNA甲基化位点和模式的变化是一个动态变化，会随着植物生长发育，逆境响应等生命过程发生变化。甲基化水平和状态的改变相应的会引起基因表达水平的改变，研究表明，基因转录受甲基化影响，甲基化程度较高的基因会抑制表达，而本身发生去甲基化的基因将会增强表达表达。

甲基化敏感扩增多态性(Methylation-sensitive amplification polymorphism,MSAP)技术在改良的AFLP的基础上发展起来的一种技术，采用不同的限制性内切酶HpaⅡ和MspⅠ对5′-CCGG-3′位点进行甲基化酶切，两种酶对甲基化敏感性不同，但二者均能识别并切割CCGG序列，可产生不同的切割片段，通过扩增这些切割产物来分析甲基化水平和模式变化。这种方法已经被广泛应用于拟南芥、水稻和棉花等许多其他作物，已经被认为是一种经典的DNA甲基化检测方法。但是关于干旱胁迫诱导陆地棉DNA甲基化变化的报道还鲜有报道。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种新的筛选与棉花抗旱性相关基因的方法。

本发明所提供的筛选与棉花抗旱性相关基因的方法，具体可包括如下步骤：

(1)设置如下实验组和对照组：

实验组：对待测棉花进行干旱胁迫处理；

对照组：对所述待测棉花不进行干旱胁迫处理；

所述实验组和所述对照组的差别仅仅在于是否经过干旱胁迫处理，其余所有条件保持一致。

(2)检测并比较所述实验组和所述对照组中所述待测棉花的基因组DNA的甲基化水平和/或模式，找到两组中甲基化水平和/或模式存在显著性差异的基因，即为或候选为与棉花抗旱性相关基因。

在本发明中，所述棉花为陆地棉，具体为陆地棉“中H177”。

在所述方法的步骤(1)中，对所述待测棉花进行干旱胁迫处理时选择在棉花幼苗长至三叶一心时期进行，待土壤相对含水量下降至7.0％时完成干旱胁迫处理。

在所述方法的步骤(2)中，本发明是采用MSAP技术检测并比较所述实验组和所述对照组中所述待测棉花的基因组DNA的甲基化水平的。

本发明采用MSAP技术检测并比较所述实验组和所述对照组中所述待测棉花的基因组DNA的甲基化水平和/或模式时，所用如下：

(a1)双酶切组合为EcoR I/Hpa II和EcoR I/Msp I。

(a2)针对EcoR I的接头由序列表中序列1和序列2所示的两条单链DNA分子互补配对形成；针对Hpa II和Msp I的接头由序列表中序列3和序列4所示的两条单链DNA分子互补配对形成。

(a3)针对EcoR I的预扩增引物为序列表中序列5所示单链DNA分子；针对Hpa II和Msp I的预扩增引物为序列表中序列6所示单链DNA分子。

(a4)针对EcoR I的选择性扩增引物为序列表中序列7、序列8、序列9或序列10所示单链DNA分子；针对Hpa II和Msp I的选择性扩增引物为序列表中序列11、序列12、序列13或序列14所示单链DNA分子。

相应的，预扩增PCR体系采用50μL反应体系，含5μL连接稀释产物、两条预扩增引物分别为1μL(引物浓度为10μM)、2.5U Taq酶、1×PCR buffer、5μL 2.5mM dNTP。预扩增PCR反应程序为：94℃2min；94℃30s，56℃1min，72℃1min，30个循环；72℃10min。

选择性PCR扩增体系采用20μL反应体系，含2μL预扩增产物、1μL选择性扩增引物(上下游引物各1μL，引物浓度为10μM)、1×PCR buffer、0.5U Taq酶、2μL2.5mM dNTP。选择性PCR反应程序为：94℃30s(变性)；65℃1min(退火)，72℃1min(延伸)；从第2个循环至第13个循环，退火温度逐次递减，每个循环降低0.7℃；从第14个循环到35个循环退火温度保持在56℃，而其它的程序不变；最后72℃延伸10min。

所述方法中，所述找到两组中甲基化水平和/或模式存在差异的基因，具体可为：根据MSAP电泳结果，找到所述实验组和所述对照组中的差异条带，将所述差异条带切割回收测序，根据测序结果，在NCBI数据库进行同源性搜索，找出相应基因，即为或候选为与棉花抗旱性相关基因。

含有如下组合的产品在筛选与棉花抗旱性相关基因中的应用也属于本发明的保护范围：

(1)限制性内切酶EcoR I、Hpa II和Msp I；

(2)针对EcoR I的接头，以及针对Hpa II和Msp I的接头；

所述针对EcoR I的接头由序列表中序列1和序列2所示的两条单链DNA分子互补配对形成；所述针对Hpa II和Msp I的接头由序列表中序列3和序列4所示的两条单链DNA分子互补配对形成；

(3)针对EcoR I的预扩增引物和针对Hpa II和Msp I的预扩增引物；

所述针对EcoR I的预扩增引物为序列表中序列5所示单链DNA分子；所述针对Hpa II和Msp I的预扩增引物为序列表中序列6所示单链DNA分子；

(4)针对EcoR I的选择性扩增引物和针对Hpa II和Msp I的选择性扩增引物；

所述针对EcoR I的选择性扩增引物为序列表中序列7、序列8、序列9或序列10所示单链DNA分子；所述针对Hpa II和Msp I的选择性扩增引物为序列表中序列11、序列12、序列13或序列14所示单链DNA分子。

本发明还请求保护一种用于筛选与棉花抗旱性相关基因的产品。

本发明所提供的用于筛选与棉花抗旱性相关基因的产品，含有如下：

(1)限制性内切酶EcoR I、Hpa II和Msp I；

(2)针对EcoR I的接头，以及针对Hpa II和Msp I的接头；

所述针对EcoR I的接头由序列表中序列1和序列2所示的两条单链DNA分子互补配对形成；所述针对Hpa II和Msp I的接头由序列表中序列3和序列4所示的两条单链DNA分子互补配对形成；

(3)针对EcoR I的预扩增引物和针对Hpa II和Msp I的预扩增引物；

所述针对EcoR I的预扩增引物为序列表中序列5所示单链DNA分子；所述针对Hpa II和Msp I的预扩增引物为序列表中序列6所示单链DNA分子；

(4)针对EcoR I的选择性扩增引物和针对Hpa II和Msp I的选择性扩增引物；

所述针对EcoR I的选择性扩增引物为序列表中序列7、序列8、序列9或序列10所示单链DNA分子；所述针对Hpa II和Msp I的选择性扩增引物为序列表中序列11、序列12、序列13或序列14所示单链DNA分子。

在所述应用和所述产品中，所述棉花可为陆地棉，具体可为陆地棉“中H177”。

本发明利用MSAP技术分析陆地棉幼苗在干旱胁迫下的甲基化和/或模式变化差异，分析胁迫前后CCGG位点胞嘧啶甲基化水平和/或模式的变化，利用甲基化差异片段来搜索抗旱相关基因，可以为棉花抗旱表观遗传调控机制研究和抗旱相关基因筛选提供依据。

附图说明

图1为棉花干旱胁迫前后形态变化。

图2为棉花材料中H177基因组DNA电泳结果。

图3为DNA甲基化MSAP扩增图谱。其中，H：HpaⅡ/EcoRⅠ；M：MspⅠ/EcoR。类型I：未甲基化条带；类型II：半甲基化条带；类型III：全甲基化条带。

图4为干旱胁迫与对照之间棉花基因组的DNA甲基化模式分析。其中H⁰和M⁰为对照的MSAP带型，H和M为干旱胁迫处理的MSAP带型；H⁰和H为HpaⅡ/EcoRⅠ酶切，M⁰和M为MspⅠ/EcoRⅠ酶切。

图5为M1-M5这几个同源基因在干旱胁迫下的相对表达量。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

陆地棉抗旱材料中H177：来自中国农业科学院棉花研究所。记载于“宋贵方.陆地棉抗旱相关基因(GhTrx、GhGR)克隆及其功能分析.河南大学，2012，硕士论文”一文，公众可从申请人处获得，仅可用于重复本发明实验使用。

实施例1、利用甲基化敏感扩增多态性技术(MSAP)筛选陆地棉抗旱相关基因

一、试验材料

本发明采用棉花抗旱材料中H177，采用沙培法，在培养箱中育苗(光照14h，30℃；暗10h，25℃)。挑选籽粒饱满，均匀一致的种子，经浓度为5％的次氯酸钠消毒后，用无菌水进行冲洗干净，在无菌培养皿中催芽36h，挑选发芽一致的种子进行种植。在棉花幼苗长至三叶一心时期进行干旱胁迫，监测沙土含水量变化，待土壤相对含水量下降至7.0％左右时，进行叶片取样，液氮速冻，-80℃保存。其中，棉花中H177干旱胁迫前后形态变化如图1所示。

实验同时设置未经干旱胁迫处理的中H177作为对照。

二、基因组DNA的提取、纯化和测定

以改良的CTAB法(Porebski S,Grant-Bailey L,Baum B R.Modification fof a CTAB extraction protocol for plants containing high polysaccharide and polyphenol components.Plant Molecular Biology Reporter,1997,15(1):8-15.)提取基因组DNA，用RNA酶(10mg·mL-1)处理，去除RNA，纯化后的DNA质量用1.0％的琼脂糖凝胶电泳(图2)和核酸测定仪(Nanodrop_2000)进行检测，分装，4℃和-20℃保存备用。

三、甲基化敏感扩增多态性分析(MSAP)

1、试验方法

参照Zhao等(Zhao Y L,Yu S X,Ye WW,et al.Study on DNA cytosine methylation of cotton(Gossypium hirsutum L.)genome and its implication for salt tolerance.Agricultural Science in China,2010,9(6):783-791.)的方法进行MSAP分析，双酶切组合为EcoRⅠ/HpaⅡ和EcoRⅠ/MspⅠ，接头、预扩增和选择性扩增引物见表1。

表1接头、预扩增和选择性扩增引物

酶切体系(20μL)：400ngDNA，EcoR I和HpaII(或MspI)各10U，酶切3h。

连接体系(20μl)：200ng酶切产物，5pmol EcoRI接头，50pmol HpaII-MspI接头，10U T4连接酶，16℃过夜。连接产物稀释10倍，备用。

预扩增PCR体系(50μL)：5μL连接稀释产物，预扩增引物E1和HM1分别为1μL(引物浓度为10μM)，2.5U Taq酶，1×PCR buffer，5μL 2.5mM dNTP。预扩增PCR反应程序：94℃2min；94℃30s，56℃1min，72℃1min，30个循环；72℃10min。产物稀释10倍备用。

选择性PCR扩增体系(20μ)：2μL预扩增稀释产物、1μL选择性扩增引物(上下游引物各1μL，引物浓度为10μM)、1×PCR buffer、0.5U Taq酶、2μL 2.5mM dNTP。选择性PCR反应程序为：94℃30s(变性)；65℃1min(退火)，72℃1min(延伸)；从第2个循环至第13个循环，退火温度逐次递减，每个循环降低0.7℃；从第14个循环到35个循环退火温度保持在56℃，而其它的程序不变；最后72℃延伸10min。

反应结束后，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，基因组DNA经过酶切组合HpaⅡ/EcoRⅠ(H)和MspⅠ/EcoRⅠ(M)酶切后通常产生4种带型，但是在聚丙烯酰胺凝胶电泳上只能检测出3种带型(图3)。类型Ⅰ，2条泳道均有带，表明无甲基化发生；类型Ⅱ，H泳道有带，而M泳道没有带，表明CCGG位点发生半甲基化；类型Ⅲ，H泳道无带，而M泳道有带，表明CCGG位点发生全甲基化。根据电泳结果所呈现的H/M泳道的带型情况，进行统计分析。

2、试验结果

(1)干旱胁迫引起的棉花基因组DNA甲基化水平变化

采用表1中的16对引物(选择性扩增引物共计16种组合)进行MSAP分析，在未经干旱胁迫处理的棉花材料中H177中可扩增的条带总数为324条，甲基化条带比率为26.85％，全甲基化条带比率为20.06％。而经干旱胁迫处理后可扩增的条带数为354条，甲基化条带比率为29.94％，全甲基化条带比率为24.57％，具体见表2。即经干旱胁迫后，棉花基因组的甲基化水平升高。

表2干旱胁迫对棉花叶片DNA甲基化水平影响

注：扩增条带总数＝I+II+III；甲基化条带总数＝II+III；全甲基化条带总数＝III。

(2)干旱胁迫引起的棉花基因组DNA甲基化模式变化

通过MSAP分析，了解经干旱胁迫处理后特定CCGG位点甲基化模式变化情况。结果显示试验材料的MSAP分析共扩增出11种带型(图4，11种带型与表3中的类型相对应)，分多态性和单态性2种。多态性是指对照与干旱胁迫处理组在甲基化模式上不同，又有3种状态即甲基化(B型)、去甲基化(C型)和不定类型(D型)；单态性即对照与处理之间有相同的带型(A型)，表明处理后的甲基化状态没有改变。B型表示胁迫以后甲基化水平增加，C型表示胁迫以后甲基化水平下降，D型表示对照与处理组中的DNA甲基化状态无法确定。通过对带型的统计分析，发现棉花经干旱胁迫后，DNA甲基化状态发生了很大的变化，具体见表3。

表3干旱胁迫对棉花叶片DNA甲基化状态的影响

注：H为HpaⅡ/EcoRⅠ酶切，M为MspⅠ/EcoRⅠ酶切；+：有带，-：无带；C表示甲基化胞嘧啶。

四、MSAP差异片段的回收、测序及同源比对

对对照组和实验组的MSAP差异片段进行回收、扩增和序列分析。具体如下：采用灭菌的手术刀片切割MSAP差异片段，然后用载玻片将切下的条带压碎。差异条带采用Poly-Gel(Omega BioTek,USA)进行回收，回收产物用作DNA扩增模板，然后测序。根据测序结果，在NCBI数据库进行同源性搜索，找出抗旱相关基因(表4)。

表4差异序列的同源性分析

根据本课题前期抗旱双向电泳实验分析结果(参考文献：陆许可等.干旱胁迫下不同抗旱水平陆地棉的叶片蛋白质组学比较研究.西北植物学报,2013,33(12):2401-2409)，表明表4中的基因与抗旱性相关。

五、同源基因表达量检测(qRT-PCR)

采用荧光定量PCR(qRT-PCR)方法检测同源基因的mRNA表达水平。提取实验组和对照组样品的总RNA，反转录合成cDNA第一链，-20℃保存用于qRT-PCR分析。以cDNA为模板，以肌动蛋白(Actin)为内参基因，同源基因引物如下：M1：5′-GATCTGCGAGTCCCTACTGC-3′，5′-GGGGCGACCATACTTGTTCA-3′；M2：5′-AAAACAGCGGTAGCCACAGA-3′，5′-TACCTGCGCCACAGAAGATG-3′；M3：5′-CAGCTACAGCGCGTTCTTTG-3′，5′-TGCCAGGCCAGACAATTAGG-3′；M4：5′-GAGGTGATGCAACTGGGACA-3′，5′-GTTGATTCCGATGGCCCTGA-3′；M5：5′-ACCCAGCAAACCAAGTAGGG-3′，5′-CACTCAGCACGATGGACAGT-3′。荧光定量PCR体系为20μL，扩增程序为94℃30s；94℃5s，55℃15s，72℃10s，40-45个循环反应结束后收集CT值，采用2^-ΔΔCT法计算基因的相对表达量。

结果如图5所示，可见M1-M5这几个同源基因在干旱胁迫下的相对表达量较对照相比有不同程度的升高，且差异显著。

<110> 中国农业科学院棉花研究所

<120> 一种筛选棉花抗旱相关基因的方法

<130> GNCLN170535

<160> 14

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 1

ctcgtagact gcgtacc 17

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 2

catctgacgc atggttaa 18

<210> 3

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 3

gacgatgagt ctagaa 16

<210> 4

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 4

ctactcagat cttgc 15

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 5

gtagactgcg taccaattca 20

<210> 6

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 6

gatgagtcta gaacggt 17

<210> 7

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 7

gtagactgcg taccaattca ca 22

<210> 8

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 8

gtagactgcg taccaattca ct 22

<210> 9

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 9

gtagactgcg taccaattca cg 22

<210> 10

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 10

gtagactgcg taccaattca ga 22

<210> 11

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 11

gatgagtcta gaacggtat 19

<210> 12

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 12

gatgagtcta gaacggtag 19

<210> 13

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 13

gatgagtcta gaacggtac 19

<210> 14

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 14

gatgagtcta gaacggtcg 19