与激活型肝星状细胞特异性结合的多肽及制备方法和应用与流程

文档序号:12054497阅读:来源:国知局

技术特征:

1.与激活型肝星状细胞特异性结合的多肽,其特征在于:所述多肽的氨基酸序列为Thr-Val-Arg-Thr-Ser-Ala-Asp。

2.如权利要求1所述的与激活型肝星状细胞特异性结合的多肽的制备方法,其特征在于:包括以下步骤:(1)静止型肝星状细胞与激活型肝星状细胞培养;(2)以静止型肝星状细胞为吸附细胞、激活型肝星状细胞为靶细胞,采用噬菌体展示技术进行差减筛选;(3)经DNA测序确定目标多肽。

3.根据权利要求2所述的与激活型肝星状细胞特异性结合的多肽的制备方法,其特征在于:所述步骤(2)以静止型肝星状细胞为吸附细胞、激活型肝星状细胞为靶细胞,采用噬菌体展示技术进行差减筛选,具体为:分别取步骤(1)中培养的生长良好的静止型肝星状细胞以及激活型肝星状细胞,在37℃、体积浓度5%的CO2条件下,置于无血清培养基中培养2h后,备用;分别在所得静止型肝星状细胞以及激活型肝星状细胞培养皿中加入BSA,在37℃、50rpm条件下,恒温培养摇床中封闭;在静止型肝星状细胞中加入噬菌体原始肽库的稀释液,在37℃、50rpm条件下恒温培养摇床中孵育;随后将与静止型肝星状细胞孵育后的上清液加入封闭后的激活型肝星状细胞中,在37℃、50rpm条件下恒温培养摇床中孵育,弃与激活型肝星状细胞孵育后的上清液,用PBST缓冲液洗涤6次,加入pH=2.2的甘氨酸-盐酸缓冲液,置于37℃、50rpm条件下恒温培养摇床中洗脱;收集洗脱液,加入pH=9.1的Tris-HCl缓冲液进行中和;测定洗脱液所含噬菌体滴度;随后取该洗脱液感染宿主菌E.coli ER2738进行扩增,扩增后噬菌体通过离心以及PEG/NaCl沉淀的方法进行纯化,再次测定扩增、纯化后噬菌体滴度,完成第一轮筛选;重复以上步骤数次,筛选结束。

4.根据权利要求3所述的与激活型肝星状细胞特异性结合的多肽的制备方法,其特征在于:所述步骤(2)以静止型肝星状细胞为吸附细胞、激活型肝星状细胞为靶细胞,采用噬菌体展示技术进行差减筛选,具体为:分别取步骤(1)中培养的生长良好的静止型肝星状细胞以及激活型肝星状细胞,在37℃、体积浓度5%的CO2条件下,置于无血清培养基中培养2h后,备用;分别在所得静止型肝星状细胞以及激活型肝星状细胞培养皿中加入1.5mL质量浓度为1%的BSA,在37℃、50rpm条件下,恒温培养摇床中封闭30min;在静止型肝星状细胞中加入1.5mL滴度为2×1011pfu的噬菌体原始肽库的稀释液,在37℃、50rpm条件下恒温培养摇床中孵育1h;随后将与静止型肝星状细胞孵育后的上清液加入封闭后的激活型肝星状细胞中,在37℃、50rpm条件下恒温培养摇床中孵育1h,弃与激活型肝星状细胞孵育后的上清液,用0.1%~0.3%PBST缓冲液洗涤6次,加入1mL0.2mol/L的pH=2.2的甘氨酸-盐酸缓冲液,置于37℃、50rpm条件下恒温培养摇床中洗脱10min;收集洗脱液,加入150μL1mol/L的pH=9.1的Tris-HCl缓冲液进行中和;测定洗脱液所含噬菌体滴度;随后取0.5mL该洗脱液感染宿主菌E.coli ER2738进行扩增,扩增后噬菌体通过离心以及PEG/NaCl沉淀的方法进行纯化,再次测定扩增、纯化后噬菌体滴度,完成第一轮筛选;重复以上步骤数次,筛选结束。

5.根据权利要求4所述的与激活型肝星状细胞特异性结合的多肽的制备方法,其特征在于:所述步骤(2)中共完成3~5轮筛选,所用0.1%~0.3%PBST缓冲液是指含Tween-20体积浓度为0.1%~0.3%的PBS缓冲液。

6.根据权利要求3~5任一项所述的与激活型肝星状细胞特异性结合的多肽的制备方法,其特征在于:所述步骤(2)中共完成4轮筛选;其中,第一轮筛选中所用0.1%PBST缓冲液为含Tween-20体积浓度为0.1%的PBS缓冲液;第二轮筛选中所用PBST缓冲液为0.2%PBST缓冲液,即含Tween-20体积浓度为0.2%的PBS缓冲液;第三轮和第四轮筛选中所用PBST缓冲液为0.3%PBST缓冲液,即含Tween-20体积浓度为0.3%的PBS缓冲液;第四轮筛选时洗脱液进行滴度测定后不再进行扩增纯化。

7.根据权利要求2所述的与激活型肝星状细胞特异性结合的多肽的制备方法,其特征在于:所述步骤(3)经DNA测序确定目标多肽,具体为:取最后一轮筛选后的洗脱液进行噬菌体滴度测定时,选取若干个阳性噬菌体克隆,分别进行扩增和纯化,随后进行DNA测序,选取测序结果显示插入序列重复次数最多的噬菌体,其所展示的多肽即为目标多肽。

8.根据权利要求2所述的与激活型肝星状细胞特异性结合的多肽的制备方法,其特征在于:所述步骤(1)中静止型肝星状细胞是通过以下步骤培养:将大鼠麻醉后,采用质量浓度为0.05%的Ⅳ胶原酶体外循环消化以及Opetiprep密度梯度离心的方法,分离大鼠原代肝星状细胞,用含20%FBS的高糖DMEM培养基重悬细胞,按3×106接种于6cm培养皿中,置于37℃、体积浓度5%的CO2的二氧化碳培养箱中培养24h,细胞贴壁单层长满皿底,即得静止型肝星状细胞。

9.根据权利要求2所述的与激活型肝星状细胞特异性结合的多肽的制备方法,其特征在于:所述步骤(1)中激活型肝星状细胞是通过以下步骤培养:原代分离的肝星状细胞培养14天后,用质量浓度为0.25%的胰酶常规消化传代,用含10%FBS的高糖DMEM培养基重悬细胞沉淀后接种到新的6cm培养皿中,置于37℃、体积浓度5%的CO2条件下培养,待细胞贴壁单层长满皿底,即得激活型肝星状细胞。

10.如权利要求1所述的与激活型肝星状细胞特异性结合的多肽在制备肝纤维化诊断试剂或肝纤维化靶向治疗药物中的应用。

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