一种四肽荧光水凝胶的制备方法与流程

本发明属于生物医用材料的应用领域，涉及一种四肽荧光水凝胶的制备方法。

背景技术：

水凝胶材料由于能够吸取大量的水分，并且具有优良的生物相容性，部分水凝胶材料由于引入了酯键，酰胺键等在体内环境中易水解或者酶解，因而具备优良的可生物降解行为，因而水凝胶材料作为药物包载的载体在体内环境下控制释放引起了广泛的关注，但是由于水凝胶在植入体内环境中时，很难通过外界的设备很容易的观察水凝胶的降解情况，所处的位置等。因而采用荧光分子跟踪水凝胶成为了本文的想法，四肽分子由于由氨基酸缩合而成，因而具备优良的生物相容性，由于氨基酸的多样性，因而可以制备得到不同性能的四肽分子，如亲水性肽链，疏水性肽链，带电荷的肽链，因而能够制备得到不同性能的水凝胶材料，罗丹明B分子作为一种典型的示踪荧光分子广泛应用于生物领域，因而利用四肽分子和罗丹明B分子相结合制备得到一种相容性优良的四肽荧光分子，利用四肽荧光分子，与活性稀释剂单体结合，通过紫外光聚合的方法制备得到荧光水凝胶，用于抗癌药物的包载，植入人体内，治疗病变部位，因而这种荧光水凝胶本身能够作为一种示踪剂，跟踪水凝胶的位置，以及降解状况，同时又能够作为抗癌药物的载体，于病变部位，释放抗癌药物，杀死癌细胞。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题是：基于上述问题，本发明提供一种四肽荧光水凝胶的制备方法。

本发明解决其技术问题所采用的一个技术方案是：一种四肽荧光水凝胶的制备方法，包括以下步骤：

a、制备四肽长链：采用固相合成四肽的方法，制备得到四肽长链；

b、制备四肽荧光长链分子：将步骤a得到四肽长链与罗丹明B在缩合剂Ⅱ作用下，制备得到四肽荧光长链分子；

c、制备四肽荧光水凝胶：将步骤b得到的四肽荧光长链分子作为大分子单体，加入活性稀释剂、小分子交联剂和光引发剂，紫外光固化制备得到荧光水凝胶。

进一步地，步骤a中制备四肽长链的具体过程为：四肽固相合成反应管中加入树脂，用哌啶的DMF溶液脱除氨基酸上的保护基团Fmoc，用DMF、DCM溶剂依次反复冲洗，在缩合剂Ⅰ作用下，将第一个Fmoc基团保护的氨基酸接到氨基树脂上，用哌啶的DMF溶液脱除氨基酸上的保护基团Fmoc，用DMF、DCM溶剂依次反复冲洗，如此不断接上其他三个的氨基酸，得到链接在树脂上的四肽长链分子。

进一步地，树脂为氯甲基树脂、氨基树脂、羧基树脂，缩合剂Ⅰ为二环己基碳化二亚胺、N,N-二异丙基碳二亚胺、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺中的一种，缩合剂Ⅰ的加入量为与当前活化的氨基酸的反应摩尔比为1～1.5:1。

进一步地，树脂与第一个链接的氨基酸的摩尔比为1：2～5，下一个氨基酸与前一个氨基酸之间的摩尔比为1：1～2，哌啶的DMF溶液中哌啶的体积浓度为10～30％。

进一步地，步骤b中制备四肽荧光长链的具体过程为：将四肽长链用DCM溶胀，称取罗丹明B溶解在DMF溶剂中，罗丹明B溶液中加入缩合剂Ⅱ，将混合溶液和溶胀的四肽长链加入四肽反应管中，反应，用DCM与DMF溶剂多次清洗，用切割液割除树脂以及氨基酸上的侧基保护基团，制备得到四肽荧光长链分子。

进一步地，步骤b中的四肽长链和罗丹明B的反应摩尔比为1：1～3，缩合剂Ⅱ为二环己基碳化二亚胺、N,N-二异丙基碳二亚胺、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺中的一种，罗丹明B溶液的质量体积浓度为20～40％，反应温度为30℃，反应时间为30～90min，缩合剂Ⅱ的加入量与罗丹明B的反应摩尔比为1～1.5:1。切割液为三氟乙酸：三异丙基硅烷：二氯甲烷的体积比为20：1：1的混合溶液。

进一步地，步骤c中制备荧光水凝胶的具体过程为：四肽荧光长链分子、活性稀释剂、小分子交联剂和光引发剂溶解在DMF溶剂中，紫外光固化制备得到四肽荧光水凝胶。

进一步地，活性稀释剂为N-异丙基丙烯酰胺，小分子交联剂为N，N’-亚甲基双丙烯酰胺，光引发剂为1-羟基环己基苯基甲酮、安息香双甲醚、2-羟基-4-(2-羟乙氧基)-2-甲基苯丙酮中的一种。

进一步地，四肽荧光长链分子和活性稀释剂的反应质量比为20～60％：80～40％，小分子交联剂的质量占四肽荧光长链分子和活性稀释剂总质量的2～10％，光引发剂的质量占四肽荧光长链分子和活性稀释剂总质量的2～10％，紫外光固化时间为10～30min。

本发明的有益效果是：通过固相合成的方法制备了四肽长链分子，并且与罗丹明B分子反应制备得到了具有荧光性能的四肽分子，因而利用其为单体，制备了一种荧光监控的可生物降解的水凝胶载体。能够通过荧光的监测来观察水凝胶的降解、位置等情况。

附图说明

下面结合附图对本发明进一步说明。

图1是四肽荧光水凝胶的产率以及凝胶含量图，其中，W1，W2，W3分别为三个实例中制备得到的四肽荧光水凝胶；

图2是四肽荧光水凝胶的平衡溶胀率图，其中，W1，W2，W3分别为三个实例中制备得到的四肽荧光水凝胶；

图3是四肽荧光水凝胶的相对荧光强度图，其中，W1，W2，W3分别为三个实例中制备得到的四肽荧光水凝胶。

具体实施方式

现在结合具体实施例对本发明作进一步说明，以下实施例旨在说明本发明而不是对本发明的进一步限定。

实施例1

(1)固相合成的方法制备四肽长链：在四肽反应管中加入2.8g氨基树脂，用10ml DCM溶胀30min，接着加入20％哌啶的DMF 30ml溶液，于恒温振荡器中，30℃反应5min，脱除Fmoc保护官能团，依次用DMF与DCM溶剂冲洗，称取2.5gFmoc-Lys(Alloc)-OH于50ml离心管中，并加入700mg Oxymar/700μl DIC的DMF溶液(20ml)活化氨基酸，活化时间10min后，将上述活化溶液加入四肽反应管中，30℃反应30min，加入20％哌啶的DMF溶液20ml，脱除Fmoc保护基团，依次用DMF与DCM溶剂冲洗，去除未反应单体。重复活化、脱除Fmoc步骤，依次接入剩下的氨基酸(Fmoc-Gly-OH 2.5g,Fmoc-Phe-OH 2.5g，2.5gFmoc-Gly-OH 2.5g)，得到四肽长链分子链接在氨基树脂上。

(2)制备四肽荧光长链：将上述连接在氨基树脂上的四肽长链分子用10mlDCM溶胀30min，去除溶剂。称取罗丹明B荧光分子2.5g溶解在10ml DMF溶剂中，加入700mg Oxymar/700ul DIC，将溶胀好的四肽长链分子和罗丹明B溶液置于恒温振荡器中，30℃反应30min。用DCM与DMF反复冲洗，除去未反应的罗丹明B单体，制备得到荧光长链分子。利用20ml切割液三氟乙酸：三异丙基硅烷：二氯甲烷(20：1：1，V/V/V)切割掉氨基树脂和氨基酸上的侧基保护基。

(3)制备荧光水凝胶：称取四肽荧光长链分子0.5g、N-异丙基丙烯酰胺0.5g，将其二者依次溶解在1.5ml DMF溶剂中，加入0.1g小分子交联剂N,N-亚甲基双丙烯酰胺、光引发剂I₂₉₅₉ 0.1g，溶解均匀后，N₂鼓泡10min以去除掉混合体系中的O₂，将聚合物溶液移取到聚四氟乙烯磨具中(直径6mm，厚度1mm)。紫外光固化10min。取出固化后的水凝胶置于水中浸泡，除去未反应的单体，最后放入真空干燥箱中干燥至恒重，将得到荧光水凝胶。

实施例2

(1)固相合成的方法制备四肽长链：在四肽反应管中加入2.8g氨基树脂，用10ml DCM溶胀30min，接着加入10％哌啶的DMF 30ml溶液，于恒温振荡器中，30℃反应5min，脱除Fmoc保护官能团，依次用DMF与DCM溶剂冲洗。称取3g Fmoc-Lys(Alloc)-OH，于50ml离心管中，并加入700mg Oxymar/700μl DIC的DMF溶液(20ml)活化氨基酸，活化时间10min后，将上述活化溶液加入四肽反应管中，30℃反应60min，加入10％哌啶的DMF溶液20ml，同上脱除Fmoc保护基团，依次用DMF与DCM溶剂冲洗，去除未反应单体。重复活化、脱除Fmoc步骤，依次接入剩下的氨基酸(Fmoc-Gly-OH 3g,Fmoc-Asp(OtBu)-OH 3g，2.5g Fmoc-Gly-OH 2.5g)，得到四肽长链分子。

(2)制备四肽荧光长链：将上述连接在氨基树脂上的四肽长链分子用20mlDCM溶胀30min，去除溶剂。称取罗丹明B荧光分子3g溶解在10ml DMF溶剂中，加入800mg Oxymar/800μl DIC，将溶胀好的四肽长链分子和罗丹明B溶液置于恒温振荡器中，30℃反应60min。用DCM与DMF反复冲洗，除去未反应的罗丹明B单体，制备得到荧光长链分子。利用20ml切割液三氟乙酸：三异丙基硅烷：二氯甲烷(20：1：1，V/V/V)切割掉氨基树脂和氨基酸上的侧基保护基。

(3)制备荧光水凝胶：称取四肽荧光长链分子0.2g、N-异丙基丙烯酰胺0.8g，将其二者依次溶解在1.5ml DMF溶剂中，加入0.05g小分子交联剂N,N-亚甲基双丙烯酰胺，光引发剂I₂₉₅₉ 0.05g，，溶解均匀后，N₂鼓泡10min以去除掉混合体系中的O₂，将聚合物溶液移取到聚四氟乙烯磨具中(直径6mm，厚度1mm)。紫外光固化10min。取出固化后的水凝胶置于水中浸泡，除去未反应的单体，最后放入真空干燥箱中干燥至恒重，将得到荧光水凝胶。

实施例3

(1)固相合成的方法制备四肽长链：在四肽反应管中加入2.8g氨基树脂，用10ml DCM溶胀30min，接着加入20％哌啶的DMF 30ml溶液，于恒温振荡器中，30℃下反应10min，脱除Fmoc保护官能团，依次用DMF与DCM溶剂冲洗。称取3.2g Fmoc-Lys(Alloc)-OH，于50ml离心管中，并用Oxymar/DIC的DMF溶液活化氨基酸，并加入700mg Oxymar/700μl DIC的DMF溶液(20ml)活化氨基酸，活化时间10min后，将上述活化溶液加入四肽反应管中，30℃反应90min，加入20％哌啶的DMF溶液30ml，同上脱除Fmoc保护基团，依次用DMF与DCM溶剂冲洗，去除未反应单体。重复活化、脱除Fmoc步骤，依次接入剩下的氨基酸(Fmoc-Gly-OH 3g，Fmoc-Arg(pbf)-OH 3.2g，2.5g Fmoc-Gly-OH 2.5g)，得到四肽长链分子。

(2)制备四肽荧光长链：将上述连接在氨基树脂上的四肽长链分子用20mlDCM溶胀30min，去除溶剂。称取罗丹明B荧光分子3.2g溶解在10ml的DMF溶剂中，加入800mg Oxymar/800μl DIC，将溶胀好的四肽长链分子和罗丹明B溶液置于恒温振荡器中，30℃反应90min。用DCM与DMF反复冲洗，除去未反应的罗丹明B单体，制备得到荧光长链分子。利用20ml切割液三氟乙酸：三异丙基硅烷：二氯甲烷(20：1：1，V/V/V)切割掉氨基树脂和氨基酸上的侧基保护基。

(3)制备荧光水凝胶：称取四肽荧光长链分子0.6g，N-异丙基丙烯酰胺0.4g，将其二者依次溶解在1.5ml DMF溶剂中，加入0.02g小分子交联剂N,N-亚甲基双丙烯酰胺，光引发剂I₂₉₅₉ 0.02g，溶解均匀后，N₂鼓泡10min以去除掉混合体系中的O₂，将聚合物溶液移取到聚四氟乙烯磨具中(直径6mm，厚度1mm)。紫外光固化10min。取出固化后的水凝胶置于水中浸泡，除去未反应的单体，最后放入真空干燥箱中干燥至恒重，将得到荧光水凝胶。

图1是制备的水凝胶的产率以及凝胶含量图，分别表示了发明中各实施例，W1，W2，W3黑色柱状图分别为三种实例中制备得到的四肽荧光水凝胶的产率图，W1，W2，W3柱状图分别三种实施例中制备得到的水凝胶的凝胶含量图，从图中可以看出三种实施例中荧光水凝胶的产率都在80～90％，产率较高，凝胶含量与四肽荧光分子和N-异丙基丙烯酰胺的用量比值有关。

图2是制备的水凝胶的平衡溶胀率图，分别表示了发明中各实施例制备得到的四肽荧光水凝胶的平衡溶胀率，从图中可以看出不同重量百分比的荧光分子的用量直接影响到荧光水凝胶的溶胀率，并且四肽荧光水凝胶的平衡溶胀率与制备得到的荧光水凝胶的凝胶含量有关，凝胶含量越小，制备得到的水凝胶的平衡溶胀率越大，这主要是由于凝胶含量越小，荧光水凝胶的内部结构越松散，这样更有利于水介质分子进入，增大四肽荧光水凝胶的平衡溶胀率。

图3是制备的水凝胶的相对荧光强度图，分别表示了发明中各实施例制备得到的荧光水凝胶的相对荧光强度，从图中可以看出，不同重量百分比的四肽荧光长链分子的用量影响水凝胶的相对荧光强度。

以上述依据本发明的理想实施例为启示，通过上述的说明内容，相关工作人员完全可以在不偏离本项发明技术思想的范围内，进行多样的变更以及修改。本项发明的技术性范围并不局限于说明书上的内容，必须要根据权利要求范围来确定其技术性范围。