一种永生化特络细胞系及其构建方法与流程

本发明涉及细胞工程
技术领域：
，具体地说，是一种永生化特络细胞系的构建方法。
背景技术：
：目前研究特络细胞的功能是使用不同种属动物(如小鼠、大鼠、猪等)的不同器官(肺脏、肾脏、心脏等)原代提取的特络细胞，提取过程耗时且每次提取都需要进行分离纯化和鉴定，需要投入大量的人力物力。由于多次分离和提取原代细胞是由于不同的人员进行，因此难以保证提取细胞的纯度和稳定性。在正常情况下，100％纯化的原代特络细胞低密度培养时，一周内全部死亡。中国《中华移植杂质》2016年5月刊登的论文《大鼠肾脏皮质中分离出新型间质细胞-特络细胞》，分离纯化及原代培养tc：在无菌条件下获取大鼠肾脏皮质，使用无菌剪刀将组织剪成约1mm×1mm的块状，pbs清洗3次，消化液为使用不含钙离子及镁离子的pbs配置的10mg/ml二型胶原酶及2000u/mldna酶，将组织置于37℃振荡器中消化4h，收集的细胞玄烨1500转离心5min，移至40μm细胞过滤器中过滤，细胞接种于10％胎牛血清的dmem/f12培养基，置于37℃、5％co2细胞培养箱培养，使用显微切割的方法去除杂细胞，具体方法如下：tc成簇生长后，于相差显微镜下利用细胞刮刀刮除杂细胞，弃去上层杂细胞悬浮液pbs冲洗，重复直至效果满意，而后行细胞传代。中国专利2016101653339公开了一种永生化的犬脂肪间充质干细胞系及其构建方法，以犬脂肪间充质干细胞作为宿主细胞，转染携带sv40大t抗原的慢病毒载体，将tag基因整合入犬脂肪间充质干细胞基因组中，经过连续传代筛选得到表达sv40大t抗原基因且具有多向分化潜能的细胞系。然而现有技术中，关于本发明永生化特络细胞系的构建方法，目前还未见报道。技术实现要素：本发明的第一个目的是针对现有技术中的不足，提供一种永生化特络细胞系的构建方法。本发明的第二个目的是针对现有技术中的不足，提供由如上所述方法构建获得的永生化特络细胞系。为实现上述第一个目的，本发明采取的技术方案是：一种永生化特络细胞系的构建方法，包括如下步骤：(1)将剪碎的小鼠肺脏组织块于二型胶原酶中消化，过滤，离心，收集细胞沉淀，在含有10％fbs的dmem/f12培养基中培养，待成纤维细胞贴壁后，将上清转移至另一培养皿，培养12小时后换液，继续培养3-5天；(2)用微量枪头作为细胞刮，刮除成纤维细胞，反复多次刮除后，进行特异性结构telopode的观察和免疫标记鉴定特络细胞；(3)以特络细胞作为宿主细胞，用含有sv-40-大t抗原的逆转录病毒载体感染宿主细胞，经过传代、筛选、鉴定。进一步，所述含有sv-40-大t抗原的逆转录病毒载体为ef1a-sv40-ires-puro逆转录病毒载体。进一步，所述步骤3包括：(1)设计合成引物，以含有sv40大t抗原基因的质粒为模板进行pcr扩增，通过两端所含酶切位点将其连入酶切后的过表达慢病毒载体上；将连接产物转入制备好的细菌感受态细胞，对长出的单克隆菌落先进行pcr鉴定，pcr鉴定阳性菌落进行测序鉴定，比对正确的克隆即为构建成功的目的基因过表达慢病毒载体；oligo名称寡聚单链dna序列5’to3’sv40-fccggaattcatggataaagttttaaacagagaggaatcsv40-rgctctagattacaagtcctcttcagaaatgag(2)用构建的慢病毒表达载体和包装质粒共转染慢病毒包装细胞，包被病毒，收集病毒原液，超滤浓缩，并测定滴度；(3)用含8μg/mlpolybrene的新鲜培养基稀释病毒原液，加入到靶细胞中，6小时后换液，向细胞中加入2μg/mlpuromycin，37℃，5％co2，常规培养24h，筛选性能稳定的永生化特络细胞系。为实现上述第二个目的，本发明采取的技术方案是：由如上所述方法构建的永生化特络细胞系。本发明优点在于：1、本发明的永生化特络细胞系培养至50代仍然保持较为稳定的状态，解决了现有技术多次分离和提取无法保证特络细胞纯度和稳定性的问题；并避免了多次分离和提取原代、每次分离和提取都需要反复纯化及多种方法鉴定所耗费的大量人力和资源。2、cell-iq细胞实时成像系统观察纯化原代特络细胞和本发明永生化特络细胞系的生长情况，结果显示：纯化的原代特络细胞贴壁后7天细胞全部死亡，本发明的永生化特络细胞系第50代贴壁后24h，36h，48h，72h，96h生长良好。3、比较特络细胞系和特络细胞-sv40细胞系的细胞周期。特络细胞-sv40细胞系sub-g1期明显降低，表明其凋亡率降低，s期和g2期明显升高，本发明的永生化特络细胞系可能通过加速s期和g2期进程导致细胞增殖增加。4、免疫荧光法在激光共聚焦显微镜下观察特络细胞系第50代细胞的相关免疫标记物vimentin和cd34的表达，fitc(绿色)标记显示cd34-的表达，keyfluor594(红色)标记显示了vimentin的表达。附图说明附图1为光镜观察特络细胞特征性结构telopode(↑)(200×)。附图2为免疫荧光法在激光共聚焦显微镜下鉴定特络细胞相关的免疫标记物vimentin和cd34有表达。其中a.dapi(蓝色)标记细胞核；b.fitc(绿色)标记显示了cd34-的表达；c.keyfluor594(红色)标记显示了vimentin的表达；d.dapi(蓝色)标记细胞核，fitc(绿色)标记显示cd34-的表达，keyfluor594(红色)标记显示了vimentin的表达。附图3为电镜观察特络细胞超微结构。可见明显的线粒体(↑)和内质网结构(▲)。附图4为免疫电镜鉴定特络细胞相关的免疫标记物vimentin、cd34、pdgf和ckit的表达。a.免疫电镜下，特络细胞的超微结构。b、c、d.免疫电镜下特络细胞相关的免疫标记物vimentin、cd34-、pdgf和ckit的表达。免疫标志物和对应的免疫胶体金颗粒大小分别为vimentin-10nm；cd34-18nm；pdgf-25nm；ckit-40nm。附图5为phy-801载体图谱。附图6为琼脂糖凝胶电泳结果。提取原代特络细胞组(细胞不转染)、nc组(空载体lenti转染对照组)和特络细胞系组(重组慢病毒表达载体lenti-sv40转染组)的mrna，逆转录后形成cdna，以含有sv40大t抗原基因的质粒为模板，t1和t2为引物进行pcr扩增。扩增后产物电泳观察结果并拍照，2154bp处出现条带，初步确定为sv40大t抗原基因的扩增产物。附图7为cell-iq细胞实时成像系统观察和记录纯化原代特络细胞贴壁后24h至96h的生长情况。附图8为cell-iq细胞实时成像系统观察和记录本发明特络细胞系贴壁后24h至96h的生长情况。附图9为光镜观察本发明第3代、第10代、第30代和第50代特络细胞系特征性结构telopode(↑)(200×)。附图10为免疫荧光法在激光共聚焦显微镜下鉴定本发明特络细胞系第3代、第10代、第30代和第50代的相关免疫标记物vimentin和cd34的表达。附图11为免疫电镜鉴定本发明特络细胞系第5代、第10代、第30代和第50代细胞的相关免疫标记物vimentin、cd34、pdgf和ckit的表达。具体实施方式下面结合具体实施方式，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明记载的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。实施例1本发明永生化特络细胞系的构建(1)提取原代特络细胞时采取分阶段贴壁法：将c57小鼠肺脏分离，无菌条件下在生理盐水中剪成1m3的组织块，置于2mg/ml二型胶原酶中37度消化30分钟，70微米孔径滤网过滤后，1500rm离心5分钟，收集细胞沉淀，在含有10％fbs的dmem/f12培养基中培养30分钟，待成纤维细胞贴壁后，将上清转移至另一培养皿，培养12小时后换液，继续培养3-5天后显微镜下观察特络细胞。(2)多次纯化以保证纯度：用微量枪头作为细胞刮，以该细胞的特征性结构为标准在显微镜下刮除其他细胞。多次纯化后得到特络细胞，既避免了流式分选过程对脆弱原代细胞的损伤，也避免了无限稀释法挑取单克隆造成该原代细胞死亡。(3)根据形态和免疫标记鉴定：反复多次刮除后，进行特异性结构telopode的观察(图1)和免疫标记鉴定特络细胞。共聚焦显微镜下观察到vimentin和cd34表达阳性(图2)。电镜下观察特络细胞超微结构(图3)。免疫胶体金颗粒染色后，电镜下观察到特络细胞vimentin、cd34、ckit以及pdgf表达阳性(图4)。(4)特络细胞在显微镜下运动活跃，除了特异性的telopode这一结构，特络细胞还显示出多形态性。微丝特异性染色显示出特络细胞中丰富的微丝结构，支持了其运动活跃的特性。实施例2sv40稳转细胞株的构建阶段1：过表达慢病毒载体的构建首先设计合成引物，扩增目的片段，再通过其两端所含酶切位点将其连入酶切后的过表达慢病毒载体上；将连接产物转入制备好的细菌感受态细胞，对长出的单克隆菌落先进行pcr鉴定，pcr鉴定阳性菌落进行测序鉴定，比对正确的克隆即为构建成功的目的基因过表达慢病毒载体。一、实验材料和方法(一)材料1.试剂试剂名称试剂来源pcr用试剂primer(r&f)生工生物工程(上海)有限公司taqpolymerasenebqiagenplasmid大抽kitqiagenbsasigmalborsoborsocalphaaesercacl2sigmat4dnaligasefermentast4dnaligasebufferfermentasmgso4sigma琼脂糖bio-raddnaladderfermentaspositiveclone测序invitrogen内切酶1fermentas内切酶2fermentas2.仪器(二)方法1.设计并合成引物1)根据基因名在ncbi中找到相应的目的基因序列。2)确定所用载体为。载体名称为phy-801，载体原件为ef1a-sv40-ires-puro。载体图谱如图5所示。3)用序列分析软件找出目的序列中存在的限制性内切酶，并对应使用的载体确定引物两端的酶切位点ecori和xbai。4)利用引物设计软件设计引物，并在5’端加入确定好的酶切位点。oligo名称寡聚单链dna序列5’to3’sv40-fccggaattcatggataaagttttaaacagagaggaatcsv40-rgctctagattacaagtcctcttcagaaatgag5)将设计好的引物序列送生工生物工程(上海)股份有限公司进行合成。2.载体的双酶切1)将含载体质粒的菌液过夜培养，并取新鲜菌液3-5ml提取质粒。具体方法参考qiagen质粒小抽说明书。2)取1μg新鲜质粒，用相应的限制性内切酶进行双酶切。酶切体系如下：于37℃酶切约3h。3)将酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，电泳结束后，进行胶回收，步骤如下：在紫外灯下，切下包含目的片段的胶条。用天平称量总重量并减去空管的重量算出凝胶的重量，按100mg＝100μl来计算凝胶的体积，并加入3倍凝胶体积的qgbuffer置于50℃水浴锅内将凝胶彻底融化。期间适当摇晃ep管，加快凝胶的溶解。4)等凝胶彻底融化后，加入与凝胶等体积的异丙醇并混合均匀。5)将上述液体全部转移到滤柱内，13000rpm离心30s。(可重复一次)然后弃掉管内液体，向柱内加入750μl的pebuffer。离心1min.。弃掉管内液体，再次空离2min。换一个新的1.5ml的ep管，向柱子内加入20μl的ddh2o，离心1min。为了提高回收率，可将溶解的dna再次加入柱子内离心一分钟。弃掉柱子，即为回收的载体片段，并测定浓度。3.目的片段的扩增及酶切(1)将合成的引物稀释成终浓度为10μmol/l的储藏液。(2)利用稀释的引物及模板进行pcr扩增。体系如下：将上述材料加入薄壁管内混匀并点离后放入pcr仪内，选择好合适的退火温度和延伸温度，即可开始pcr扩增。(3)pcr结束后进行琼脂糖凝胶电泳，并回收目的基因。方法同上。(4)将回收后的目的基因进行双酶切，酶切体系如下：于37℃酶切约5h或者过夜。(5)将酶切产物进行琼脂糖电泳并回收目的片段，方法同上。4.过表达载体与目的片段的连接(1)测定回收载体和目的片段的浓度，并按载体：目的片段＝1:7的摩尔比例计算载体和目的片段所需的体积比。(2)过表达载体与目的片段的连接，连接体系如下：于37℃连接30min后，立即置于5℃冰水浴冷却。5.转化(1)将感受态细胞置于冰上(4℃)待其自然解冻后，取10μl连接产物加入感受态细胞中于冰上(4℃)放置30min。(2)之后于42℃水浴中热击90s。然后迅速置于冰上(4℃)放置2-3min。(3)加入500μl不含抗生素的soc培养基于37℃，225rpm振荡培养45min。(4)3000rpm离心2min，弃掉900μl的上清液，将管底的菌液吹打散开，加入到含有载体上对应抗性(氨苄或卡那等)的培养平板中，用灭菌的涂布器涂匀(涂布器的温度不能太高，以免烫死菌体)，倒置于37℃恒温培养箱内过夜培养。6.pcr鉴定(1)挑取若干个单菌落，进行小量摇菌培养。(2)进行菌液pcr初步鉴定，方法同上步骤3，只将模板替换成新鲜菌液2-3μl。(3)将初步鉴定为阳性的样品，每个克隆挑选两个送测序公司进行测序鉴定。二、实验数据阶段2：慢病毒的包装及测定用构建的慢病毒表达载体和包装质粒(packagingmix)共转染慢病毒包装细胞，包被病毒，收集病毒原液，超滤浓缩，并测定滴度。实验流程：抽提高纯度、无内毒素的过表达慢病毒载体及其辅助包装原件载体质粒，使用transgenereagent将构建好的过表达慢病毒载体及其辅助包装原件载体质粒共转染进慢病毒包装细胞，转染12h后加enhancingbuffer，接着4h后更换新鲜培养基，继续培养48h后，收集富含慢病毒颗粒的细胞上清液，对其浓缩后得到高滴度的慢病毒浓缩液。一、实验材料和方法1.细胞株慢病毒的包装细胞：贴壁依赖型成上皮样细胞，生长培养基为dmem(含10％fbs)。贴壁细胞经培养生长增殖形成单层细胞。2.菌株大肠杆菌菌株dh5α。用于扩增慢病毒载体和辅助包装载体质粒。3.慢病毒包装系统将构建成功的慢病毒重组质粒和包装质粒采用qiagen公司的质粒抽提试剂盒提取。所得的质粒dna溶于无菌的te中，以紫外光吸收法测定其浓度及纯度，保证所提质粒dna的a260/a280在1.8～2.0之间。4.试剂试剂名称试剂来源台盼兰上海生工生物工程有限公司胎牛血清gibcodmsosigmadmemgibco胰酶gibcopolyethylenimine,liner,mw-25000cat#239665.仪器仪器名称仪器来源荧光显微镜奥林巴斯co2培养箱thermo生物安全柜thermo离心超滤装置millipore(二)方法1.慢病毒包装1)细胞分盘转染前一天，将已经长好的细胞以合适的比例传代到10cm培养皿中，当细胞长到80％～90％时准备转染。2)转染前换液转染前1～2h将需要转染的细胞换新鲜的培养基，10ml/10cm皿。3)转染取无菌的1.5mlep管，转染体系按下表：混匀后，室温放置15min-20min后，均匀滴加到提前换过液的培养皿中，后置于co2培养箱中培养。4)加enhancingbuffer转染12h后，均匀滴加100×enhancingbuffer促进转染。5)换液转染18～20h后，小心吸掉细胞培养液弃于盛有消毒液的废液杯中，然后加15ml新鲜的细胞培养基(含2％血清的dmem)继续培养。6)病毒收集换液48h后，吸取细胞上清液于50ml离心管，4℃，4500g离心5min，上清液用0.45μm滤器过滤后转移到新的离心管中，最后将滤液分批转移到centrifugalfilterdevices中，4℃，4500g，离心10min，弃下层的液体于盛有消毒液的废液杯中，最后一次4℃，4500g，离心20min，此时可见滤器上层中的液体即为病毒浓缩液。7)病毒分装与保存将病毒以50μl分装，保存于-80℃。2.滴度测定1)rt-pcr分析整合的拷贝数病毒检测分别取0.1μl质粒标准品和待测样品基因组dna，另留1个孔加入无菌水做为无模板对照(no-templatecontrol)。每个样品重复1次。基因组检测分别取0.1μl基因组标准品和待测样品基因组dna，另留1个孔加入无菌水做为无模板对照(no-templatecontrol)。每个样品重复1次。rt-pcr循环条件设定为：95℃5min，然后是95℃15s，60℃1min的40个循环。2)数据分析测得的dna样品中整合的慢病毒载体拷贝数用基因组数加以标定，得到每基因组整合的病毒拷贝数。滴度(integrationunitsperml，iuml-1)的计算公式如下：iuml-1＝(c×n×d×1000)/v。其中：c＝平均每基因组整合的病毒拷贝数；n＝感染时细胞的数目；d＝病毒载体的稀释倍数＝10；v＝加入的稀释病毒的体积数(0.5μl，5μl，50μl和100μl)。滴度跨度为:107-109。二、实验数据sv40基因过表达慢病毒滴度测定结果为：tuml-1＝(8.83×1.9*105×10×1000)/50＝3.3554*108阶段3：稳转株构建rt-pcr验证其表达效果1.过表达稳转株的构建将经鉴定的纯化的原代特络细胞分为3组：原代特络细胞组(细胞不转染)、nc组(空载体lenti转染对照组)和特络细胞系组(重组慢病毒表达载体lenti-sv40转染组)。以合适的比例(聚合度约为30％左右)接种靶细胞于6孔板中。24小时后，感染前，病毒原液从-80℃冰箱取出后冰浴融化，用含感染增强剂8μg/mlpolybrene的新鲜培养基稀释病毒原液，吸除6孔板里旧培养基，加含有慢病毒稀释液到靶细胞中，6小时后换液。此慢病毒载体带有puromycin抗性，向细胞中加入2μg/mlpuromycin，37℃，5％co2，常规培养24h，用以筛选稳转株。第四天，细胞聚合度约为80％-90％时，传到培养瓶中。第五天，感染效率检测：收稳转株后，通过rt-qpcr验证感染效率。2.目的片段的扩增及验证(1)使用qiagen公司的rna提取试剂盒并参照试剂盒操作规程提取各组细胞中的rna。首先以oligo六聚体为逆转录引物，提取各组细胞中的总rna为模板，在反转录酶催化下反转录出cdna。体系为：rna模板500ng,5×缓冲液2μl,primerscriptrtenzymemixi0.5μl,10μmol/l50μmoligo六聚体0.5μl,100μmrandom6mers0.5μl,depc水补足10μl。37℃15min。(2)以合成的cdna为模版，sv40大t抗原基因上下游引物进行pcr扩增，引物序列为sv40-f:aacctatggaactgatgaatg；sv40-r:ggaggagtagaatgttgaga。扩增后产物电泳观察结果，重组慢病毒表达载体lenti-sv40转染组2154bp处出现条带(图6)，初步确定为sv40大t抗原基因的扩增产物，其他两组未出现条带。实施例3本发明的使用方法1、无菌操作。操作时用的培养液可加适量的青链霉素。实验进行前，无菌室及无菌操作台以紫外灯照射30-60分钟灭菌，以70％ethanol擦拭无菌操作抬面，并开启无菌操作台风扇运转10分钟后，才开始实验操作。每次操作只处理一株细胞株，且即使培养基相同也不可使用同一瓶培养基，以避免失误混淆或细胞间污染。实验完毕后，将实验物品带出工作台，以70％ethanol擦拭无菌操作抬面。工作人员应注意自身安全，实验时须穿戴实验衣及手套。2、本细胞系使用含有10％fbs的dmem+f12培养基进行培养，待细胞长至85％-90％密度时传代，传代时细胞用含有edta的胰酶进行消化，1：2传代。实施例41、永生化：①用cell-iq细胞实时成像系统观察和记录了纯化后的原代特络细胞贴壁后24h至一周的生长情况。如图7所示，cell-iq细胞实时成像系统观察和记录了纯化原代特络细胞贴壁后24h至96h的生长情况。a.纯化原代特络细胞贴壁后24h；b.纯化原代特络细胞贴壁后36h，部分细胞发生分裂，并运动(↑)；c、d.纯化原代特络细胞贴壁后48h和72h，部分细胞死亡e.纯化原代特络细胞贴壁后7天，细胞全部死亡。②对第2代、第10代、第20代、第30代以及第50代永生化特络细胞贴壁后24h至96h的生长情况也进行了观察和记录。如图8所示，cell-iq细胞实时成像系统观察和记录了特络细胞系贴壁后24h至96h的生长情况。a-e.特络细胞系第2代贴壁后24h，36h，48h，72h，96h；f-j.特络细胞系第5代贴壁后24h，36h，48h，72h，96h；k-o.特络细胞系第10代贴壁后24h，36h，48h，72h，96h；p-t.特络细胞系第30代贴壁后24h，36h，48h，72h，96h；u-y.特络细胞系第50代贴壁后24h，36h，48h，72h，96h。2、稳定性①光镜观察第3代、第10代、第30代和第50代特络细胞系特征性结构telopode,并进行拍照记录。如图9所示，光镜观察特络细胞特征性结构telopode，a-d分别为第3代、第10代、第30代和第50代特络细胞系光镜下的形态和特征性结构telopode(↑)。②用免疫荧光法在激光共聚焦显微镜下观察特络细胞系第5代、第10代、第30代和第50代细胞的相关免疫标记物vimentin和cd34的表达并进行拍照。如图10所示，免疫荧光法在激光共聚焦显微镜下鉴定第3代、第10代、第30代和第50代特络细胞系的相关免疫标记物vimentin和cd34的表达。a-d.特络细胞系第5代细胞vimentin和cd34的表达；e-h.特络细胞系第10代细胞vimentin和cd34的表达；i-l.特络细胞系第30代细胞vimentin和cd34的表达；m-p.特络细胞系第50代细胞vimentin和cd34的表达。a、e、i、m.dapi(蓝色)标记细胞核；b、f、j、n.fitc(绿色)标记显示了cd34-的表达；c、g、k、o.keyfluor594(红色)标记显示了vimentin的表达；d、h、l、p.dapi(蓝色)标记细胞核，fitc(绿色)标记显示cd34-的表达，keyfluor594(红色)标记显示了vimentin的表达。③用免疫电镜鉴定特络细胞系第5代、第10代、第30代和第50代细胞的相关免疫标记物vimentin、cd34、pdgf和ckit的表达。如图11所示，免疫标志物和对应的免疫胶体金颗粒大小分别为vimentin-10nm；cd34-18nm；pdgf-25nm；ckit-40nm。a、b.特络细胞系第5代细胞vimentin、cd34-、pdgf和ckit的表达；c、d.特络细胞系第10代细胞vimentin、cd34-、pdgf和ckit的表达；e、f.特络细胞系第30代细胞vimentin、cd34-、pdgf和ckit的表达；g、h.特络细胞系第50代细胞vimentin、cd34-、pdgf和ckit的表达。3、比较特络细胞系和特络细胞-sv40细胞系的细胞周期。特络细胞-sv40细胞系sub-g1期明显降低，表明其凋亡率降低，s期和g2期明显升高，说明其可能通过加速s期和g2期进程导致细胞增殖增加。以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本
技术领域：
的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。sequencelisting<110>复旦大学附属中山医院<120>一种永生化特络细胞系及其构建方法<130>/<160>4<170>patentinversion3.3<210>1<211>38<212>dna<213>人工序列<400>1ccggaattcatggataaagttttaaacagagaggaatc38<210>2<211>32<212>dna<213>人工序列<400>2gctctagattacaagtcctcttcagaaatgag32<210>3<211>21<212>dna<213>人工序列<400>3aacctatggaactgatgaatg21<210>4<211>20<212>dna<213>人工序列<400>4ggaggagtagaatgttgaga20当前第1页12