本发明属于生物化工技术领域，具体涉及一种重组大肠杆菌发酵产物中l-哌啶酸的萃取分离方法。
背景技术：
哌啶酸(pipecolicacid，简称pa)是一种重要的刚性环状非蛋白质氨基酸，它既可以限定多肽的构象，还可作为不同化合物合成库中的多功能骨架，所以广泛用于许多手性药物和生物活性物质的制备。如，新一代局麻药罗哌卡因(ropivacaine)、抗精神病药物硫利哒嗪(thioridazine)、免疫抑制剂雷帕霉素(rapamycin)以及抗肿瘤抗生素山卓霉素(sandramycin)等均是以哌啶酸或其衍生物为主要原料制得的。
由于哌啶酸及其衍生物具有的生物活性和广泛的应用前景，其合成已引起众多国外研究者的兴趣，并开发出许多合成的新方法和新技术。利用重组大肠杆菌生产手性l-哌啶酸是一种新型生产哌啶酸的方法，其具有产率高选择性高光学纯度高等优点。哌啶酸及其衍生物作为一类应用广泛的医药中间体，市场需求会越来越大。若将上述生物合成哌啶酸的方法转为工业生产，l-哌啶酸分离提纯技术也很重要。随着合成技术、生物技术及药学研究的不断发展，可以预期哌啶酸及其衍生物必定具有更为广泛的应用前景。
申请号为201510268919.3的专利公布了一种l-哌啶甲酸的分离方法，将含l-哌啶甲酸的待分离液通过催化树脂，树脂吸附饱和后，以碱性溶液作为洗脱剂对树脂进行洗脱，收集洗脱液，将洗脱液结晶、干燥得到l-哌啶甲酸；该方案成本较高，得到的l-哌啶甲酸产品纯度最高为98.2％，不能达到100％。
申请号为201510475733.5的专利公布了一种改进的l-哌啶甲酸的分离方法，将含l-哌啶甲酸的待分离液通过催化树脂，树脂吸附饱和后，以酸性溶液作为洗脱剂对树脂进行洗脱，收集洗脱液，将洗脱液结晶、干燥得到l-哌啶甲酸。该方法较上一专利改变了洗脱剂为酸性溶液，其以盐酸洗脱方便树脂的再生，节约生产成本，但产品纯度还是不能达到100％。
目前，有关l-哌啶酸萃取分离的相关文献资料等鲜有报道，因此开发一种专一性强，残留杂质少的萃取分离重组大肠杆菌发酵产物l-哌啶酸的方法在工业生产中具有重要意义。
技术实现要素：
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种重组大肠杆菌发酵产物中l-哌啶酸的萃取分离方法，用三辛胺-正辛醇-三磷酸丁酯作为反应萃取体系，解决了l-哌啶酸在水溶液中溶解度大，不易提纯分离的难题；该方法专一性强，残留杂质少。
为实现上述目的，本发明的技术方案为：
重组大肠杆菌发酵产物中l-哌啶酸的萃取分离方法，包括以下步骤：
1)待分离样品处理：取发酵原液，加入吸附剂充分混匀后加热搅拌，再经滤纸、硅藻土和滤膜过滤，得澄清溶液；
2)反应萃取：取步骤1)所述的澄清溶液调节ph值至7～10，用三辛胺-正辛醇-三磷酸丁酯的反应萃取体系溶液与澄清溶液混合后搅拌萃取；
3)反萃取：将步骤2)中搅拌萃取后的溶液进行离心操作，取上清液，在上清液中加入等体积的水介质混匀后搅拌，搅拌结束后，取下层水相，得l-哌啶酸水溶液。
进一步，步骤1)所述发酵原液中哌啶甲酸浓度为10～60g/l，ph值为2～10；所述发酵原液中含有锌、钾、钠、铵、铁、铜、镁等多种阳离子，含有磷酸根、硫酸根、氯离子等多种阴离子，还含有少量葡萄糖、赖氨酸、柠檬酸等有机成分。
所述重组大肠杆菌生产l-哌啶酸的方法为：将所述重组大肠杆菌按1～10％接种于5l发酵罐中，以葡萄糖或l-赖氨酸盐酸盐或l-赖氨酸为底物，先有氧积累菌体量，再微氧进行发酵的双阶段培养方式发酵。
一种具体的实施方式，生产l-哌啶酸的方法为：所述双阶段的第一阶段有氧积累菌体量：将种子液按1～20％接种发酵液中，发酵8h～15h后，以1～5g/l/h的流速添加葡萄糖或l-赖氨酸或l-赖氨酸盐酸盐；第二阶段微氧发酵生产l-哌啶甲酸：待od达到最大值后，降低转速和减小通气量，使罐内处于微氧或无氧状态，发酵过程中检测葡萄糖浓度低至10g/l时，补加葡萄糖使其浓度保持10g/l。种子培养基为lb培养基，和/或发酵培养基为加葡萄糖的无机盐培养基，初始葡萄糖浓度为40g/l，另加无机盐k2hpo4.3h2o7.5g/l，mgso4.7h2o2g/l，(nh4)2so41.6g/l，柠檬酸2g/l，mnso4·h2o0.0045g/l，feso4·7h2o0.0756g/l，na2so40.02g/l，zn2so40.0064g/l，cocl2·6h2o0.004g/l，cuso4.5h2o0.0006g/l。
由上述生产l-哌啶酸的方法可以看出重组大肠杆菌发酵产物中成分复杂，本发明的萃取分离方法，用三辛胺-正辛醇-三磷酸丁酯作为反应萃取体系，只特异性地萃取l-哌啶酸，而将发酵液中的杂质去除，具有专一性强，残留杂质少的优点，解决了重组大肠杆菌发酵产物中l-哌啶酸分离的难题。
作为一种优选，所述吸附剂为活性炭。活性炭为木质粉状活性炭，用于吸附色素。所述活性炭占发酵原液的质量百分比为2～4％。
进一步，步骤1)中加热搅拌的速率为1000～2000r/min，加热温度为45～75℃，加热搅拌时间为1～1.5h。
进一步，步骤1)中滤膜过滤为至少一次0.2～0.8μm滤膜过滤。
作为一种优选，步骤1)中滤膜过滤的最后一次为0.22μm或0.45μm的滤膜过滤。
作为一种优选，步骤1)中滤膜过滤为依次经0.8μm滤膜、0.45滤膜过滤。
作为一种优选，步骤1)中滤膜过滤为依次经0.8μm滤膜、0.6μm和0.2μm滤膜过滤。
进一步，步骤2)所述反应萃取体系溶液与所述澄清溶液的体积比为1：1～1：2；步骤2)中搅拌速率为100～300r/min，搅拌时间为20～60min。
作为一种优选，步骤2)中用0.05～0.5mol/l氢氧化钠溶液来调节ph值。
进一步，步骤2)所述反应萃取体系溶液中的三辛胺、正辛醇和三磷酸丁酯的摩尔比为1：1：1～1：3：2。其中三辛胺为阴离子萃取剂，正辛醇为助萃剂，三磷酸丁酯为阳离子萃取剂。此比例范围内的反应萃取体系得到的l-哌啶酸纯度高。
反应萃取体系溶液的设计基于反应萃取法原理：
有lewis碱a(这里为阴离子萃取剂)和lewis酸b(这里为阳离子萃取剂)，将a、b两种物质加入某种氨基酸水溶液中，则可能存在以下反应平衡：
若第二项反应更容易进行，则易将氨基酸以与萃取剂结合的形式拉进有机相中，成为萃取的推动力，达到萃取氨基酸的动力。
进一步，步骤3)所述离心操作的操作条件为：2500～4000r/min，15～25℃，5～10min；步骤3)中搅拌速率为100～300r/min，搅拌时间为20～60min。
进一步，所述的萃取分离方法还包括步骤：
4)溶析结晶：将步骤3)所述l-哌啶酸水溶液调节ph值至6.0-6.5，加入有机溶剂进行溶析，析出针状晶体l-哌啶酸。
进一步，步骤4)中用0.5mol/l稀盐酸调节ph值至6.0-6.5；所述有机溶剂包括丙酮。
具体的一种重组大肠杆菌发酵产物中l-哌啶酸的萃取分离方法，包括以下步骤：
1)待分离样品处理：将发酵液按照质量分数2～4％加入活性炭将发酵液与活性炭的混合液加热搅拌约1～1.5小时，温度为45～75℃，转速为1000～2000r/min；脱色结束后过滤纸、硅藻土、0.8μm滤膜以及0.45μm或0.6μm滤膜得到澄清溶液；
2)反应萃取：取处理后的发酵液，用0.05～0.5mol/l氢氧化钠溶液调节ph值至7～10；配制摩尔比为1：1：1～1：3：1的三辛胺-正辛醇-三磷酸丁酯的反应萃取体系溶液，取反应萃取体系溶液与处理后的发酵液以体积比1：1～1：2混合，并搅拌20～60min，搅拌速率100～300r/min；
3)反萃取：取步骤2)中萃取后的溶液进行离心操作，操作条件2500～4000r/min，15～25℃，5～10min；发现水相与有机相间存有白色乳絮状物，取上层有机相；在上清液中加入等体积的去离子水，混匀后搅拌20～60min，搅拌速率100～300r/min，搅拌结束后，取下层水相；
4)溶析结晶：用0.5mol/l稀盐酸调节ph值至6.0-6.5，加入如丙酮等溶析剂，进行溶析操作，析出针状晶体l-哌啶酸。
本发明的目的之二在于提供一种萃取分离重组大肠杆菌发酵产物中l-哌啶酸的萃取体系，所述萃取体系由三辛胺、三磷酸丁酯和正辛醇组成；三辛胺、正辛醇和三磷酸丁酯的摩尔比为1：1：1～1：3：2。用三辛胺-正辛醇-三磷酸丁酯作为反应萃取体系，解决了l-哌啶酸在水溶液中溶解度大，不易提纯分离的难题。
本发明的有益效果在于：
1)本发明为从重组大肠杆菌发酵产物中萃取分离的l-哌啶酸，光学纯度为100％。
2)本发明创新性的使用了离子交换反应萃取的方法，用三辛胺-正辛醇-三磷酸丁酯作为反应萃取体系，解决了l-哌啶酸在水溶液中溶解度大，不易提纯分离的难题。
3)本发明采用的方法具有专一性强，残留杂质少的优点，此方法只特异性地萃取l-哌啶酸，而将发酵液中的杂质去除，在萃取的同时去除了杂质，节省了工艺步骤，提高了反应效率。
4)本发明采用的试剂具有成本低，用量少的优点，且可以回收利用，在工业生产中，具有较大的利用价值。
附图说明
图1为l-哌啶酸反应萃取流程图。
具体实施方式
以下将参照附图，对本发明的优选实施例进行详细描述。优选实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，所举实施例是为了更好地对本发明的内容进行说明，但并不是本发明的内容仅限于所举实施例。所以熟悉本领域的技术人员根据上述发明内容对实施方案进行非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。
待分离样品：待分离样品为由重组大肠杆菌进行摇瓶发酵制备l-哌啶酸的发酵原液，所述发酵原液中哌啶甲酸浓度为10～60g/l，ph值为2～10；发酵原液中含有锌、钾、钠、铵、铁、铜、镁等多种阳离子，含有磷酸根、硫酸根、氯离子等多种阴离子，还含有少量葡萄糖、赖氨酸、柠檬酸等有机成分。
实施例1萃取体系
萃取体系由三辛胺、三磷酸丁酯和正辛醇组成；三辛胺、正辛醇和三磷酸丁酯的摩尔比为4：6：5。
实施例2萃取体系
萃取体系由三辛胺、三磷酸丁酯和正辛醇组成；三辛胺、正辛醇和三磷酸丁酯的摩尔比为4：8：7。
实施例3萃取体系
萃取体系由三辛胺、三磷酸丁酯和正辛醇组成；三辛胺、正辛醇和三磷酸丁酯的摩尔比为1：3：2。
实施例4重组大肠杆菌发酵产物中l-哌啶酸的萃取分离方法
1)样品来源：由重组大肠杆菌进行摇瓶发酵制备l-哌啶酸的发酵原液。
2)样品处理：将发酵液按照质量分数4％加入活性炭(活性炭为木质粉状活性炭，用于吸附色素)将发酵液与活性炭的混合液加热搅拌1小时，温度为75℃，转速为1400r/min。脱色结束后过滤纸、硅藻土、0.8μm滤膜以及0.45μm滤膜得到澄清溶液。
3)l-哌啶酸的反应萃取：取上述澄清溶液20ml，用0.5mol/l氢氧化钠溶液调节ph值至8左右，用ph试纸比色。配制体积比为4：6：5的三辛胺-正辛醇-三磷酸丁酯的反应萃取体系，混合均匀后，取反应萃取体系溶液20ml与上述澄清溶液混合，并搅拌30min，搅拌速率200r/min。
4)反萃取：取上述处理后溶液进行离心操作，操作条件4000r/min，15℃，8min。发现水相与有机相间存有白色乳絮状物，取上层清液。在上清液中加入去离子水约20ml，混匀后搅拌30min，搅拌速率200r/min，搅拌结束后，取下层清液。
5)溶析结晶：取上述清液测定ph值，发现其值接近哌啶酸等电点，用0.5mol/l稀盐酸调节ph值至6.21，加入溶析剂，进行溶析操作，析出针状晶体l-哌啶酸，光学纯度为100％。
实施例5重组大肠杆菌发酵产物中l-哌啶酸的萃取分离方法
1)样品来源：由重组大肠杆菌进行摇瓶发酵制备l-哌啶酸的发酵原液。
2)样品处理：将发酵液按照质量分数4％加入活性炭(活性炭为木质粉状活性炭，用于吸附色素)将发酵液与活性炭的混合液加热搅拌1小时，温度为55℃，转速为1400r/min。脱色结束后过滤纸、硅藻土、0.8μm滤膜以及0.6μm滤膜得到澄清溶液。
3)l-哌啶酸的反应萃取：取上述澄清溶液20ml，用0.5mol/l氢氧化钠溶液调节ph值至4左右，用ph试纸比色。配制体积比为4：8：7的三辛胺-正辛醇-三磷酸丁酯的反应萃取体系，混合均匀后，取反应萃取体系溶液20ml与上述澄清溶液混合，并搅拌30min，搅拌速率200r/min。
4)反萃取：取上述处理后溶液进行离心操作，操作条件4000r/min，20℃，8min。发现水相与有机相间存有白色乳絮状物，取上层清液。在上清液中加入去离子水约20ml，混匀后搅拌30min，搅拌速率200r/min，搅拌结束后，取下层清液。
5)溶析结晶：取上述清液测定ph值，发现其值接近哌啶酸等电点，用0.5mol/l稀盐酸调节ph值至6.21，加入溶析剂，进行溶析操作，析出针状晶体l-哌啶酸，光学纯度为100％。
实施例6重组大肠杆菌发酵产物中l-哌啶酸的萃取分离方法
1)样品来源：由重组大肠杆菌进行摇瓶发酵制备l-哌啶酸的发酵原液。
2)样品处理：将发酵液按照质量分数4％加入活性炭(活性炭为木质粉状活性炭，用于吸附色素)将发酵液与活性炭的混合液加热搅拌1小时，温度为45℃，转速为1400r/min。脱色结束后过滤纸、硅藻土、0.8μm滤膜以及0.45μm滤膜得到澄清溶液。
3)l-哌啶酸的反应萃取：取上述澄清溶液20ml，用0.5mol/l氢氧化钠溶液调节ph值至8左右，用ph试纸比色。配制体积比为1：3：2的三辛胺-正辛醇-三磷酸丁酯的反应萃取体系，混合均匀后，取反应萃取体系溶液20ml与上述澄清溶液混合，并搅拌30min，搅拌速率200r/min。
4)反萃取：取上述处理后溶液进行离心操作，操作条件4000r/min，25℃，8min。发现水相与有机相间存有白色乳絮状物，取上层清液。在上清液中加入去离子水约20ml，混匀后搅拌30min，搅拌速率200r/min，搅拌结束后，取下层清液。
5)溶析结晶：取上述清液测定ph值，发现其值接近哌啶酸等电点，用0.5mol/l稀盐酸调节ph值至6.21，加入溶析剂，进行溶析操作，析出针状晶体l-哌啶酸，光学纯度为100％。
对比实施例1
萃取体系：三辛胺、正辛醇和三磷酸丁酯的摩尔比为1：0.8：1。
配置上述比例的萃取体系，其他萃取分离条件与实施6相同来进行重组大肠杆菌发酵产物中l-哌啶酸的萃取分离，结果仅析出少量针状晶体l-哌啶酸，且光学纯度为93.8％。
对比实施例2
萃取体系：三辛胺、正辛醇和三磷酸丁酯的摩尔比为1：2：5。
配置上述比例的萃取体系，其他萃取分离条件与实施6相同来进行重组大肠杆菌发酵产物中l-哌啶酸的萃取分离，结果仅析出少量针状晶体l-哌啶酸，且光学纯度为89.4％。
最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。