本发明属于医药生物技术领域，具体涉及一种猪源抗菌肽的提取方法。
背景技术：
抗菌肽是生物体产生的一种具有强抗菌作用的活性多肽，是生物先天免疫的重要组成成分。迄今为止，已在许多生物包括动物、植物及原核生物中发现多种内源性抗菌活性肽。猪源抗菌肽是从猪体内分离得到的抗菌肽。
由于抗菌肽具有广谱杀菌作用、相对分子量较小、热稳定及水溶性好等优点，更为重要的是抗菌肽可作用于原核细胞和发生病变的真核细胞且不易使病原微生物产生耐药的特点；因此，在当前人类滥用抗生素所带来的全球耐药性的严峻问题下，对于了解猪体内自然产生的抗菌肽的功能，以及设计一种方法来制备猪源抗菌肽以求替代抗生素的研究，便显得极为重要，这势必将对寻找抗生素替代品的研究与应用起到积极的促进作用。
现有技术在粗提猪源抗菌肽组织捣碎的过程中，因含有较大组织块，匀浆捣碎时，会对机器造成较大损伤，并且会降低原料使用率；当组织捣碎不够充分时，会影响反复冻融时细胞破碎的程度，最终影响抗菌肽的提取。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种提高原料的使用率，降低组织捣碎过程对仪器的损耗，同时使反复冻融时细胞破碎更加充分的猪源抗菌肽的提取方法。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种猪源抗菌肽的提取方法，包括以下步骤：
1)取新鲜或解冻的猪小肠，去除猪小肠表面的筋膜、脂肪组织和小肠内容物，用注射用水冲洗干净，然后将猪小肠在80-100℃的水中热处理15-25s，迅速冷却后用绞肉机绞碎，接着用胶体磨匀浆3次，得到猪小肠匀浆液；
2）将上述匀浆液与注射用水按照质量比100∶90-99混合均匀，然后将混合均匀后的匀浆液分装于无热源的容器中并置于冻库中冷冻，待冷冻完全后取出，再置于室温流水中解冻，如此反复冻融5-6次；
3）将反复冻融后的匀浆液与乙酸（分析纯）按照质量比100∶1-10混合均匀，于4℃搅拌12小时后得到混合液，将混合液沸水浴8-15min，然后将混合液置于冰水中迅速冷却，离心，分别收集沉淀物和一次上清液，将一次上清液于4℃保存；
4）将上述沉淀物与浓度2.87%乙酸溶液按照质量比1∶0.8-1混合均匀，于4℃搅拌12小时得到浸提液，将浸提液在温度-10℃以下，冷冻2-4小时后（待浸提液表层出现冰渣，停止冷冻）离心，收集二次上清液体；
5）合并一次上清液和二次上清液，将合并后的上清液依次经过0.22μm-0.45μm和5kd-10kd滤膜进行切向流过滤，收集滤膜透过液，得到超滤液；调节超滤液ph值至3.0-6.5之间，再经0.1μm-0.22μm除菌滤器过滤，得到猪源抗菌肽。
进一步，所述步骤2），匀浆液与注射用水的质量比为100∶97.13。
进一步，所述步骤3），反复冻融后的匀浆液与乙酸的质量比为100∶2.87。
进一步，所述步骤3），混合液在搅拌条件下进行沸水浴。
进一步，所述步骤3），冷却后的混合液于4℃、6000-7500r/min离心20-30min。
进一步，所述步骤4），沉淀物与2.87%乙酸溶液的质量比为1∶1。
进一步，所述步骤4），冷冻后的浸提液于4℃、6000-7500r/min离心20-30min。
本发明采用以上技术方案，在猪小肠冷却绞碎前，增加一个热处理步骤，即前期处理后的小肠在温度为80-100℃热水中处理15-25s，再迅速冷却，随后剪碎，捣碎，该方法可以使猪小肠在绞肉机及胶体磨中匀浆时，猪小肠碾磨的比未热处理的更细，几乎不会有大颗粒的组织存在，不仅提高原料的使用率，而且能够减少对仪器的损伤。同时，由于不存在大颗粒的组织块，随后进行的反复冻融过程，能够更加充分的破碎细胞，释放更多的猪源抗菌肽。
本发明所述步骤3），混合液在沸水浴过程中，搅拌机应不断搅拌以保证受热均匀)，反复冻融后的匀浆液与乙酸按照质量比100∶1-10混合均匀，优选为1∶2.87%，2.87%的乙酸溶液提取多肽类物质含量不仅与5%乙酸溶液提取的差异不明显，而且2.87%的乙酸溶液提取的抗菌肽溶液渗透压是5%乙酸溶液提取的一半，避免出现渗透压过高的现象。
具体实施方式
一种猪源抗菌肽的提取方法，包括以下步骤：
1)取新鲜或解冻的猪小肠，去除猪小肠表面的筋膜、脂肪组织和小肠内容物，用水冲洗干净，然后将猪小肠在80-100℃的水中热处理15-25s，迅速冷却后用绞肉机绞碎，接着用胶体磨匀浆3次，得到猪小肠匀浆液；
2）将上述匀浆液与注射用水按照质量比100∶90-99混合均匀，然后将混合均匀后的匀浆液分装至无热源的容器中并置于冻库中冷冻，待冷冻完全后取出，再置于室温流水中解冻，如此反复冻融5-6次；
3）将反复冻融后的匀浆液与乙酸（分析纯）按照质量比100∶1-10混合均匀，于4℃搅拌12小时后得到混合液，将混合液在搅拌条件下沸水浴8-15min，然后将混合液置于冰水中迅速冷却，于4℃、6000-7500r/min离心20-30min，分别收集沉淀物和一次上清液，将一次上清液于4℃保存；
4）将上述沉淀物与浓度2.87%乙酸溶液按照质量比1∶0.8-1混合均匀，于4℃搅拌12小时后得到浸提液，将浸提液在温度-10℃以下，冷冻2-4小时后（待浸提液表层出现冰渣，停止冷冻）于4℃、6000-7500r/min离心20-30min，收集二次上清液体；
5）合并一次上清液和二次上清液，将合并后的上清液依次经过0.22μm-0.45μm和5kd-10kd滤膜进行切向流过滤，收集滤膜透过液，得到超滤液；调节超滤液ph值至3.0-7.0之间，再经0.1μm-0.22μm除菌滤器过滤，得到猪源抗菌肽。
实施例1
一种猪源抗菌肽的提取方法，包括以下步骤：
1)取新鲜或解冻的猪小肠，去除猪小肠表面的筋膜、脂肪组织和小肠内容物，用水冲洗干净，然后将猪小肠在90℃的水中热处理20s，迅速冷却后用绞肉机绞碎，接着用胶体磨匀浆3次，得到猪小肠匀浆液；
2）将上述匀浆液与注射用水按照质量比100∶97.13混合均匀，然后将混合均匀后的匀浆液分装于无热源的容器中并置于冻库中冷冻，待冷冻完全后取出，再置于室温流水中解冻，如此反复冻融6次；
3）将反复冻融后的匀浆液与乙酸（分析纯）按照质量比100∶2.87混合均匀，于4℃搅拌12小时后得到混合液，将混合液在搅拌条件下沸水浴10min，然后将混合液置于冰水中迅速冷却，于4℃、7000r/min离心25min，分别收集沉淀物和一次上清液，将一次上清液于4℃保存；
4）将上述沉淀物与浓度2.87%乙酸溶液按照质量比1∶1混合均匀，于4℃搅拌12小时后得到浸提液，将浸提液在温度-10℃下，冷冻3小时后（待浸提液表层出现冰渣，停止冷冻）于4℃、7000r/min离心25min，收集二次上清液体；
5）合并一次上清液和二次上清液，将合并后的上清液依次经过0.22μm和10kd滤膜进行切向流过滤，收集滤膜透过液，得到超滤液；调节超滤液ph值至4.5，再经0.1μm除菌滤器过滤，得到猪源抗菌肽。
实施例2
一种猪源抗菌肽的提取方法，包括以下步骤：
1)取新鲜或解冻的猪小肠，去除猪小肠表面的筋膜、脂肪组织和小肠内容物，用水冲洗干净，然后将猪小肠在80℃的水中热处理25s，迅速冷却后用绞肉机绞碎，接着用胶体磨匀浆3次，得到猪小肠匀浆液；
2）将上述匀浆液与注射用水按照质量比100∶90混合均匀，然后将混合均匀后的匀浆液分装于无热源的容器中并置于冻库中冷冻，待冷冻完全后取出，再置于室温流水中解冻，如此反复冻融6次；
3）将反复冻融后的匀浆液与乙酸（分析纯）按照质量比100∶10混合均匀，于4℃搅拌12小时后得到混合液，将混合液在搅拌条件下沸水浴8min，然后将混合液置于冰水中迅速冷却，于4℃、6000r/min离心30min，分别收集沉淀物和一次上清液，将一次上清液于4℃保存；
4）将上述沉淀物与浓度2.87%乙酸溶液按照质量比1∶0.8混合均匀，于4℃搅拌12小时得到浸提液，将浸提液在-24℃条件下，冷冻2小时后（待浸提液表层出现冰渣，停止冷冻）于4℃、6000r/min离心30min，收集二次上清液体；
5）合并一次上清液和二次上清液，将合并后的上清液依次经过0.45μm和5kd滤膜进行切向流过滤，收集滤膜透过液，得到超滤液；调节超滤液ph值至3.0，再经0.1μm除菌滤器过滤，得到猪源抗菌肽。
实施例3
一种猪源抗菌肽的提取方法，包括以下步骤：
1)取新鲜或解冻的猪小肠，去除猪小肠表面的筋膜、脂肪组织和小肠内容物，用水冲洗干净，然后将猪小肠在100℃的水中热处理15s，迅速冷却后用绞肉机绞碎，接着用胶体磨匀浆3次，得到猪小肠匀浆液；
2）将上述匀浆液与注射用水按照质量比100∶99混合均匀，然后将混合均匀后的匀浆液分装于无热源的容器中并置于冻库中冷冻，待冷冻完全后取出，再置于室温流水中解冻，如此反复冻融5次；
3）将反复冻融后的匀浆液与乙酸（分析纯）按照质量比100∶1混合均匀，于4℃搅拌12小时后得到混合液，将混合液在搅拌条件下沸水浴15min，然后将混合液置于冰水中迅速冷却，于4℃、7500r/min离心20min，分别收集沉淀物和一次上清液，将一次上清液于4℃保存；
4）将上述沉淀物与浓度2.87%乙酸溶液按照质量比1∶1混合均匀，于4℃搅拌12小时后得到浸提液，将浸提液在温度-10℃下，冷冻4小时后（待浸提液表层出现冰渣，停止冷冻）于4℃、7500r/min离心20min，收集二次上清液体；
5）合并一次上清液和二次上清液，将合并后的上清液依次经过0.3μm和7kd滤膜进行切向流过滤，收集滤膜透过液，得到超滤液；调节超滤液ph值至7.0，再经0.22μm除菌滤器过滤，得到猪源抗菌肽。