一种桔小实蝇抗菌肽及其制备方法和应用与流程

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种桔小实蝇抗菌肽及其制备方法，以及在生物医学、农学、食品学和化妆品技术领域的应用。

背景技术：

自从青霉素等抗生素被发现以来，对病原菌感染性疾病的防治产生了革命性飞跃。与此同时，人们也意识到病原微生物将最终会对青霉素等抗生素产生抗性，但是令人惊讶的是抗性产生的速度之快和抗性的广泛性。随着抗菌药物的广泛应用和滥用，在不到50年的时间内，原来容易被杀死的细菌开始有了耐药菌株及多重耐药菌株。

为了应对耐药菌感染，人们在不断研究和开发新型抗菌药物。近年来出现的抗菌肽就是一类具有巨大发展潜力的新型抗菌药物替代对象。昆虫抗菌肽是昆虫细胞特定基因编码产生的一类小分子多肽，大多数对细菌有较广谱的抗性，有的对真菌、病毒、原虫等也有抑制作用，尤其对耐药菌株有明显的杀伤作用，且不破坏真核生物体的细胞，无免疫原性。

桔小实蝇是蔬菜和水果上的重要害虫。每年该种昆虫造成的经济损失和防治费用都是相当惊人的，也是目前导致部分省份尤其是广东省的柑橘、枇杷等果树挂果时为害特别严重的害虫之一。桔小实蝇的成虫、幼虫及蛹生长在含有细菌的恶劣环境中，但其自身却不受这些病原菌影响，显示它具有较强的免疫能力。关于桔小实蝇抗菌活性物质的相关技术研究具有重大的意义，目前尚未见发表的相关技术报道。

本发明利用细菌针刺的方法，免疫诱导桔小实蝇蛹分泌抗菌活性物质，从桔小实蝇蛹分泌的抗菌活性物质中分离纯化得到桔小实蝇抗菌肽bactrocerin，本抗菌肽氨基酸全序列经蛋白数据库搜索比较未发现有任何相似的多肽。

技术实现要素：

本发明的一个目的是填补现有技术的不足，提供一种新的桔小实蝇抗菌肽(bactrocerin)；本发明的另一个目的是提供所述桔小实蝇抗菌肽的制备方法；本发明还有一个目的是提供所述桔小实蝇抗菌肽的应用。

本发明提供一种桔小实蝇抗菌肽，是从桔小实蝇蛹分离纯化得到的一种多肽，分子量为2.3道尔顿，等电点为11.43；所述抗菌肽的全序列为nh2-vgktwikvirgigkskikwq-cooh，氨基酸序列如seqidno：1所示，即颉氨酸-甘氨酸-赖氨酸-苏氨酸-色氨酸-异亮氨酸-赖氨酸-颉氨酸-异亮氨酸-精氨酸-甘氨酸-异亮氨酸-甘氨酸-赖氨酸-丝氨酸-赖氨酸-异亮氨酸-赖氨酸-色氨酸-谷氨酰胺。

本发明同时提供了所述桔小实蝇抗菌肽的制备方法：

方法一，本发明利用细菌针刺的方法，免疫诱导桔小实蝇蛹分泌抗菌活性物质，从桔小实蝇蛹分泌的抗菌活性物质中分离纯化得到桔小实蝇抗菌肽bactrocerin，本抗菌肽氨基酸全序列经蛋白数据库搜索比较未发现有任何相似的多肽。

方法一包括以下步骤：

(1)用混合菌液免疫诱导桔小实蝇蛹；

(2)桔小实蝇蛹组织匀浆，得到粗提物；

(3)粗提物经纯化后得到所述抗菌肽。

步骤(1)所述用混合菌液免疫诱导桔小实蝇蛹的方法为采用1号昆虫针蘸取生理盐水重悬的混合菌液针刺桔小实蝇蛹的中部；所述生理盐水为含150mmnacl和5mmkcl；所述混合菌液是od600为0.3的金黄色葡萄球菌(staphylococcusaureus)和大肠杆菌dh5α(escherichiacolidh5α)混合液。步骤(2)所述粗提方法是称取一定量的经混合菌液诱导后的桔小实蝇蛹，按重量体积比为1∶4～1∶6的比例加入相应体积的提取缓冲液，冰浴上充分研磨，离心去除血细胞和其它组织沉淀，取上清。

所述提取缓冲液为50mmol/l醋酸铵中加入终浓度为1.5μmol/l的蛋白酶抑制剂aprotinin和终浓度为20μmol/l苯基硫脲；所述离心条件是在温度为4℃、10,000×g下离心30至35分钟。

步骤(3)所述纯化方法为经离子交换柱层析、反相快速蛋白液相色谱和反相高压液相色谱纯化。

所述离子交换柱层析的方法是将桔小实蝇蛹组织匀浆的粗提物上样于50mmol/l醋酸铵ph5.0缓冲液平衡的cmsepharosefastflow弱阳离子交换柱，交换柱长260mm，直径16mm，用50mmol/l～1mol/l线性梯度的醋酸铵ph5.0缓冲液洗脱，收集第iii峰；

所述反相快速蛋白液相色谱是将离子交换柱层析得到的活性组分峰(第iii峰)上样于2％乙腈-0.05％三氟乙酸水溶液平衡的resourcerpc3ml反相柱，柱长100mm，直径6.4mm，以含0.05％三氟乙酸的乙腈缓冲液从2％～80％线性梯度洗脱60分钟，收集29～36分钟之间的组分，每1.5分钟1个组分，共收集得到a，b，c和d4个组分；

所述反相高压液相色谱是将反相快速蛋白液相色谱得到的活性最高组分峰(b峰)上样于18％乙腈-0.05％三氟乙酸水溶液平衡的hypersilods反相柱，柱长250mm，直径4mm，以含0.05％三氟乙酸的乙腈缓冲液从18％～22％线性梯度洗脱32分钟，收集34分钟处的峰。

方法二为通过基因工程、蛋白质工程、发酵工程表达后经离子交换柱层析、反相快速蛋白液相色谱和反相高压液相色谱纯化获得。

所述离子交换柱层析、反相快速蛋白液相色谱和反相高压液相色谱纯化方法同方法一。

本发明提供了所述桔小实蝇抗菌肽作为原料在抗病原微生物感染的生物技术产品生产中的应用，生物技术产品包括医药、农产品和食品防腐保鲜剂、动物饲料添加剂、化妆品等。

以及桔小实蝇抗菌肽作为抗病基因通过转基因和其它常规生物技术手段在转基因植物和转基因动物育种方面的应用。

本发明采用常规的基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱法测定桔小实蝇抗菌肽的分子量，软件分析计算其等电点，自动edman降解法蛋白测序仪测定该抗菌肽氨基酸序列。

本发明的有益效果是：

(1)本发明提供了一种桔小实蝇抗菌肽，无溶血活性，经实验证明，对多种细菌，例如革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌及真菌具有抑菌活性，可用于抗病原微生物感染的生物技术产品研发；以桔小实蝇抗菌肽bactrocerin氨基酸序列或基因序列为基础，通过基因工程、蛋白质工程、发酵工程、转基因和其它生物技术手段，可以大规模获得桔小实蝇抗菌肽bactrocerin蛋白，用于抗病原微生物感染的生物技术产品研发；

(2)本发明寻找到研究桔小实蝇抗菌活性物质的有效渠道，并建立了可行的制备方法和纯化条件，为深入研究桔小实蝇抗菌活性物质的应用打下技术基础。

附图说明

图1桔小实蝇抗菌肽的离子交换柱层析图；

图2桔小实蝇抗菌肽的反相快速蛋白液相色谱图；

图3桔小实蝇抗菌肽的反相高压液相色谱。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例来进一步详细说明本发明。

由免疫桔小实蝇蛹分离制备bactrocerin的方法包括以下实施例1、2、3所述过程；由基因工程克隆方法表达bactrocerin不包括实施例1中免疫桔小实蝇蛹粗提物制备过程。

实施例1：桔小实蝇抗菌肽的制备步骤如下：

(1)用混合菌液免疫诱导桔小实蝇蛹；

采用1号昆虫针蘸取生理盐水重悬的混合菌液针刺桔小实蝇蛹的中部；所述生理盐水为含150mmnacl和5mmkcl；所述混合菌液是od600为0.3的金黄色葡萄球菌和大肠杆菌dh5α混合液。

(2)桔小实蝇蛹组织匀浆，得到粗提物；

称取一定量的诱导桔小实蝇蛹，按重量体积比1∶4～1∶6的比例加入相应体积的提取缓冲液，提取缓冲液为50mmol/l醋酸铵中加入1.5μmol/l(终浓度)蛋白酶抑制剂aprotinin和20μmol/l(终浓度)苯基硫脲，冰浴上充分研磨，4℃，10,000×g离心30至35分钟，上清即为桔小实蝇蛹组织匀浆的粗提物，低温，优选-80℃保存备用。

(3)粗提物经纯化后得到所述抗菌肽。

纯化的第一步，进行离子交换柱层析。按上述方法制备的粗提物上样于50mmol/l醋酸铵ph5.0缓冲液平衡的cmsepharosefastflow弱阳离子交换柱，柱长260mm，直径16mm，用50mmol/l～1mol/l线性梯度的醋酸铵ph5.0缓冲液洗脱，收集第iii峰，见附图1，常规方法冻干，-80℃保存备用；

第二步，进行反相快速蛋白液相色谱。离子交换柱层析得到的第iii峰冻干组分重溶于0.05％三氟乙酸水溶液，上样于2％乙腈0.05％三氟乙酸水溶液(体积比)平衡的resourcerpc3ml反相柱，柱长100mm，直径6.4mm，以含0.05％三氟乙酸的乙腈缓冲液从2％-80％线性梯度洗脱60分钟，收集29.5-35.5分钟之间的组分，每1.5分钟1个组分，共收集得到a，b，c和d4个组分，见附图2。各个组分冻干后低温保存备用，低温优选-80℃。

第三步，进行反相高压液相色谱。反相快速蛋白液相色谱得到的活性最高组分峰(b峰)冻干组分重溶于0.05％三氟乙酸水溶液，上样于18％乙腈0.05％三氟乙酸水溶液(体积比)平衡的hypersilods反相柱，柱长250mm，直径4mm，以含0.05％三氟乙酸的乙腈缓冲液从18％～22％线性梯度洗脱32分钟，收集34分钟处的峰，见附图3中箭头所指的峰，冻干，低温保存备用，低温优选-80℃。

实施例2：纯化的桔小实蝇抗菌肽的鉴定

采用基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱法测定桔小实蝇抗菌肽的分子量，软件分析计算其等电点，利用自动edman降解法蛋白测序仪测定该抗菌肽氨基酸序列结构。

通过实施例制备的桔小实蝇抗菌肽是我们首次从桔小实蝇蛹中分离得到的一种多肽，其分子量为2.3道尔顿，等电点11.43，多肽全序列为：颉氨酸-甘氨酸-赖氨酸-苏氨酸-色氨酸-异亮氨酸-赖氨酸-颉氨酸-异亮氨酸-精氨酸-甘氨酸-异亮氨酸-甘氨酸-赖氨酸-丝氨酸-赖氨酸-异亮氨酸-赖氨酸-色氨酸-谷氨酰胺。

实施例3：桔小实蝇抗菌肽对微生物的抑制作用实验

将纯化的桔小实蝇抗菌肽用灭菌蒸馏水1/2倍梯度稀释。取对数生长期的细菌lb培养基菌液90μl，再加入不同浓度10μl的桔小实蝇抗菌肽，混匀，在96孔平板上30℃过夜孵育24h，用酶标仪在600nm处测定各管的吸光度。吸光度没有明显变化的抗菌肽的最低浓度为最小抑菌浓度(minimalinhibitoryconcentration，mic)。真菌用80μl的真菌孢子(104孢子/ml)在土豆琼脂培养基上进行，各孔中加入不同浓度20μl的桔小实蝇抗菌肽，混匀，在96孔平板上25℃过夜孵育24h，用酶标仪在595nm处测定各管的吸光度。吸光度没有明显变化的抗菌肽的最低浓度为mic。结果表明，桔小实蝇抗菌肽对细菌，尤其是革兰氏阳性细菌(如芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌)具有显著的抑制细菌生长作用，对真菌(如镰刀菌、青霉菌、黑曲霉菌)也有较高的抑菌效果。