BACE1的肽抑制剂的制作方法

本申请是国际申请号pct/us2012/059962，国际申请日为2012年10月12日，进入中国国家阶段申请号为201280050484.x，进入中国国家阶段日期为2014年4月14日，发明名称为“bace1的肽抑制剂”的分案申请。序列表本申请包含序列表，其已经通过efs-web以ascii格式提交，并且通过引用完全结合在本文中。所述ascii副本，于2012年9月27日生成，命名为gne0394p.txt，大小为52，415字节。发明领域本发明一般涉及作为bace1拈抗剂的肽，例如，其抑制或减少bace1活性，并且涉及包含所述肽的组合物。另外的实施方案包括治疗多种神经疾病或病症的方法，以及减少患者中的aβ多肽的方法。背景淀粉状变性(amyloidosis)不是一种单一的疾病实体，而是多样化组的进行性疾病过程，其特征在于称为淀粉状蛋白的蜡状、淀粉样蛋白的细胞外组织沉积，淀粉状蛋白积聚在一个或多个器官或机体系统中。随着淀粉状蛋白沉积的积聚，它们开始干扰所述器官或机体系统的正常的功能。存在至少15种不同类型的淀粉状变性。主要形式为没有已知前例的原发性淀粉状变性、伴随一些其他状况的继发性淀粉状变性和遗传性淀粉状变性。多种衰老疾病是基于淀粉状蛋白样蛋白或与淀粉状蛋白样蛋白相关，并且部分特征在于淀粉状蛋白或促进发病机制以及疾病进展的淀粉状蛋白样物质的细胞外沉积的积聚。这些疾病包括，但不限于，神经病症，诸如阿尔茨海默病(alzheimer′sdisease，ad)，雷维小体痴呆(lewybodydementia)；唐氏综合征(down’ssyndrome)；遗传性脑出血伴淀粉状变性(hereditarycerebralhemorrhagewithamyloidosis)(荷兰型)；关岛帕金森-痴呆并发症(guamparkinson-dementiacomplex)。基于或与淀粉状蛋白样蛋白相关的其他疾病是进展性核上性麻痹(progressivesupranuclearpalsy)、多发性硬化(multiplesclerosis)、克-雅病(creutzfeldjacobdisease)、帕金森病、hiv相关的痴呆(hiv-relateddementia)、als(肌萎缩性脊髓侧索硬化症(amyotropiclateralsclerosis))、成年型糖尿病(adultonsetdiabetes)、老年性心脏淀粉状变性(senilecardiacamyloidosis)、内分泌肿瘤以及其他，包括黄斑变性(maculardegeneration)。多肽β-淀粉状蛋白(aβ)可能在阿尔茨海默病(ad)的发病机制中起重要作用。vassar等，j.neurosci.(神经科学杂志)29：12787-12794(2009)。aβ多肽在cns中的积聚导致突触功能障碍、轴突变性和神经元死亡。ad患者的脑表现出显著的神经病理学损伤的特征性病理学，诸如神经原纤维缠结(nfts)和富含淀粉状蛋白的老年斑。淀粉状蛋白斑的主要成分是aβ。这些损伤与中枢神经系统(cns)神经元群体的大量损失相关，并且其进展伴有与ad相关的临床痴呆。aβ是前体蛋白β淀粉状蛋白前体蛋白(β-app或app)的蛋白水解产物。app是i型跨膜蛋白，其相继被两种蛋白酶，即β-和γ-分泌酶切割。β-分泌酶，被称为β-位淀粉状蛋白前体蛋白切割酶1(β-siteamyloidprecursorproteincleavingenzyme1，bace1)，其首先切割app以暴露aβ的n-端，由此产生称为c99的膜结合的片段。vassar等，j.neurosci.(神经科学杂志)，29：12787-12794(2009)和uniprotkb/swiss-protentryp56817(bace1_human)。然后γ-分泌酶能够切割c99产生成熟的aβ多肽。产生的aβ具有长度为38个氨基酸至43个氨基酸范围内的异源c端。42个氨基酸形式的aβ(aβ42)是原纤维形式的aβ，并且在患有唐氏综合症的患者中过量产生，并且已经提示其在ad的早期发病机制中起作用。vassar等，j.neurosci.(神经科学杂志)29：12787-12794(2009)。因此，由于对其的抑制可能抑制aβ产生，bace1已经成为治疗靶标。事实上，bace1敲除小鼠(bace1-/-)不产生脑aβ，这证实了bace1是负责脑中产生aβ的主要的酶(如果不是唯一的酶)。roberds等，humanmol.genetics(人分子遗传学)10：1317-1324(2001)。此外，ad模型中的bace1敲除小鼠不形成淀粉状蛋白斑；认知缺陷和胆碱功能性功能障碍也得到恢复。mcconlogue等，j.biol.chem.(生物化学杂志)282：26326-26334(2007)；ohno等，neuron(神经元)41：27-33(2004)；和laird等，j.neurosci.(神经科学杂志)25：11693-11709(2005)。另外，bace1杂合敲除小鼠具有减少的斑形成，这表明斑减少不需要bace1活性的完全抑制。mcconlogue等，j.biol.chem.(生物化学杂志)282：26326-26334(2007)。bace-1(hussain，i.等(1999)molcellneurosci(分子细胞神经科学)14：419-27；sinha，s.等(1999)nature(自然)402：537-40；vassar，r.等(1999)science(科学)286：735-41；yan，r.等(1999)nature(自然)402：533-7；lin，x.等(2000)procnatlacadsciusa(美国国家科学院学报)97：1456-60)及其与底物样拟肽抑制剂om99-2的复合的结构(hong，l.等(2000)science(科学)290：150-3)的发现开启了制药研发的新时代，促进多种类型的bace1抑制剂的研发。第一波抑制剂是小分子拟肽(luo，x.等intjclinexppathol(临床实验病理学杂志)3：618-28)，其尚待显示临床成功性，部分是由于穿过血脑屏障(bbb)的挑战。随后，多种基于片段和非肽方法已经产生了更适于穿过bbb递送至中枢神经系统(cns)的化合物(silvestri，r.(2009)medresrev(医药研究综述)29：295-338；luo，x.等(2010)intjclinexppathol(国际临床实验病理学杂志)3：618-28)。最近，已经出现了抗体的研发(pul，r.等(2011)expertopinbiolther(生物治疗的专家观点)11：343-57)。第一类靶向aβ并且将其从循环中清除，作用为调节cns中aβ水平的接收池(sink)。最新一类抗体通过结合在外部靶向bace1本身并且作用为非竞争性抑制剂(atwal，j.k.等(2011)scitranslmed3：84ra43；zhou，l.等(2010)j.biol.chem.(生物化学杂志)286：8677-8687)。在小鼠和食蟹猴中，抗-bace1不仅减少外周aβ水平，而且还令人惊讶地减少在脑脊液(csf)中的aβ水平。进一步改造该抗体通过双特异性抗-bace1抗-转铁蛋白抗体结合受体介导的穿过bbb的胞转作用已经导致cns中aβ更有效的药效学减少(yu，y.j.等(2011)scitranslmed3：84ra44)。具有有效的bace1治疗抑制剂减少患有神经疾病和病症如ad的患者中的aβ产生将是有益的。本文提供的本发明涉及这样的抑制剂，包括其在多种方法中的应用。本文引用的所有参考文献，包括专利申请和公布，通过引用完全结合在本文中。发明概述本发明提供bace1的肽和多肽抑制剂以及使用其的方法。具体地，所述肽或多肽抑制或减少bace1活性。如下文所述，使用展示在噬菌体颗粒上的首次用于实验的肽文库首先选择结合剂，然后筛选抑制剂。这导致以非经典方式结合在活性位点的有效种类的肽抑制剂的发现。这些肽在两种酶测定和基于细胞的测定中抑制bace1，导致aβ肽的减少。该肽本身和与bace1复合的结构显示出一种之前在蛋白水解酶的活性位点中没有观察到的新型结合方式。在一个实施方案中，本发明提供一种特异性结合bace1的分离的多肽，其中所述多肽包含氨基酸序列x1-s-x2-y-c-r-l-x3-x4-x5-x6-c-(x7)n(seqidno：6)，其中x1是谷氨酸或天冬氨酸；其中x2是甲硫氨酸、亮氨酸、异亮氨酸或缬氨酸；其中x3是亮氨酸或甲硫氨酸；其中x4是甘氨酸、丝氨酸或丙氨酸；其中x5是亮氨酸、异亮氨酸或缬氨酸；其中x6是甘氨酸或丙氨酸；其中x7是甘氨酸、天冬氨酸或谷氨酸，并且其中n是0或1。在不同实施方案中，n是0(seqidno：7)。在其他实施方案中，n是1(seqidno：8)。在一个实施方案中，x3是亮氨酸(seqidno：9)。在另一个实施方案中，x4是甘氨酸(seqidno：10)。在另一个实施方案中，x5是异亮氨酸(seqidno：11)。在另一个实施方案中，x6是甘氨酸(seqidno：12)。在另一个实施方案中，x7是甘氨酸(seqidno：13)。在一个实施方案中，本发明提供包含选自由下列各项组成的组的氨基酸序列的分离的多肽：keesiycrlmglgcg(seqidno：14)(bace018)，nelspycrlmglgcd(seqidno：15)(bace019)，neesmycrllgigcg(seqidno：16)(bace20)和peeslycrllalgcg(seqidno：17)(bace021)。在一个实施方案中，所述多肽包含neesmycrllgigcg(seqidno：16)的氨基酸序列。在另一个实施方案中，所述多肽包含keesiycrlmglgcg(seqidno：14)的氨基酸序列。在另一个实施方案中，所述多肽包含nelspycrlmglgcd(seqidno：15)的氨基酸序列。在另一个实施方案中，所述多肽包含peeslycrllalgcg(seqidno：17)的氨基酸序列。在一个实施方案中，本发明提供基本上由选自由下列各项组成的氨基酸序列组成或由选自由下列各项组成的氨基酸序列组成的分离的多肽：keesiycrlmglgcg(seqidno：14)，nelspycrlmglgcd(seqidno：15)，neesmycrllgigcg(seqidno：16)和peeslycrllalgcg(seqidno：17)。在一个实施方案中，所述多肽基本上由neesmycrllgigcg(seqidno：16)的氨基酸序列组成或者由其组成。在另一个实施方案中，所述多肽基本上由keesiycrlmglgcg(seqidno：14)的氨基酸序列组成或者由其组成。在另一个实施方案中，所述多肽基本上由nelspycrlmglgcd(seqidno：15)的氨基酸序列组成或者由其组成。在另一个实施方案中，所述多肽基本上由peeslycrllalgcg(seqidno：17)的氨基酸序列组成或者由其组成。在一个实施方案中，本发明提供特异性结合bace1的分离的多肽，其中所述多肽包含氨基酸序列smycrllgigcg(seqidno：18)(bace31)。在一个实施方案中，所述多肽包含氨基酸序列esmycrllgigcg(seqidno：19)(bace030)。在另一个实施方案中，所述多肽基本上由氨基酸序列esmycrllgigcg(seqidno：19)组成或由其组成。在一个实施方案中，本发明提供特异性结合bace1的分离的多肽，其中所述多肽包含在相对于c端的位置-1和-8具有半胱氨酸、在相对于c端位置-7具有精氨酸或精氨酸类似物并且在相对于c端的位置-6具有亮氨酸的序列。在一个实施方案中，在相对于c端的位置-7的氨基酸是精氨酸。在一个实施方案中，所述多肽在相对于c端的位置0，-2和-4包含小氨基酸。在另一个实施方案中，在相对于c端的位置0，-2和-4的氨基酸为甘氨酸。在一个实施方案中，所述多肽在相对于c端的位置-3包含疏水残基。在一个实施方案中，所述多肽在相对于c端的位置-5包含亮氨酸。在一个实施方案中，所述多肽在相对于c端的位置-9包含酪氨酸或苯丙氨酸。在另一个实施方案中，在相对于c端的位置-9的氨基酸是酪氨酸。在一个实施方案中，所述多肽在相对于c端的位置-10包含大体积疏水残基。在一个实施方案中，所述多肽在相对于c端的位置-11包含丝氨酸。在一个实施方案中，所述多肽在相对于c端的位置-12包含酸性残基。在另一个实施方案中，在相对于c端的位置-12的氨基酸是谷氨酸。在一个实施方案中，在位置0，-2和-4的氨基酸是小氨基酸；其中在位置-3的氨基酸是疏水残基；其中在位置-5的氨基酸是亮氨酸或甲硫氨酸；其中在位置-7的氨基酸是精氨酸；其中在位置-9的氨基酸是酪氨酸或苯丙氨酸；其中在位置-10的氨基酸是大体积疏水残基；其中在位置-11的氨基酸是丝氨酸；并且其中在位置-12的氨基酸是酸性氨基酸。在另一个实施方案中，在位置0，-2和-4的氨基酸是甘氨酸；其中在位置-3的氨基酸是疏水残基；其中在位置-5的氨基酸是亮氨酸；其中在位置-7的氨基酸是精氨酸；其中在位置-9的氨基酸是酪氨酸；其中在位置-10的氨基酸是大体积疏水残基；其中在位置-11的氨基酸是丝氨酸；并且其中在位置-12的氨基酸是谷氨酸。在不同的实施方案中，所述多肽包含选自表2和图2中列出的bace结合肽的序列的序列。在一个实施方案中，所述多肽直接与至少一个特定的bace1残基相互作用。在一个实施方案中，在位置-7的精氨酸与bace1的天冬氨酸32和天冬氨酸228形成盐桥。在另一个实施方案中，在位置-9的酪氨酸结合bace1的y环。在另一个实施方案中，在位置-12的谷氨酸与bace1的精氨酸235形成盐桥。在一个实施方案中，所述多肽结合bace1在p侧的底物沟。在另一个实施方案中，所述多肽结合bace1在p侧的底物沟，其肽键朝向与底物方向相反的方向。在一个实施方案中，本发明提供一种分离的多肽，所述多肽特异性结合bace1并且包含含有选自表2和图2中列出的氨基酸序列的肽的氨基酸序列的c端、n端或中间氨基酸序列。在一些实施方案中，所述c端氨基酸序列选自keesiycrlmglgcg(seqidno：14)，nelspycrlmglgcd(seqidno：15)，esmycrllgigcg(seqidno：19)和peeslycrllalgcg(seqidno：17)。在一个实施方案中，本发明提供任一种上述多肽，其中所述多肽与细胞毒性剂或增强细胞进入的氨基酸序列标签缀合或融合。在不同实施方案中，所述细胞毒性剂是化疗剂或化疗药、生长抑制剂、毒素(例如，蛋白毒素，细菌、真菌、植物或动物来源的酶活性毒素，或其片段)或放射性同位素。在一个实施方案中，所述增强细胞进入的氨基酸序列标签是细胞穿透肽。在一个实施方案中，所述融合蛋白包括bace1结合肽与通常进行通过血脑屏障的吸收介导的胞转作用或受体介导的胞转作用的蛋白的氨基酸序列的融合体。在一个实施方案中，本发明提供与任一种上述多肽竞争与bace1结合的氨基酸序列。在一个实施方案中，本发明提供任一种上述多肽，其中所述多肽抑制内源性bace1蛋白水解活性。在一个实施方案中，本发明提供特异性结合本发明的多肽的抗体或其片段。在一个实施方案中，本发明提供包含本发明的多肽的试剂盒。在一个实施方案中，提供包含本发明的多肽和药用载体的药物制剂。在另外的实施方案中，提供编码本发明的多肽的分离的核酸，以及包含编码本发明的多肽的核酸的载体。在另一个方面中，提供包含编码本发明的多肽的核酸的宿主细胞以及用于产生本发明的多肽的方法，所述方法包括在适于产生所述多肽的条件下培养包含编码本发明的多肽的核酸的宿主细胞。在另一个实施方案中，提供治疗患有神经疾病或病症的个体的方法，所述方法包括给所述个体施用有效量的本发明的多肽。在另一个实施方案中，提供减少患有或有风险患上神经疾病或病症的患者中的淀粉状蛋白斑或抑制淀粉状蛋白斑形成的方法，所述方法包括给个体施用有效量的本发明的多肽。在一个实施方案中，提供减少患者中的aβ的方法，所述方法包括给所述患者施用有效量的本发明的多肽。在一个实施方案中，所述患者患有或有风险患上神经疾病或病症。在另一个实施方案中，提供抑制患者中的轴突变性的方法，所述方法包括给所述患者施用有效量的本发明的多肽。在本发明方法的一个实施方案中，所述患者是哺乳动物。在另一个方面中，所述患者是人。在另一个实施方案中，所述神经疾病或病症选自由下列各项组成的组：阿尔茨海默病(ad)，外伤性脑损伤(traumaticbraininjury)，卒中(stroke)，青光眼(glaucoma)，痴呆(dementia)，肌营养不良(musculardystrophy，md)，多发性硬化(ms)，肌萎缩侧索硬化(amyotrophiclateralsclerosis，als)，囊性纤维化(cysticfibrosis)，安吉尔曼综合征(angelman’ssyndrome)，利德尔综合征(liddlesyndrome)，佩吉特病(paget’sdisease)，外伤性脑损伤，雷维小体病(lewybodydisease)，脊髓灰质炎后综合征(postpoliomyelitissyndrome)，夏伊-德雷格综合征(shy-draegersyndrome)，橄榄体脑桥小脑萎缩(olivopontocerebellaratrophy)，帕金森病，多系统萎缩(multiplesystematrophy)，纹状体黑质变性(striatonigraldegeneration)，核上性麻痹(supranuclearpalsy)，牛海绵状脑病(bovinespongiformencephalopathy)，痒病(scrapie)，克-雅综合征(creutzfeldt-jakobsyndrome)，库鲁病(kuru)，格-施-沙综合征(gerstmann-straussler-scheinkerdisease)，慢性消耗性疾病(chronicwastingdisease)，家族致命性失眠症(fatalfamilialinsomnia)，延髓性麻痹(bulbarpalsy)，运动神经元病(motorneurondisease)，卡纳范病(canavandisease)，亨廷顿病(huntington′sdisease)，神经元蜡样质脂褐质沉积病(neuronalceroid-lipofuscinosis，亚历山大病(alexander′sdisease)，图雷特综合征(tourette′ssyndrome)，门克斯扭结发综合征(menkeskinkyhairsyndrome)，科凯恩综合征(cockaynesyndrome)，哈勒沃登-施帕茨综合征(halervorden-spatzsyndrome)，拉福拉病(laforadisease)，雷特综合征(rettsyndrome)，肝豆状核变性(hepatolenticulardegeneration)，莱施-奈恩综合征(lesch-nyhansyndrome)，和翁-隆综合征(unverricht-lundborgsyndrome)，痴呆(dementia)(包括，但不限于，皮克病(pick′sdisease)和脊髓小脑性共济失调(spinocerebellarataxia))。在一个实施方案中，所述神经疾病或病症是阿尔茨海默病。附图简述本专利文件包含至少一幅彩色绘制的附图。请求并缴纳需要的费用后，局方将提供带有彩色附图的本专利或专利公布的副本。图1a显示来源于噬菌体展示的线性肽和环肽文库的平板分选的针对bace1的肽配体(按出现的顺序分别为seqidnos21，56-61，21，62，56，63-68和22-24)的序列比对。bms1、bms2和bms4分别与之前所述的肽标识符1、2和4相同(kornacker，m.g等(2005)biochemistry(生物化学)44：11567-73)。图1b显示与已知的bace1抑制剂om99-2(标识为“om99”)和抑制素相比，关于bace010和bace011(在该图中分别标识为“bace10”和“bace11”)的htrf酶活性测定的结果。图1c显示与bace1结合的肽-展示噬菌体与合成肽bms1的竞争。柱表示在不存在(灰色)或存在(黑色)70nmbms1肽时的噬菌体elisa信号。噬菌体肽id如图1a中所示。图2显示在存在bace010作为竞争剂时来源于噬菌体展示的肽文库的溶液分选的针对bace1的肽配体(按出现的顺序分别为seqidnos26，14，69-73，15，74-78，16，79-86，17和87-95)的序列。bace017是在存在100μmbace010时由针对首次用于实验的肽文库的bace1溶液淘选(solutionpanning)获得的bace1结合肽配体。bace018-bace021是来源于bace017的亲和力成熟的针对bace1结合肽的肽序列。列出噬菌体点elisa数据表示针对单个克隆的相对结合亲和力。用elisa标记的柱是针对bace1的噬菌体结合信号，s/n比率表示信号/噪声比率，其中“信号”是在柱“elisa”中所示的数据，并且噪声是作为背景非特异性结合的针对bsa的噬菌体结合信号。序列比对总结为logo表示(crooks等，genomeresearch(基因组研究)，14：1188-1190，(2004)；schneider和stephensrm.1990.nucleicacidsres.(核酸研究)18：6097-6100(1990))。选择用pepid表示的肽进行肽合成。图3a显示合成的bace1肽配体在htrf酶测定中的抑制性活性。bace1结合肽bace018-bace021在针对bace1的27-merhtrf底物的分解中表现出浓度依赖性抑制作用。与bace018-bace021对应的肽，其中半胱氨酸残基被丝氨酸置换(bace025-bace028)，其抑制bace1酶活性的能力有效性少得多。在该图中，bace018-bac021和bace025-bace028分别标识为bace-18-bace-21和bace25-bace-28。图3b是显示分别使用bace020、和小分子和肽抑制剂om99-2或bms1的生物素酰化的bace020竞争结合elisa的结果的图表。图4是显示在细胞测定中bace1结合肽抑制aβ产生的图表。与bace1抑制性抗体(抗-bace1)、bace1的小分子抑制剂(om99-2)、bace1的肽抑制剂(bms1)和bace1的小分子抑制剂(gsk-8e，charrier，等，j.med.chem.(医学化学杂志)51：3313-3317(2008))相比，bace1结合肽bace017-bace021在293-happ细胞中表现出aβ产生的浓度依赖性的减少。使用4-参数非线性回归曲线拟合程序确定ic50值。图5a显示通过同核nmr光谱确定的溶液中bace020的结构。图5b显示同与bace020复合的bace1(红色)相比，未结合的bace1(蓝色)的trosy光谱的比较。右图突出显示包括活性位点残基asp32和asp228的特定的残基的光谱的变化。图5c显示在bace1的活性位点沟(groove)和盖(flap)中的bace1的结构；当结合bace020时具有受扰共振的那些bace1残基显示为红色。图6显示与bace030复合的bace1的解析度的晶体结构。图6a显示绘出在1σ(棕色网状物)、与bace的活性位点结合的bace030肽的轮廓的电子密度图谱。图6b显示游离的bace1(灰色)、与bace1(蓝色)结合的bace030(绿色)和与bace1(粉色)结合的om99-2(小麦色)的晶体结构。活性位点天冬氨酸残基显示为棒状并且涂色为红色。图6c显示具有bace030(绿色)和om99-2(洋红色)的bace1复合物的重叠。在催化位点的天冬氨酸残基显示为红色。图6d显示bace030(绿色)与bace1(橙色)的残基的结合相互作用。水分子显示为红色球体。氢键显示为红色虚线。图6e显示具有棒状的om99-2(洋红色)和om03-4(青色)的bace1复合物的重叠。在不再与bace020结合的bace1突变体的情形中，bace1表面具有红色表面，并且对bace030结合没有作用的bace1突变体具有绿色表面。图7a显示与bace的活性位点结合的bace030肽的解析度的晶体结构的远视图。bace030显示为黄色，bace1包含催化的天冬氨酸残基的区域显示为红色，并且bace1的盖区显示为骨架踪迹。图7b显示bace030的“精氨酸指”(arg6)与bace1的催化天冬氨酸残基的相互作用。图7c显示bace030的tyr4与bace1的y-环的相互作用。图7c公开″leu8gly9leu10gly11″作为seqidno：96。发明实施方案详述定义“分离的”当指分子时是指已经鉴定并且与其天然环境的成分分离和/或从中回收的分子。其天然环境的污染成分是干扰诊断或治疗应用的物质。“活性”多肽或其片段保留所述活性多肽的天然或天然存在的副本的生物活性。生物活性是指由所述活性多肽的天然或天然存在的副本介导的功能。例如，结合或蛋白-蛋白相互作用组成生物活性。术语“抗体”和“免疫球蛋白”在最广泛意义上可以互换使用，并且包括单克隆抗体(例如，全长或完整的单克隆抗体)、多克隆抗体、多价抗体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体，只要其展现出需要的生物活性)，并且还可以包括特定的抗体片段(如本文中更详细所述)。抗体可以是嵌合的、人的、人源化的和/或亲和力成熟的。“抗体片段”仅包含完整抗体的一部分，其中该部分优选地保留当该部分存在于完成抗体时通常与其相关的功能中的至少一种、优选大部分或全部。术语“单克隆抗体”用在本文中是指从一群基本上同质的抗体中获得的抗体，即除了可能以少量存在的可能的天然存在的突变之外，构成群体的各个抗体是相同的。单克隆抗体是高度特异性的，针对单一的抗原。此外，与典型地包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制剂相反，每个单克隆抗体针对抗原上的单个决定簇。本文的单克隆抗体具体包括“嵌合”抗体，其中重链和/或轻链的一部分与来源于特定物种或属于特定抗体种类或亚类的抗体中相应的序列相同或同源，而该链的其余部分与来源于另一种物种或属于另一种抗体种类或亚类的抗体中相应的序列相同或同源，只要其表现出需要的生物活性(美国专利号4,816,567；和morrison等，proc.natl.acad.sci.usa(美国国家科学院学报)81：6851-6855(1984))。非人(例如鼠)抗体的“人源化”形式是最低限度包含来源于非人免疫球蛋白的序列的嵌合抗体。在极大程度上，人源化抗体是这样的人免疫球蛋白(接受体抗体)，其中所述接受体的高变区的残基被具有需要的特异性、亲和力和能力的非人物种(供体抗体)诸如小鼠、大鼠、兔或非人灵长类动物的高变区残基替换。在一些情况中，人免疫球蛋白的框架区(fr)残基被相应的非人残基替换。此外，人源化抗体可包含在接受体抗体或供体抗体中不存在的残基。进行这些修饰是为了进一步改进抗体的性能。一般而言，人源化抗体将包含基本上全部或至少一个、通常两个这样的可变结构域，其中所有或基本上所有的高变环对应于非人免疫球蛋白的高变环，且所有或基本上所有的frs是人免疫球蛋白序列的frs。人源化抗体任选还将包含至少部分免疫球蛋白恒定区(fc)，典型地是人免疫球蛋白的恒定区。更多细节参见jones等，nature(自然)321：522-525(1986)；riechmann等，nature(自然)332：323-329(1988)；和presta，curr.op.struct.biol.(结构生物学新观点)2：593-596(1992)。还参见下述综述论文及其中引用的参考文献：vaswani和hamilton，ann.allergy，asthma&immunol.(过敏、哮喘和免疫学)1：105-115(1998)；harris，biochem.soc.transactions(生物化学学会学报)23：1035-1038(1995)；hurle和gross，curr.op.biotech.(现代生物技术观点)5：428-433(1994)。“人抗体”是具有与由人产生的抗体的氨基酸序列对应的氨基酸序列的抗体和/或使用本文公开的任一种制备人抗体的技术制备的抗体。人抗体的这一定义特异性排除包含非人抗原结合残基的人源化的抗体。“亲和力成熟的”抗体指这样的抗体，在该抗体的一个或多个互补决定区(cdrs)中具有一处或多处改变，导致该抗体对抗原的亲和力与没有这些改变的亲本抗体相比有提高。优选的亲和力成熟的抗体具有针对靶抗原的纳摩尔或甚至皮摩尔的亲和力。亲和力成熟的抗体由本领域已知的方法制备。marks等，bio/technology(生物技术)10：779-783(1992)记述了通过vh和vl结构域改组进行的亲和力成熟。cdr和/或构架残基的随机诱变记述在：barbas等，procnat.acad.sciusa(美国国家科学院学报)91：3809-3813(1994)；schier等，gene(基因)169：147-155(1995)；yelton等j.immunol.(免疫学杂志)155：1994-2004(1995)；jackson等，j.immunol.(免疫学杂志)154(7)：3310-9(1995)；和hawkins等j.mol.biol.(分子生物学杂志)226：889-896(1992)。“带表位标签的”多肽是指与“标签多肽”融合的嵌合多肽。所述标签提供这样的表位，可以制备针对所述表位的抗体或针对所述表位的抗体是可获得的，但是所述表位基本上不干扰多肽活性。为了减少抗-标签抗体与内源性表位的反应性，所述标签多肽通常是独特的。适宜的标签多肽通常具有至少六个氨基酸残基，通常约8-50个氨基酸残基，优选8-20个氨基酸残基。表位标签序列的实例包括来自甲型流感病毒(influenzaavirus)的ha，gd，和c-myc，聚-his和flag。“多核苷酸”或“核酸”在本文中可互换使用，是指任意长度的核苷酸的聚合物，并且包括，但不限于，dna和rna。核苷酸可以是脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、修饰的核苷酸或碱基和/或其类似物、或可以通过dna或rna聚合酶或通过合成反应结合成聚合物的任意底物。多核苷酸可以包含修饰的核苷酸，诸如甲基化的核苷酸及其类似物。如果存在，可以在组装聚合物之前或之后进行核苷酸的修饰。核苷酸的序列可以被非核苷酸成分中断。多核苷酸可以在合成后进行进一步修饰，诸如通过缀合标记进行修饰。其他类型的修饰包括，例如，“帽”，用类似物置换一个或多个天然存在的核苷酸，中间核苷酸修饰，诸如例如具有不带电荷的键的那些(例如，磷酸甲酯、磷酸三酯、磷酰胺(phosphoamidates)、氨基甲酸酯(cabamates)等)和具有带电荷的键的那些(例如，硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等)，含有悬垂结构部分的那些，所述悬垂结构部分诸如例如，蛋白(例如，核酸酶、毒素、抗体、信号肽、聚-l-赖氨酸等)，具有嵌入剂(例如，吖啶、补骨脂素等)的那些，含有螯合剂(例如，金属、放射性金属、硼、氧化金属等)的那些，含有烷化剂的那些，具有修饰的键的那些(例如，α异头核酸等)以及未修饰形式的多核苷酸。此外，在糖中通常存在的任一羟基可以被替换，例如，被磷酸酯基(phosphonategroups)、磷酸盐基(phosphategroups)替换，被标准的保护基保护，或被活化以产生针对另外的核苷酸的另外的键，或可以缀合到固体或半固体支持物上。5′和3′末端oh可以被磷酸化或被取代为1-20个碳原子的胺或有机加帽基团结构部分。其他羟基也可以被衍生为标准的保护基。多核苷酸还可以包含本领域通常已知的核糖或脱氧核糖的类似形式，包括，例如，2′-o-甲基-，2′-o-烯丙基，2’-氟-或2′-叠氮基-核糖，碳环糖类似物，α-异头糖，差向异构体糖诸如阿拉伯糖、木糖或来苏糖，吡喃糖，呋喃糖，景天庚酮糖，无环类似物和无碱基核苷类似物诸如甲基核苷。一个或多个磷酸二酯键可以被替换为备选的连接基团。这些备选的连接基团包括，但不限于，下述实施方案，其中磷酸酯被替换为p(o)s(″硫代酯″)，p(s)s(″二硫代酯″)，″(o)nr2(″酰胺化物″)，p(o)r，p(o)or′，co或ch2(″甲酰化物(formacetal)″)，其中每个r或r′独立地是h或是任选地含有醚(--o--)键的取代的或未取代的烷基(1-20个c)，芳基，烯基，环烷基，环烯基或芳烷基(araldyl)。多核苷酸中的所有的键不需要是相同的。之前的描述适用于本文引用的所有多核苷酸，包括rna和dna。“寡核苷酸”用在本文中通常是指短的、一般是单链的、一般是合成的多核苷酸，其长度通常但不是必须地少于约200个核苷酸。术语“寡核苷酸”和“多核苷酸”不互相排除。上文关于多核苷酸的描述同等且完全适用于寡核苷酸。“控制序列”用在本文中是允许可操作连接的编码序列在特定宿主生物体中表达的dna序列。原核控制序列包括启动子、操纵子序列和核糖体结合位点。真核孔子和序列包括启动子、多腺苷酸化信号和增强子。若核酸与另一核酸序列处于功能性关系中，则该核酸是“可操作连接”的。例如，若启动子或增强子影响序列的转录，则其与该编码序列可操作连接；或者，若核糖体结合位点的位置促进翻译，则其与编码序列可操作连接。通常，“可操作连接″指被连接的dna序列是相邻的，而且在分泌前导序列的情况中指相邻且处于相同阅读框中。然而，增强子不必相邻。术语“载体”当在本文中使用时是指能够增殖与其相连的另一个核酸的核酸分子。该术语包括作为自我复制核酸结构的载体以及结合到已经引入其的宿主细胞的基因组中的载体。某些载体能够指导与其可操作相连的核酸的表达。这样的载体在本文中被称为″表达载体″。术语“宿主细胞”、“宿主细胞系”和“宿主细胞培养物”可互换地使用并且是指其中引入外源核酸的细胞，包括所述细胞的后代。宿主细胞包括“转化体”和“转化的细胞”，其包括原代转化的细胞和来源于其的后代，而不考虑传代的次数。后代在核酸含量上可能与亲本细胞不完全相同，而是可以包含突变。本文中包括与在最初转化的细胞中筛选或选择的具有相同功能或生物活性的突变体后代。除非另外说明，术语“bace1”当在本文中使用时是指来自任何脊椎动物来源(包括哺乳动物如灵长类动物(例如人)和啮齿类动物(例如，小鼠和大鼠))的任何天然β-分泌酶1(也被称为β-位淀粉状蛋白前体蛋白切割酶1，膜相关天冬氨酸蛋白酶2，memapsin2，天冬氨酰蛋白酶2或asp2)。该术语包括“全长”未加工的bace1以及由细胞内加工产生的任何形式的bace1。该术语还包括天然存在的bace1的变体，例如，剪接变体或等位变体。示例性bace1多肽的氨基酸序列显示在以下seqidno：1中，并且有人bace1、同种型a的序列，如在vassar等，science(科学)286：735-741(1999)中报道的，该文献通过引用完整地结合于本文中。maqalpwlllwmgagvlpahgtqhgirlplrsglggaplglrlpretdeepeepgrrgsfvemvdnlrgksgqgyyvemtvgsppqtlnilvdtgssnfavgaaphpflhryyqrqlsstyrdlrkgvyvpytqgkwegelgtdlvsiphgpnvtvraniaaitesdkffingsnwegilglayaeiarpddslepffdslvkqthvpnlfslqlcgagfplnqsevlasvggsmiiggidhslytgslwytpirrewyyeviivrveingqdlkmdckeynydksivdsgttnlrlpkkvfeaavksikaasstekfpdgfwlgeqlvcwqagttpwnifpvislylmgevtnqsfritilpqqylrpvedvatsqddcykfaisqsstgtvmgavimegfyvvfdrarkrigfavsachvhdefrtaavegpfvtldmedcgynipqtdestlmtiayvmaaicalfmlplclmvcqwcclrclrqqhddfaddisllk(seqidno：1)存在人bace1的一些其他的同种型，包括同种型b，c和d，以下分别显示为seqidno：2，seqidno：3和seqidno：4。参见uniprotkb/swiss-protentryp56817，其通过引用完整地结合于本文中。maqalpwlllwmgagvlpahgtqhgirlplrsglggaplglrlpretdeepeepgrrgsfvemvdnlrgksgqgyyvemtvgsppqtlnilvdtgssnfavgaaphpflhryyqrqlsstyrdlrkgvyvpytqgkwegelgtdlvsiphgpnvtvraniaaitesdkffingsnwegilglayaeiarlcgagfplnqsevlasvggsmiiggidhslytgslwytpirrewyyeviivrveingqdlkmdckeynydksivdsgttnlrlpkkvfeaavksikaasstekfpdgfwlgeqlvcwqagttpwnifpvislylmgevtnqsfritilpqqylrpvedvatsqddcykfaisqsstgtvmgavimegfyvvfdrarkrigfavsachvhdefrtaavegpfvtldmedcgynipqtdestlmtiayvmaaicalfmlplclmvcqwcclrclrqqhddfaddisllk(seqidno：2)maqalpwlllwmgagvlpahgtqhgirlplrsglggaplglrlpretdeepeepgrrgsfvemvdnlrgksgqgyyvemtvgsppqtlnilvdtgssnfavgaaphpflhryyqrqlsstyrdlrkgvyvpytqgkwegelgtdlpddslepffdslvkqthvpnlfslqlcgagfplnqsevlasvggsmiiggidhslytgslwytpirrewyyeviivrveingqdlkmdckeynydksivdsgttnlrlpkkvfeaavksikaasstekfpdgfwlgeqlvcwqagttpwnifpvislylmgevtnqsfritilpqqylrpvedvatsqddcykfaisqsstgtvmgavimegfyvvfdrarkrigfavsachvhdefrtaavegpfvtldmedcgynipqtdestlmtiayvmaaicalfmlplclmvcqwcclrclrqqhddfaddisllk(seqidno：3)maqalpwlllwmgagvlpahgtqhgirlplrsglggaplglrlpretdeepeepgrrgsfvemvdnlrgksgqgyyvemtvgsppqtlnilvdtgssnfavgaaphpflhryyqrqlsstyrdlrkgvyvpytqgkwegelgtdllcgagfplnqsevlasvggsmiiggidhslytgslwytpirrewyyeviivrveingqdlkmdckeynydksivdsgttnlrlpkkvfeaavksikaasstekfpdgfwlgeqlvcwqagttpwnifpvislylmgevtnqsfritilpqqylrpvedvatsqddcykfaisqsstgtvmgavimegfyvvfdrarkrigfavsachvhdefrtaavegpfvtldmedcgynipqtdestlmtiayvmaaicalfmlplclmvcqwcclrclrqqhddfaddisllk(seqidno：4)同种型b显示在seqidno：2中，并且与同种型a(seqidno：1)不同之处在于缺少氨基酸190-214(即，缺失seqidno：1的氨基酸190-214)。同种型c显示在seqidno：3中，并且与同种型a(seqidno：1)不同之处在于缺少氨基酸146-189(即，缺失seqidno：1的氨基酸146-189)。同种型d显示在seqidno：4中，并且与同种型a(seqidno：1)不同之处在于缺少氨基酸146-189和190-214(即，缺失seqidno：1的氨基酸146-189和190-214)。术语“肽”通常是指通过肽键连接的相邻的且相对短的氨基酸序列。典型地，但是不是必需的，肽具有约2-50个氨基酸、4-40个氨基酸或10-30个氨基酸的长度。尽管术语“多肽”通常是指较长形式的肽，但是这两个术语在本发明的一些情形中可以互换使用并且已经互换使用。术语“氨基酸”和“残基”在本文中互换使用。多肽的“区域”是2个以上氨基酸的相邻序列。在其他实施方案中，区域是至少约任意3，5，10，15个相邻的氨基酸。“c端区”、“c端序列”及其变化形式用在本文中是指位于或紧邻多肽的c端末端的氨基酸序列。通常，该序列包含具有游离羧基的氨基酸。在一个实施方案中，c端区或序列是指包含位于最接近多肽的c端的约1-15个残基的多肽区域。“n端区”、“n端序列”及其变化形式用在本文中是指位于或紧邻多肽的n端末端的氨基酸序列。通常，该序列包含具有游离氨基的氨基酸。在一个实施方案中，n端区或序列是指包含位于最接近多肽的n端的约1-15个残基的多肽区域。“中间区”、“中间序列”及其变化形式用在本文中是指位于多肽内并且在其n端和c端两端侧连不是该序列的一部分的一个或多个氨基酸的氨基酸序列。通常，该序列不包含具有游离的羧基或氨基的氨基酸。在一个实施方案中，中间区或序列是指包含位于多肽内的约1-15个残基的多肽区域，其中所述区域不包含c端或n端氨基酸。“亲和力”指分子的单一结合位点与其结合配偶体之间全部非共价相互作用总和的强度。除非另有说明，在用于本文时，“结合亲和力”指反映结合对的成员之间1∶1相互作用的内在结合亲和力。分子x对其配偶体y的亲和力通常可用解离常数(kd)来表述。亲和力可通过本领域已知的常用方法来测量，包括本文中所描述的那些方法。下文记述了用于测量结合亲和力的具体举例说明的和示例性的实施方案。“融合蛋白”是指具有共价连接在一起的两部分的多肽，其中每个部分来源于不同的蛋白。这两个部分可以通过单一肽键直接连接或通过包含一个或多个氨基酸残基的肽接头连接。通常，这两个部分和接头彼此处在一个阅读框中，并且使用重组技术产生。“病症”或“病理病况”是能够受益于本发明的物质/分子或方法的任意病况。这包括慢性和急性病症或疾病，包括使哺乳动物易受讨论病症的影响的病理病况。本文中待治疗的病症的非限制性的实例包括神经病症。术语“神经病症”或“神经疾病”是指或描述哺乳动物的中枢和/或周围神经系统的疾病或病症。神经病症的实例包括但不限于下述列表的疾病和病症。神经病病症是特征在于不适当的或不受控制的神经信号传导或缺乏神经信号传导的神经系统疾病或异常，并且包括但不限于，慢性疼痛，包括感受伤害的疼痛(由对身体组织的损伤引起的疼痛，包括癌相关的疼痛)，神经性疼痛(由神经、脊髓或脑中的异常引起的疼痛)，和精神性疼痛(完全或大部分相关于心理障碍)，头痛，偏头痛(migraine)，神经病，以及常常伴随这样的神经病病症的症状和综合征如眩晕或恶心。淀粉状变性是一组与在cns中的细胞外蛋白质沉积相关的疾病和病症，其包括但不限于，继发性淀粉状变性，年龄相关性淀粉状变性，阿尔茨海默病(ad)，轻度认知损伤(mildcognitiveimpairment，mci)，雷维小体痴呆，唐氏综合征，遗传性脑出血伴淀粉状变性(荷兰型)；关岛帕金森-痴呆并发症，脑淀粉状血管病，亨廷顿病，进行性核上性麻痹，多发性硬化；克-雅病，帕金森病，传染性海绵状脑病，hiv相关痴呆，肌萎缩性脊髓侧索硬化症(als)，包涵体肌炎(inclusion-bodymyositis，ibm)，和涉及β-淀粉状蛋白沉积的眼病(即，黄斑变性，玻璃疣相关视神经病变和白内障(cataract))。cns的癌症特征在于一个或多个cns细胞(即，神经细胞)的异常增殖，并且包括但不限于，胶质瘤(glioma)，多形性胶质母细胞瘤(glioblastomamultiforme)，脑膜瘤(meningioma)，星细胞瘤(astrocytoma)，听神经瘤(acousticneuroma)，软骨瘤(chondroma)，少突神经胶质瘤(oligodendroglioma)，成神经管细胞瘤(medulloblastomas)，神经节神经胶质瘤(ganglioglioma)，神经鞘瘤(schwannoma)，神经纤维瘤(neurofibroma)，成神经细胞瘤(neuroblastoma)和硬膜外、髓内或硬膜内肿瘤。眼疾病或病症是眼睛的疾病或病症，为本文的目的，眼睛被视为受制于bbb的cns器官。眼病或病症包括但不限于，巩膜、角膜、虹膜和睫状体的病症(即，巩膜炎(scleritis)、角膜炎(keratitis)、角膜溃疡(cornealulcer)，角膜擦伤(cornealabrasion)，雪盲(snowblindness)，电光性眼炎(arceye)，thygeson浅层点状角膜病变(thygeson’ssuperficialpunctatekeratopathy)，角膜新生血管化(cornealneovascularisation)，富克斯营养不良(fuchs’dystrophy)，圆锥形角膜(keratoconus)，干燥性角膜结膜炎(keratoconjunctivitissicca)，虹膜炎(iritis)和葡萄膜炎(uveitis))，晶状体的病症(即，白内障(cataract))，脉络膜和视网膜的病症(即，视网膜脱离(retinaldetachment)，视网膜劈裂症(retinoschisis)，高血压性视网膜病变(hypertensiveretinopathy)，糖尿病视网膜病变(diabeticretinopathy)，视网膜病(retinopathy)，早产儿视网膜病，老年性黄斑变性(age-relatedmaculardegeneration)，黄斑变性(maculardegeneration)(湿性或干性)，视网膜外膜(epiretinalmembrane)，色素性视网膜炎(retinitispigmentosa)和黄斑水肿(macularedema))，青光眼(glaucoma)，悬浮物(floaters)，视神经和视觉通路的病症(即，莱伯遗传性视神经病(leber’shereditaryopticneuropathy)和视觉盘玻璃疣(opticdiscdrusen))，眼肌/双眼移动调节/折射的病症(即，斜视(strabismus)，眼肌瘫痪(ophthalmoparesis)，进行性外部眼肌麻痹(progressiveexternalopthalmoplegia)，内斜视(esotropia)，外斜视(exotropia)，远视(hypermetropia)，近视(myopia)，散光(astigmatism)，屈光不正(anisometropia)，老花眼(presbyopia)和眼肌麻痹(ophthalmoplegia))，视觉障碍和失明(即，弱视(amblyopia)，莱伯先天性黑矇(lever’scongenitalamaurosis)，暗点(scotoma)，色盲(colorblindness)，全色盲(achromatopsia)，夜盲症(nyctalopia)，失明(blindness)，河盲(riverblindness)和微眼炎/缺损(micro-opthalmia/coloboma))，红眼，阿盖耳罗伯逊瞳孔(argyllrobertsonpupil)，角膜真菌病(keratomycosis)，干眼病(xerophthalmia)和无虹膜(aniridia)。cns的病毒或微生物感染包括但不限于由以下引起的感染，病毒(即，流感，hiv，脊髓灰质炎病毒，风疹)，细菌(即，奈瑟氏球菌属物种(neisseriasp.)，链球菌属物种(streptococcussp.)，假单胞菌属物种(pseudomonassp.)，变形菌属物种(proteussp.)，大肠杆菌(e.coli)，金黄色葡萄球菌(s.aureus)，肺炎球菌属物种(pneumococcussp.)，脑膜炎球菌属物种(meningococcussp.)，嗜血杆菌属物种(haemophilussp.)和结核分枝杆菌(mycobacteriumtuberculosis))和其他微生物如真菌(即，酵母，新型隐球菌(cryptococcusneoformans))，寄生虫(即，弓形虫(toxoplasmagondii))或变形虫(amoebas)，其导致cns病理生理学，包括但不限于，脑膜炎，脑炎，脊髓炎，血管炎和脓肿(abscess)，其可以是急性的或慢性的。cns的炎症是这样的炎症，其由对cns的损伤导致，所述损伤可以是物理损伤(即，由于事故，手术，脑创伤，脊髓损伤，脑震荡(concussion)所致的)或由于或相关于一种或多种cns的其他疾病或病症(即，脓肿，癌症，病毒或微生物感染)的损伤。当用于本文中时，cns的缺血是指一组这样的病症，其相关于脑部的异常血流或血管行为或其病因，并且包括但不限于，局部脑缺血(focalbrainischemia)，全局脑缺血(globalbrainischemia)，卒中(即，蛛网膜下出血(subarachnoidhemorrhage)和脑内出血(intracerebralhemorrhage))，和动脉瘤(aneurysm)。神经退行性疾病是一组这样的疾病和病症，其与cns中神经细胞丧失功能或死亡相关，并且包括但不限于，肾上腺脑白质营养不良(adrenoleukodystrophy)，亚历山大病，阿尔珀斯病(alper’sdisease)，肌萎缩性侧索硬化，运动失调性毛细血管扩张症(ataxiatelangiectasia)，batten病(battendisease)，科凯恩综合征，基层皮质变性(corticobasaldegeneration)，由淀粉状变性引起或与其相关的变性，弗里德赖希共济失调症(friedreich’sataxia)，额颞叶变性(frontotemporallobardegeneration)，肯尼迪病(kennedy’sdisease)，多系统萎缩，多发性硬化，原发性侧索硬化，进行性核上性麻痹，脊髓性肌萎缩，横贯性脊髓炎，雷夫叙姆病(refsum’sdisease)和脊髓小脑性共济失调。cns的发作疾病和病症涉及cns中的不适当和/或异常电导，并且包括但不限于，癫痫(epilepsy)(即，失神发作(absenceseizures)，失张力发作(atonicseizures)，良性运动性癫痫(benignrolandicepilepsy)，儿童期失神(childhoodabsence)，阵挛发作(clonicseizures)，复杂部分发作(complexpartialseizures)，额叶性癫痫(frontallobeepilepsy)，发热性癫痫发作(febrileseizures)，婴儿痉挛(infantilespasms)，少年肌阵挛性癫痫(juvenilemyoclonicepilepsy)，青少年期失神癫癎(juvenileabsenceepilepsy)，伦-格综合征(lennox-gastautsyndrome)，兰-克综合征(landau-kleffnersyndrome)，dravet综合征(dravet’ssyndrome)，otahara综合征(otaharasyndrome)，west综合征(westsyndrome)，肌肉阵挛性发作(myoclonicseizures)，线粒体病(mitochondrialdisorders)，进行性肌阵挛性癫痫(progressivemyoclonicepilepsies)，精神性发作(psychogenicseizures)，反射性癫痫(reflexepilepsy)，rasmussen综合征(rasmussen′ssyndrome)，简单部分发作(simplepartialseizures)，继发性全身性癫痫发作(secondarilygeneralizedseizures)，颞叶癫痫(temporallobeepilepsy)，阵挛性发作(toniclonicseizures)，强直发作(tonicseizures)，精神运动发作(psychomotorseizures)，边缘叶癫痫(limbicepilepsy)，部分性癫痫发作(partial-onsetseizures)，全身发作性癫痫发作(generalized-onsetseizures)，癫痫持续状态(statusepilepticus)，腹型癫痫(abdominalepilepsy)，失神型发作(akineticseizures)，植物神经性发作(autonomicseizures)，大量双侧肌阵挛(massivebilateralmyoclonus)，月经性癫痫(catamenialepilepsy)，跌倒发作(dropseizures)，情绪性发作(emotionalseizures)，病灶性发作(focalseizures)，发笑发作(gelasticseizures)，贾克森扩布(jacksonianmarch)，拉福拉病(laforadisease)，运动性发作(motorseizures)，多病灶性发作(multifocalseizures)，夜发作(nocturnalseizures)，光敏性发作(photosensitiveseizure)，假性发作(pseudoseizures)，感觉性发作(sensoryseizures)，微小发作(subtleseizures)，sylvan发作(sylvanseizures)，戒断发作(withdrawalseizures)和视反射发作(visualreflexseizures))。行为障碍是这样的cns病症，其特征为就受折磨的受试者而言的异常行为，并且包括但不限于，睡眠障碍(sleepdisorders)(即，失眠(insomnia)，深眠状态(parasomnias)，夜惊(nightterrors)，昼夜节律睡眠障碍(circadianrhythmsleepdisorders)，和发作性睡病(narcolepsy))，心境障碍(mooddisorders)(即，抑郁(depression)，自杀性抑郁(suicidaldepression)，焦虑(anxiety)，慢性情感障碍(chronicaffectivedisorders)，恐怖病(phobias)，惊恐发作(panicattacks)，强迫性障碍(obsessive-compulsivedisorder)，注意力缺陷伴多动障碍(attentiondeficithyperactivitydisorder，adhd)，注意缺陷障碍(attentiondeficitdisorder，add)，慢性疲劳综合征(chronicfatiguesyndrome)，广场恐怖症(agoraphobia)，创伤后应激障碍(post-traumaticstressdisorder)，双相性精神障碍(bipolardisorder))，进食障碍(即，厌食症(anorexia)或贪食症(bulimia))，精神病(psychoses)，发育行为障碍(developmentalbehavioraldisorders)(即，自闭症(autism)，雷特综合征(rett’ssyndrome)，aspberger综合征(aspberger’ssyndrome))，人格障碍和精神障碍(即，精神分裂症(schizophrenia)，妄想障碍(delusionaldisorder)等)。溶酶体贮积症(lysosomalstoragedisorders)是代谢病症，在一些情况中其与cns相关或具有cns特异性症状；这样的病症包括但不限于泰-萨克斯病(tay-sachsdisease)，戈谢病(gaucher’sdisease)，法布里病(fabrydisease)，粘多糖贮积症(i，ii，iii，iv，v，vi和vii型)，糖原贮积病(glycogenstoragedisease)，gm1神经节苷脂贮积症(gm1-gangliosidosis)，异染性脑白质病变(metachromaticleukodystrophy)，farber病(farber’sdisease)，卡纳范脑白质营养不良(canavan’sleukodystrophy)和1型和2型神经元蜡样脂褐素沉积症(neuronalceroidlipofuscinoses)，尼曼-皮克病(niemann-pickdisease)，pompe病(pompedisease)和克拉伯病(krabbe’sdisease)。用于本文时，“治疗”指在尝试改变待治疗的个体或细胞的天然进程中的临床干预，并且可以为了预防或在临床病理学的进程中进行。治疗的理想效果包括但不限于防止疾病发生或复发，缓和症状，消除疾病的任何直接或间接病理学后果，防止转移，减少疾病进展速率，改善或减轻疾病状态，和症状缓解或改善的预后。在一些实施方案中，将本发明的调节性化合物用于延缓疾病或病症的发展。“个体”或“受试者”是哺乳动物。哺乳动物包括但不限于，家养动物(例如，牛，羊，猫，狗和马)，灵长类动物(例如，人和非人灵长类动物如猴)，兔以及啮齿类动物(例如，小鼠和大鼠)。在某些实施方案中，个体或受试者是人。″有效量″是指在需要的剂量和时间阶段有效获得所需的治疗或预防结果的量。本发明的物质/分子、激动剂或拈抗剂的“治疗有效量”可以按照诸如个体的疾病状态、年龄、性别和体重、以及所述物质/分子、激动剂或拈抗剂在所述个体中激发需要的反应的能力而变化。治疗有效量也是这样的量：其中治疗有益效果超过了所述物质/分子、激动剂或拈抗剂的任意毒性或有害的作用。“预防有效量”是指在需要的剂量和时间阶段有效获得需要的预防结果的量。典型地，但不是必需地，由于预防剂量是在疾病之前或在疾病的早期阶段用于受试者，因此，所述预防有效量将少于治疗有效量。术语“药物制剂”指这样的制剂，其以允许包含在其中的活性成分的生物活性有效的形式存在，并且不包含对施用所述制剂的受试者具有不可接受的毒性的另外的成分。“药用载体”是指药物制剂中除活性成分之外的成分，其对受试者是无毒的。药用载体包括但不限于缓冲剂、赋形剂、稳定剂或防腐剂。术语“包装说明书”用于指通常包括在治疗产品的商品包装中的使用说明，其包含关于适应证、用法、剂量、给药、组合疗法、禁忌症的信息和/或关于使用这样的治疗产品的警告。术语“细胞毒性剂”用在本发明中指抑制或防止细胞功能和/或引起细胞死亡或破坏的物质。细胞毒性剂包括但不限于：放射性同位素(例如，at211，i131，i125，y90，re186，re188，sm153，bi212，p32，pb212和lu的放射性同位素)；化疗剂或药物(例如，甲氨蝶呤(methotrexate)，阿霉素(adriamicin)，长春花生物碱(vincaalkaloids)(长春新碱(vincristine)，长春碱(vinblastine)，依托泊苷(etoposide))，多柔比星(doxorubicin)，美法仑(melphalan)，丝裂霉素c(mitomycinc)，苯丁酸氮芥(chlorambucil)，柔红霉素(daunorubicin)或其它嵌入剂)；生长抑制剂；酶及其片段如核酸水解酶；抗生素；毒素如小分子毒素或细菌、真菌、植物或动物来源的酶促活性毒素，包括其片段和/或变体；和下面公开的各种抗肿瘤或抗癌剂。发明的组合物和方法a.本发明的肽和多肽在一方面中，本发明部分基于结合bace1并且降低和/或抑制bace1活性的肽/多肽。在某些实施方案中，提供结合到bace1的活性位点或外结合位点的抗体。本发明的bace1结合肽包括表2和图2中所述的那些。本发明还提供突变体或变体肽，其残基的任一个可以由这些肽的相对应的残基改变，同时仍然编码保留抑制活性的肽。在一个实施方案中，结合肽/多肽的变体与参比结合肽/多肽具有至少50％，60％，70％，80％，90％，95％，98％，99％的氨基酸序列同一性。通常，所述变体表现出与参比结合肽/多肽基本上相同的或更大的结合亲和力，例如，基于本领域接受的结合测定定量单位/计量，是参比结合肽/多肽的结合亲和力的至少0.75x，0.8x，0.9x，1.0x，1.25x或1.5x。通常，本发明的变体包括这样的变体，其中序列中特定位置的残基被其他氨基酸置换，并且还包括在亲本肽/多肽的两个残基之间插入另外一个或多个残基的可能性以及从亲本序列删除一个或多个残基或向亲本序列中添加一个或多个残基的可能性。本发明包括任意的氨基酸置换、插入或缺失。在特定的情形中，所述置换是如本文所述的保守置换。“百分比(％)氨基酸序列同一性”定义为比对两条序列时与参比(亲本)多肽序列中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分数。为了确定％氨基酸同一性，比对序列，并且，如果需要，导入空位以获取最大％序列同一性；不将保守置换视为序列同一性的部分。确定百分比同一性的氨基酸序列比对方法是本领域技术人员已知的。通常使用公众可得到的计算机软件如blast、blast2、align2或megalign(dnastar)软件来比对肽序列。本领域技术人员可以决定测量比对的适宜参数，包括对所比较的序列全长获得最大比对所需的任何算法。当比对氨基酸序列时，给定的氨基酸序列a相对于、与或针对给定的氨基酸序列b的％氨基酸序列同一性(或者可以这样说：给定氨基酸序列a具有或含有相对于、与或针对给定氨基酸序列b的特定的％氨基酸序列同一性)可以如下计算：％氨基酸序列同一性＝x/y′100其中x是用a和b的序列比对程序或算法比对中评分为相同匹配的氨基酸残基数，并且y是b中的氨基酸残基总数。如果当氨基酸序列a的长度与氨基酸序列b的长度不相等，则a相对于b的％氨基酸序列同一性将不等于b相对于a的％氮基酸序列同一性。“分离的”或“纯化的”肽、多肽、蛋白或生物活性片段与其天然环境的成分分开和/或回收。污染成分包括通常会干扰该多肽的诊断或治疗用途的物质，可能包括酶、激素、和其它蛋白质性质或非蛋白质性质的物质。具有优选少于30干重％的不需要的污染物质(污染物)、优选少于20％、10％且优选少于5％的污染物的制剂认为是基本上分离的。分离的、重组产生的肽/多肽或其生物活性部分优选基本上不含培养基，即，培养基占优选少于20％、优选少于约10％且优选少于约5％的肽/多肽制剂的体积。污染物的实例包括细胞碎片、培养基和在体外合成所述肽/多肽过程中所用的和产生的物质。肽/多肽的保守置换在表a中以“优选的置换”的标题显示。如果这样的置换导致生物活性改变，那么可以引入表a中命名为“示例性置换”的更多实质性变化，且如下文关于氨基酸种类进一步描述，并筛选产物。表1原始残基示例性置换优选的置换ala(a)val；leu；ilevalarg(r)lys；hislysasn(n)gln；his；asp，lys；argglnasp(d)glu；asnglucys(c)ser；alasergln(q)asn；gluasnglu(e)asp；glnaspgly(g)alaalahis(h)asn；gln；lys；argargile(i)leu；val；met；ala；phe；正亮氨酸leuleu(l)正亮氨酸；ile；val；met；ala；pheilelys(k)arg；gln；asnargmet(m)leu；phe；ileleuphe(f)trp；leu；val；ile；ala；tyrtyrpro(p)alaalaser(s)thrthrthr(t)val；sersertrp(w)tyr；phetyrtyr(y)trp；phe；thr；serpheval(v)ile；leu；met；phe；ala；正亮氨酸leu可根据常见侧链特性将氨基酸分组：(1)疏水性：正亮氨酸，met，ala，val，leu，ile；(2)中性亲水性：cys，ser，thr，asn，gln；(3)酸性：asp，glu；(4)碱性：his，lys，arg；(5)影响链取向的残基：gly，pro；(6)芳香性：trp，tyr，phe。氨基酸还可以根据常见的测量尺寸进行分组，例如，分成小氨基酸(glyala，ser，pro，thr，asp，asn)或大体积疏水氨基酸(met，ile，leu)。肽/多肽的生物特性的实质性修饰通过选择这样的置换而实现，所述置换在其对维持下列各项的作用方面显著不同：(a)在所述置换区的多肽骨架的结构，例如，作为折叠或螺旋构象，(b)在靶位点处分子的电荷或疏水性，或(c)侧链的大小。非保守性置换将需要将这些种类中的一类的成员与另一种类交换。在其他实施方案中，本发明的肽或多肽可以包含一个或多个非天然存在的或修饰的氨基酸。“非天然存在的氨基酸残基”是指不同于上文列出的那些天然存在的氨基酸残基的残基，其能够共价结合多肽链中的相邻的氨基酸残基。非天然氨基酸包括但不限于，高赖氨酸，高精氨酸，高丝氨酸，铃兰氨酸，2-氨基己二酸，3-氨基己二酸，β-丙氨酸，氨基丙酸，2-氨基丁酸，4-氨基丁酸，6-氨基己酸，2-氨基庚酸，2氨基异丁酸，3-氨基异丁酸，2-氨基庚二酸，叔丁基甘氨酸，2，4-二氨基异丁酸，锁链素，2，2’-二氨基庚二酸，2，3-二氨基丙酸，n-乙基甘氨酸，n-乙基天冬酰胺，高脯氨酸，羟基赖氨酸，别-羟基赖氨酸，3-羟基脯氨酸，4-羟基脯氨酸，异锁链素，别-异亮氨酸，n-甲基丙氨酸，n-甲基甘氨酸，n-甲基异亮氨酸，n-甲基戊基甘氨酸，n-甲基缬氨酸，naphthalanine，正缬氨酸，正亮氨酸，鸟氨酸，瓜氨酸，戊基甘氨酸，哌可酸和硫代脯氨酸。修饰的氨基酸包括天然的和非天然的氨基酸，在在其n端氨基基团或其侧链基团被可逆地或不可逆地化学封闭或修饰，诸如例如，n甲基化的d和l氨基酸，其侧链官能团被化学修饰为另一种官能团。例如，修饰的氨基酸包括甲硫氨酸亚砜；甲硫氨酸砜；天冬氨酸-(β-甲酯)，天冬氨酸的修饰的氨基酸；n-乙基甘氨酸，甘氨酸的修饰的氨基酸；或丙氨酸羧酰胺(alaninecarboxamide)和丙氨酸的修饰的氨基酸。另外的非天然和修饰的氨基酸，以及将其结合到蛋白和肽中的方法在本领域中是已知的(参见，例如，sandberg等，(1998)j.med.chem.(医学化学杂志)41：2481-91；xie和schultz(2005)curr.opin.chem.biol.(现代化学生物学观点)9：548-554；hodgson和sanderson(2004)chem.soc.rev.(化学学会综述)33：422-430)。b.载体构建编码本文所述的肽和多肽的多核苷酸序列可以使用标准的合成和/或重组技术获得。可以从适当来源的细胞分离需要的多核苷酸序列并且测序。用于抗体的来源细胞包括产生抗体的细胞，如杂交瘤细胞。备选地，可以使用核苷酸合成仪或pcr技术合成多核苷酸。一旦获得，将编码所述肽或多肽的序列插入到能够在宿主细胞中复制并表达异源多核苷酸的重组载体中。本领域可用的和已知的多种载体可以用于本发明目的。选择适当的载体主要取决于要插入到载体中的核酸的尺寸和要转化所述载体的特定的宿主细胞。取决于其功能(扩增或表达异源多核苷酸，或二者)及其与其停留在其中的特定宿主细胞的互补性，每个载体包含多种成分。载体成分通常包括但不限于：复制起点(特别是当载体插入到原核细胞中时)、选择标记基因、启动子、核糖体结合位点(rbs)、信号序列、异源核酸插入物和转录终止序列。通常，包含来源于物种的与宿主细胞相容的复制子和控制序列的质粒载体与这些宿主联合使用。载体通常携带复制位点，以及能够在转化的细胞中提供表型选择的标记序列。例如，大肠杆菌(e.coli)通常用来源于大肠杆菌物种的质粒pbr322转化。pbr322包含编码氨苄青霉素(amp)和四环素(amp)抗性的基因，并且因此提供鉴定转化的细胞的容易的方法。pbr322、其衍生物或其他微生物质粒或噬菌体还可以包含或者被修饰从而包含可以被所述微生物生物体用来表达内源性蛋白的启动子。另外，包含与宿主微生物相容的复制子和控制序列的噬菌体载体可以用作与这些宿主联系使用的转化载体。例如，诸如.λ.gfmtm-11的噬菌体可以用于制备能够用于转化敏感宿主细胞诸如大肠杆菌le392的重组载体。组成型或诱导型的启动子可用于本发明，按照具体情形的需要，这可以由本领域技术人员来确定。由多种潜在的宿主细胞识别的大量的启动子是公知的。通过限制性酶消化去除源dna的启动子，并且将分离的启动子序列插入到选择的载体中，可以将所选择的启动子可操作地与编码本文所述的多肽的顺反子dna连接。天然启动子序列和多种异源启动子序列都可以用来引导靶基因的扩增和/或表达。然而，优选异源启动子，原因在于，与天然的靶多肽启动子相比，其通常允许更多的转录和所表达的靶基因的更高的产率。适合与原核宿主一起使用的启动子包括phoa启动子，.β.-半乳糖苷酶(β-galactamase)和乳糖启动子系统，色氨酸(trp)启动子系统和杂化的启动子诸如tac或trc启动子。然而，在细菌中起作用的其他启动子(诸如其他已知的细菌或噬菌体启动子)也是适合的。其核苷酸序列已经公布，由此允许技术人员使用提供任意需要的限制性位点的接头或衔接子将其可操作性地连接到编码靶标轻链和重链的顺反子上(siebenlist等(1980)cell(细胞)20：269)。在一些实施方案中，重组载体中的每个顺反子包含指导所表达的多肽穿过膜易位的分泌信号序列元件。一般地，信号序列可以是载体的元件，或者其可以是插入到载体中的靶多肽dna的一部分。为本发明的目的选择的信号序列荧光是由宿主细胞识别和加工(即，通过信号肽切割)的一种信号序列。对于原核宿主细胞，其不识别和加工异源多肽本身所有的信号序列，该信号序列替换为原核信号序列，例如，其选自由下列组成的组：碱性磷酸酶，青霉素酶，ipp，或热稳定性肠毒素ii(stii)前导物，lamb，phoe，pelb，ompa和mbp。适于表达多肽的原核宿主细胞包括古细菌(archaebacteria)和真细菌(eubacteria)，诸如革兰氏阴性或革兰氏阳性微生物。可用的细菌的实例包括埃希氏菌属(escherichia)(例如，大肠杆菌)，杆菌(例如，枯草芽孢杆菌(b.subtilis))，肠细菌(enterobacteria)，假单胞菌属(pseudomonas)物种(例如，铜绿假单胞菌(p.aeruginosa))，鼠伤寒沙门氏菌(salmonellatyphimurium)，粘质沙雷氏菌(serratiamarcescans)，克雷伯氏菌属(klebsiella)，变形菌属(proteus)，志贺菌属(shigella)，根瘤菌属(rhizobia)，透明颤菌属(vitreoscilla)或副球菌属(paracoccus)。优选地，使用革兰氏阴性细胞。优选地，宿主细胞应该分泌少量蛋白水解酶，并且可能需要在细胞培养物中加入另外的蛋白酶抑制剂。c.肽或多肽产生将宿主细胞转化或转染上述表达载体并且在已被改进适于诱导启动子、选择转化体或扩增编码需要的序列的基因的常规培养基中培养。转染是指由宿主细胞摄取表达载体，不管实际上是否表达任意的编码序列。多种转染方法是本领域普通技术人员已知的，例如，capo4沉淀法和电穿孔法。通常在宿主细胞中发生操作该载体的任意指示时认识到转染的成功。转化意指将dna引入到原核宿主中，从而是dna作为染色体外元件或染色体成分而复制。取决于所用的宿主细胞，转化使用适于所述细胞的标准技术进行。使用氯化钙的钙处理通常用于含有大量细胞壁屏障的细菌细胞。另一种转化方法利用聚乙二醇/dmso。所用的另一种技术是电穿孔。用于产生本发明的多肽的原核细胞在本领域已知的且适于培养所选择的宿主细胞的培养基中生长。适宜的培养基的实例包括luria肉汤(lb)加必需的营养补充物。在优选的实施方案中，培养基还包含基于表达载体的构建而选择的选择试剂，以选择性允许含有表达载体的原核细胞生长。例如，向培养基中加入氨苄青霉素用于表达氨苄青霉素抗性基因的细胞的生长。除了碳、氮和无机磷酸来源之外，还可以包括适当浓度的任意需要的补充物，单独引入或作为与另一只补充物或培养基的混合物引入，诸如符合氮源。任选地，培养基可以包含一种或多种选自由下述组成的组的还原剂：谷胱甘肽，半胱氨酸，胱胺，硫胶质，二硫丁四醇和二硫苏糖醇。原核宿主细胞在适当的温度培养。对于大肠杆菌生长，例如，优选的温度是在约20℃-约39℃的范围内，更优选约25℃-约37℃，甚至更优选约30℃。培养基的ph可以是约5-约9范围内的任意ph，这主要取决于宿主生物体。对于大肠杆菌，ph优选为约6.8-约7.4，并且更优选为约7.0。如果在表达载体中使用诱导型启动子，则在适于激活所述启动子的条件下诱导蛋白表达。例如，如果使用phoa启动子来控制转录，则转化的宿主细胞可以在磷酸盐限制性培养基中培养用于诱导。根据所用的载体构建体，可以使用多种其他的诱导剂，这是本领域已知的。在微生物中表达的本文所述的多肽可以分泌到宿主细胞的周质中并且从中回收。蛋白回收典型地包括分解微生物，通常通过诸如渗压休克(osmoticshock)、超声或裂解的方式进行。一旦细胞被分解，则可以通过离心或过滤除去细胞碎片或全细胞。蛋白可以进一步纯化，例如，通过亲和树脂层析纯化。备选地，蛋白可以被转运到培养基中并且从中分离。可以从培养物中去除细胞，并且过滤并浓缩培养物上清液，以进一步纯化所产生的蛋白。表达的多肽可以使用常规已知的方法诸如在免疫亲和或离子交换柱上分级分离；乙醇沉淀；反相hplc；在二氧化硅上或在阳离子交换树脂如deae上层析；色谱聚焦；sds-page；硫酸铵沉淀；例如使用sephadexg-75的凝胶过滤；疏水亲和树脂，使用固定在基质上的适当的抗原的配体亲和和蛋白质印迹测定进一步分离和鉴定。除了原核宿主细胞之外，本领域中也充分建立了真核宿主细胞系统。适当的宿主包括哺乳动物细胞系，诸如cho，和昆虫细胞，诸如下文描述的那些。d.多肽/肽纯化产生的多肽/肽可以进行纯化以获得对于进一步的测定和应用基本上是均质的制剂。可以使用本领域中已知的的标准蛋白纯化方法。下述方法是适宜的纯化方法的示例：在免疫亲和或离子交换柱上分级分离，乙醇沉淀，反相hplc，在二氧化硅上或在阳离子交换树脂如deae上层析，色谱聚焦，sds-page，硫酸铵沉淀，以及例如使用sephadexg-75的凝胶过滤。e.bace1调节剂的鉴定和表征-一般方法可以通过本领域已知的多种方法中的任一种鉴定候选bace1调节剂，例如，结合肽。调节剂的调节特征可以通过确定所述调节剂调节bace1与其结合配偶体(诸如底物app、或本发明的结合多肽)之间的相互作用的能力来评估。一种重要的特征是结合亲和力。目的候选调节剂(例如肽)的结合特征可以以本领域已知的多种方法中的任一种进行评估。所述调节剂的抑制特征可以通过确定所述调节剂抑制bace1的生物活性(例如，蛋白水解活性)的能力来评估。方法中的起始步骤可以包括产生一种或多种包含目的序列的候选肽，然后在适于确定其bace1结合特征的条件下进行展示。例如，候选肽可以作为肽的羧基端(c端)展示文库展示在噬菌体或噬菌粒表面上，例如，使用与外壳蛋白如p3或p8的蛋白融合体展示在丝状噬菌体(噬菌粒)表面上。c端展示在本领域中是已知的。例如，参见jespers等，biotechnology(生物技术)(ny).13：378-82和wo00/06717。这些方法可以用于制备本发明的融合基因、融合蛋白、载体、重组噬菌体文库、宿主细胞及其文库。如本文所述，在一些实施方案中，将候选肽作为肽的氨基端(n端)展示文库展示在噬菌体或噬菌粒表面上也可以是可行的。n端噬菌体(噬菌粒)展示的方法包括本文所述的那些，和本领域公知的那些，例如，如在美国专利号5,750,373(及其中引用的参考文献)中所述。肽文库在本领域中是公知的，并且也可以按照本领域方法制备。例如，参见clark等，美国专利号6,121,416。与异源蛋白成分如噬菌体外壳蛋白融合的肽的文库在本领域中是公知的，例如，如clark等，同前所述中所述。表征通过这些方法获得的结合剂分子的方法也是本领域中已知的，包括上文引用的参考文献中公开的那些(jespers等，wo00/06717&美国专利号5,750,373)和本文所述的那些。第一肽结合剂的变体可以通过筛选所述肽的突变体以获得目的特征(例如，增强的靶标结合亲和力、增强的药物代谢动力学、减少的毒性、改善的治疗指数等)而产生。诱变技术是本领域公知的。此外，扫描诱变技术(诸如基于丙氨酸扫描的那些)可以特别有助于评估肽内单个氨基酸残基的结构和/或功能重要性。1.分离针对bace1的结合噬菌体将具有展示的候选bace1结合肽的噬菌体展示文库在体外与bace1蛋白或融合蛋白接触，以确定该文库中与bace1靶标结合的那些成员。可以使用技术人员已知的任何方法来评估体外蛋白结合。例如，可以进行1、2、3或4轮或更多轮结合选择，之后分离单个噬菌体，并且任选地，在噬菌体elisa中分析。可以使用噬菌体elisa确定肽-展示噬菌体颗粒与固定的bace1靶蛋白的结合亲和力(barrett等，(1992)analbiochem.(年度生物化学)204：357-64)。在评估候选子与已知的bace1结合剂竞争与bace1结合的能力的情形中，提供适当的结合竞争条件。例如，在一个实施方案中，在存在一种或多种浓度的已知的bace1结合剂的条件下进行筛选/选择/生物淘选。在另一个实施方案中，可以随后在存在已知的bace1结合剂的条件下在竞争性elisa测定中评估从所述文库分离的候选结合剂。2.bace1的制备bace1可以利用常规合成或重组技术便利地作为纯化的蛋白或蛋白片段(例如，bace1的细胞外结构域，残基22-457，残基43-453或残基57-453)或作为融合多肽产生。融合多肽可用在噬菌体(噬菌粒)展示中(其中bace1是结合的靶标)，用在表达研究、细胞定位、生物测定、elisas(包括结合竞争测定)等中。bace1“嵌合蛋白”或“融合蛋白”包含与不相关的多肽融合的bace1。bace1融合蛋白可以包含bace1的任一部分至完整序列，包括任意多的生物活性部分。然后，可以按照已知的方法使用亲和层析和与非-bace1多肽结合的捕获试剂纯化该融合蛋白。bace1可以与亲和序列融合，例如，与gst(谷胱甘肽s转移酶)序列的c端融合。所述融合蛋白促进重组bace1的纯化，例如，使用与固体支持物结合的和/或连接在固体支持物(例如，用于肽筛选/选择/生物淘选的基质)上的谷胱甘肽的纯化。利用重组方法可以容易地产生融合蛋白。编码bace1(或其部分)的核酸可以在bace1n端、c端或中间与非-bace1编码核酸符合阅读框融合。也可以通过常规技术，包括自动化dna合成仪，来合成融合基因。还可以利用使用锚定引物的pcr扩增，所述锚定引物产生两个连续的基因片段之间的互补突出端，其随后可以退火并且重新扩增而产生嵌合的基因序列(ausubel等，currentprotocolsinmolecularbiology(现代分子生物学方法).johnwiley&sons，纽约1987)。许多促进符合阅读框地亚克隆bace1或其部分成为融合蛋白的载体是可商购的。本领域技术人员应该理解，多种变异可以实现分离的bace1蛋白的目的并且可以用于本发明。例如，可以按上文所述构建bace1和表位标签的融合体，并且该标签用于亲和纯化bace1。还可以不用任何融合体而制备bace1蛋白或其部分；另外，不使用微生物载体来产生蛋白，可以另外使用体外化学合成。其他细胞可以用来产生bace1蛋白或其部分，诸如其他细菌、哺乳动物细胞(如cos)或杆状病毒系统。产生多种融合体的宽泛种类的多核苷酸载体也是可用的。bace1融合蛋白的最终纯化通常取决于融合配偶体；例如，多组氨酸标签融合体可以在镍柱上纯化。3.确定所展示的肽的序列以需要的特征结合bace1(并且任选地，不结合不相关的序列)的噬菌体(噬菌粒)可以进行序列分析。在宿主细胞中扩增展示候选结合肽的噬菌体(噬菌粒)颗粒，分离dna，并且使用任何适当的已知的测序技术对基因组的适当部分(编码该候选肽)测序。4.确定bace1结合多肽中的关键残基丙氨酸扫描bace1结合肽序列的丙氨酸扫描可以用来确定肽中每个残基对bace1结合和/或抑制的相对贡献。为了确定bace1配体中的关键残基，将残基替换为单个氨基酸，典型地替换为丙氨酸残基，并且评估对bace1结合和活性的作用。参见美国专利号5,580,723；美国专利号5,834,250；以及实施例。剪截体(缺失系列)bace1结合肽的剪截体不但可以阐明结合的关键残基，而且确定实现结合的最短的肽长度。在一些情形中，剪截体将揭示比天然配体更紧密结合的配体；这样的肽可用于调节bace1：配体相互作用。优选地，制备一系列的bace1结合肽剪截体。一个系列将顺序地剪截氨基端氨基酸；在另一个系列中，剪截将在羧基端开始。当在用于丙氨酸扫描的情形中，肽可以在体外合成或通过重组方法制备。合理的调节剂设计基于由丙氨酸扫描和剪截体分析获得的信息，技术人员能够设计并且合成小分子，或者选择富含可能调节结合的化合物的小分子文库。例如，基于实施例中所述的信息，可以设计调节剂肽使其包含2个适当间隔的半胱氨酸残基和“精氨酸指”。5.结合测定形成bace1结合肽与bace1的复合物促进该复合的形式与其未复合的形式和与杂质的分离。bace1：结合配体复合物可以在溶液中形成，或者其中一个结合配偶体结合在不溶性支持物上。复合物可以从溶液中分离，例如，使用柱层析分离，并且可以使用公知技术通过过滤、离心等分离而结合在固体支持物上。bace1多肽或其配体与固体支持物的结合促进高通量测定。可以在存在和不存在候选结合化合物的条件下筛选测试化合物调节(例如，抑制)结合剂多肽与bace1的相互作用的能力，并且筛选可以在任意适当的容器中，如微量滴定板、试管和微量离心管中完成。还可以制备融合蛋白以促进检测或分离，其中所述融合蛋白包含允许该蛋白中的一个或两个都结合到基质上的另外的结构域。例如，gst-bace1-结合肽融合蛋白或gst-bace1蛋白可以吸附到谷胱甘肽琼脂糖珠(sigmachemical，st.louis，mo.)或谷胱甘肽衍生的微量滴定板上，然后将其与测试化合物组合，并且将混合物在允许复合物形成的条件下(例如，在盐和ph的生理条件下)温育。温育后，洗涤珠子或微量滴定板孔以去除任何未结合的成分，在珠子的情形中基质是固定的，并且直接或间接确定所述复合物。备选地，所述复合物可以与基质解离，并且结合或活性水平利用标准技术来确定。在筛选测定中还可以使用其他用于将蛋白固定到基质上的融合多肽技术。bace1结合肽或bace1可以使用生物素-抗生物素蛋白或生物素-链霉抗生物素蛋白系统固定。生物素酰化可以使用多种试剂实现，诸如生物素-n-羟基-琥珀酰亚胺(nhs；piercechemicals，rockford，ill.)，并且固定在链霉抗生物素蛋白包被的96孔平板(piercechemical)的孔中。备选地，与bace1结合肽或bace1反应但是不干扰结合肽与其靶分子的结合的抗体可以衍生在该平板的孔上，并且未结合的bace1或结合肽通过抗体缀合截留在孔中。除了关于gst-固定的复合物所述的那些之外，检测所述复合物的方法包括使用与结合剂肽或bace1反应的抗体进行的复合物免疫检测。结合测定：竞争性elisa为了评估肽、蛋白或其他bace1配体的结合亲和力，可以使用竞争性结合测定，其中评估配体结合bace1的能力(以及结合亲和力，如果需要的话)，并且与已知与bace1结合的化合物(例如，bace1的拟肽抑制剂，如om99-2，bace1抗体或通过如本文所述的噬菌体展示确定的高亲和力结合肽)的能力相比较。多种方法是已知的，并且可以用于鉴定结合分子(例如，肽、蛋白、小分子等)的结合亲和力；例如，结合亲和力可以使用竞争性elisas确定为ic50值。ic50值定义为结合剂阻断50％的bace1与配体的结合的浓度。例如，在固相测定中，测定平板可以通过用neutravidin、抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白包被微孔板(优选地处理以有效吸附蛋白)而制备。然后，通过加入牛血清白蛋白(bsa)或其他蛋白(例如，非脂奶)的溶液而进行封闭，然后洗涤，优选用含有去污剂如吐温-20的缓冲液洗涤。制备生物素酰化的已知的bace1结合剂(例如，作为与gst或其他此类促进纯化和检测的分子的融合体的噬菌体肽)并且结合在平板上。制备要用bace1检测的分子的系列稀释液并且与结合的结合剂接触。洗涤用固定的结合剂包被的平板，然后向孔中加入每种结合反应液，并且短暂温育。进一步洗涤后，检测结合反应，通常使用识别非-bace1融合配偶体的抗体和识别一级抗体的标记的(诸如辣根过氧化物酶(hrp)、碱性磷酸酶(ap)或荧光标记诸如荧光素)二级抗体进行检测。然后，将该平板用适当的底物(取决于标记)显色，并且定量信号，诸如使用分光光度计平板读数仪定量。可以使用最小二乘法拟合将吸光度信号拟合为结合曲线。因此，可以测量多种分子抑制bace1与已知的bace1结合剂结合的能力。技术人员清楚上述测定的多种变化形式。例如，除了基于链霉抗生物素蛋白的系统之外，bace1结合剂可以化学连接到基底上，或者简单地吸附在基底上。f.活性测定可以通过在体外或在体内测定中检测物质/分子的调节能力而进行对本发明的候选肽或多肽(诸如包含本文公开的结合剂肽的氨基酸序列的肽)调节bace1活性的能力的确定。调节能力可以包括，例如，抑制或减少bace1天冬氨酰蛋白酶活性；或者抑制或减少bace1对app的切割；或者抑制或减少aβ产生。在某些实施方案中，检测本发明的肽/多肽(诸如包含本文公开的结合剂肽的氨基酸序列的肽)的这种生物活性。例如，可以在均相时间分辨荧光htrf测定或微流体毛细管电泳(mce)测定中，如实施例1详细所述，使用合成的底物肽检测bace1蛋白酶活性。简言之，均相时间分辨荧光(htrf)测定可以用来利用淀粉状蛋白前体蛋白bace1切割位点肽测量bace1天冬氨酰蛋白酶活性。例如，bi27肽(生物素-kteeisevnldaefrhdsgyevhhqkl(seqidno：5)，americanpeptidecompany))与用抗-bace抗体预先温育的bace1组合在384-孔平板(proxiplatetm，perkin-elmer)的bace反应缓冲液(50mm乙酸钠，ph4.4和0.1％chaps)中。将蛋白水解反应混合物在环境温度温育75分钟，并且通过在检测缓冲液(200mmtrisph8.0，20mmedta，0.1％bsa和0.8mkf)中加入5μl含有2nm链霉抗生物素蛋白-d2和150nm用铕穴状化合物(europiumcryptate)标记的抗-淀粉状蛋白β抗体的htrf检测混合物而猝灭。最终反应混合物在环境温度温育60分钟，并且使用envision多标记平板读数仪tm(envisionmultilabelplatereadertm，perkin-elmer)以320nm的激发波长和615与665nm的发射波长测量tr-fret信号。mce测定反应可以在标准酶反应中进行，通过加入酶的底物和4x化合物(包含人bace1(细胞外结构域)、淀粉状蛋白前体蛋白β分泌酶活性位点肽(fam-kteeisevnldaefrwkk-conh2(seqidno：20))、50mmnaoacph4.4和0.1％chaps)而起始。在环境温度温育60分钟后，使用在上分析的12-sipper微流体芯片(二者均购自caliperlifesciences)分离每个反应中的产物和底物。通过使用供应商优化软件选择电压和压力而优化产物和底物的分离。使用htswell分析仪软件(htswellanalyzersoftware，caliperlifesciences)由电泳图计算底物转换率。另外，bace1蛋白酶活性可以在表达bace1底物如app的细胞系或在表达bace1底物如人app的转基因小鼠中进行体内检测。另外，可以在动物模型中检测bace1蛋白酶活性。例如，多种神经疾病和病症的动物模型以及检验与这些模型相关的病理过程的相关技术在本领域中是容易获得的。多种生物学病症的动物模型包括非重组的和重组的(转基因)动物。非重组的动物模型包括，例如，啮齿类动物，例如，鼠模型。这些模型可以通过使用标准技术，例如，皮下注射、尾静脉注射、脾移植、腹膜内移植和在肾囊下移植向同系小鼠中引入细胞而产生。体内模型包括卒中/脑缺血模型，神经变性病的体内模型，诸如帕金斯病的小鼠模型；阿尔茨海默病的小鼠模型；肌萎缩侧索硬化的小鼠模型；脊髓性肌萎缩的小鼠模型；局部和全脑缺血的小鼠/大鼠模型，例如，常见的颈总动脉闭塞或大脑中动脉闭塞模型；或离体全胚胎培养物。作为一个非限制性的实例，存在多种本领域已知的阿尔茨海默病小鼠模型(例如，参见rakover等，neurodegener.dis.(神经变性病)(2007)；4(5)：392-402；mouri等，fasebj.(2007)jul；21(9)：2135-48；minkeviciene等，j.pharmacol.exp.ther.(2004)nov；311(2)：677-82andyuede等，behavpharmacol.(2007)sep；18(5-6)：347-63)。多种测定可以以已知的体外或体内测定形式进行，如本领域已知的并且参考文献中所述的。多种这样的动物模型也可以从商业供应商诸如jackson实验室(jacksonlaboratory)获得。g.bace1结合剂的用途的实例本文所述的bace1肽结合剂的鉴定和表征提供了用于调节bace1及其底物(例如app)之间的体内相互作用的组合物和方法。本文所述的bace1肽结合剂可以用于治疗诸如神经病症的疾病和病症，如下文所讨论。本文所述的充分表征的bace1的中等至高等亲和力肽结合剂可以进一步用于阐明bace1本身的重要的结构特征。这样的知识提供了基于bace1序列本身的修饰开发调节性试剂。bace1调节及的其他应用包括与bace1及其相关的配偶体相关的疾病的诊断测定，融合蛋白形式的bace1和配体作为纯化工具和底物锚定子的应用。本文所述的bace1结合肽还可以用于筛选另外的化合物，以鉴定调节bace1-配体相互作用的那些化合物。设计筛选测定，以鉴定与bace1结合或复合或另外干扰bace1与细胞因子的相互作用的化合物。确定候选化合物作为调节剂的能力的一种方法是在存在已知的bace1结合剂(如本文公开的结合肽(例如，实施例中描述的高亲和性结合剂))的条件下在竞争性抑制测定中评估候选化合物的活性。这样的筛选测定将包括允许化学文库的高通量筛选的测定，使得其特别适合鉴定小分子药物候选物。测定可以以多种形式进行，包括蛋白-蛋白结合测定，生物化学筛选测定，免疫测定和基于细胞的测定，这些在本领域中是充分表征的。用于调节剂的所有测定是常见的，其中需要将候选调节剂与bace1(或其等价物)和/或参与bace1和结合配体的结合相互作用的结合配体在一定条件下接触充分的时间，以足以允许这两种化合物相互作用。在结合测定中，所述相互作用是结合，所形成的复合物可以分离或在反应混合物中进行检测。在具体的实施方案中，候选物质或分子通过共价或非共价连接固定在固相上，例如，在微量滴定板上。非共价连接通常通过用所述物质/分子的溶液包被固体表面并且干燥而实现。备选地，固定的对要固定的物质/分子特异性的亲和分子，诸如抗体，例如，单克隆抗体，可以用于将其锚定在固体表面上。测定通过向固定的成分(例如，含有被锚定的成分的包被的表面)中加入未固定的成分而进行，所述未固定的成分可以由可检测的标记进行标记。当反应结束时，去除未反应的成分，例如，通过洗涤去除，并且检测锚定在固体表面上的复合物。当初始未固定的成分携带可检测的标记时，固定在表面上的标记的检测指示复合的发生。在初始未固定的成分不携带标记的情形中，例如，可以通过使用特异性结合被固定的复合物的标记抗体来检测复合。候选化合物可以通过组合文库和/或基于本文所述的信息(特别是涉及配体或bace1序列本身中单个残基和结构部分对bace1-配体结合相互作用的贡献和重要性的信息)的已知的结合剂的突变而产生。干扰bace1和结合配体的相和作用的化合物可以按下述检测：通常在一定条件下制备含有bace1和配体的反应混合物，反应一定的时间，以允许这两种分子的相互作用和结合。为了检测候选化合物抑制结合相互作用的能力，在不存在或存在测试化合物的条件下运行反应。另外，可以向第三反应混合物中加入对照化合物，以作为阳性对照。监测测试化合物与混合物中存在的bace1和/或结合配体之间的结合(复合物形成)，如本文上文所述。在对照反应中形成复合物而在含有测试化合物的反应混合物中不形成复合物表示所述测试化合物干扰bace1与结合配体的相互作用。h.肽缀合物本发明也提供包含本文中公开的bace1结合肽与一或多种细胞毒性剂，如化疗剂或药物、生长抑制剂、毒素(例如蛋白质毒素、细菌、真菌、植物或动物来源的酶促活性毒素，或其片段))或放射性同位素缀合的肽缀合物。在一实施方案中，肽缀合物包含与一种或多种药物缀合的本文所述的bace1结合肽，所述一种或多种药物包括但不限于，美坦生类化合物(maytansinoid，参见美国专利号5,208,020、5,416,064及欧洲专利ep0425235b1)；奥利司他汀(auristatin)，如单甲基奥利司他汀药物(monomethylauristatin)结构部分de及df(mmae及mmaf)(参见美国专利号5,635,483及5,780,588，及7,498,298)；多拉司他汀(dolastatin)；加利车霉素(calicheamicin)或其衍生物(参见美国专利号5,712,374、5,714,586、5,739,116、5,767,285、5,770,701、5,770,710、5,773,001及5,877,296；hinman等人，cancerres.(癌症研究)53：3336-3342(1993)；及lode等人，cancerres.(癌症研究)58：2925-2928(1998))；蒽环类抗生素(anthracycline)如道诺霉素(daunomycin)或多柔比星(doxorubicin)(参见kratz等人，currentmed.chem.(现代药物化学)13：477-523(2006)；jeffrey等人，bioorganic&med.chem.letters(生物有机和药物化学通信)16：358-362(2006)；torgov等人，bioconj.chem.16：717-721(2005)；nagy等入，proc.natl.acad.sci.usa(美国国家科学院学报)97：829-834(2000)；dubowchik等人，bioorg.&med.chem.letters(生物有机和药物化学通信)12：1529-1532(2002)；king等人，j.med.chem.(药物化学杂志)45：4336-4343(2002)；及美国专利号6,630,579)；甲氨喋呤(methotrexate)；长春地辛(vindesine)；紫杉烷(taxane)如多西他赛(docetaxel)、紫杉醇(paclitaxel)、拉洛紫杉醇(larotaxel)、特赛紫杉醇(tesetaxel)及奥他紫杉醇(ortataxel)；单端孢霉烯族化合物(trichothecene)；及cc1065。在另一实施方案中，肽缀合物包含与酶促活性毒素或其片段缀合的本文中所述的bace1结合肽，所述酶促活性毒素或其片段包括，但不限于，白喉(diphtheria)a链、白喉毒素的非结合活性片段、外毒素a链(来自铜绿假单胞菌(pseudomonasaeruginosa))、蓖麻毒蛋白(ricin)a链、相思豆毒蛋白(abrin)a链、蒴莲根毒蛋白(modeccin)a链、α-帚曲霉素(α-sarcin)、油桐(aleutitesfordii)蛋白、香石竹毒蛋白(dianthinprotein)、美洲商陆(phytolacaamericana)蛋白(papi、papii和pap-s)、苦瓜(momordicacharantia)抑制剂、麻疯树毒蛋白(curcin)、巴豆毒蛋白(crotin)、肥皂草(sapaonariaofficinalis)抑制剂、白树毒蛋白(gelonin)、丝林霉素(mitogellin)、局限曲菌素(restrictocin)、酚霉素(phenomycin)、依诺霉素(enomycin)和单端孢霉烯族化合物(tricothecenes)。在另一实施方案中，肽缀合物包含与放射性原子缀合形成放射性缀合物的本文中所述的bace1结合肽。多种放射性同位素可用于制备放射性缀合物。实例包括at211、i131、i125、y90、re186、re188、sm153、bi212、p32、pb212及lu的放射性同位素。当使用放射性缀合物进行检测时，其可包含用于闪烁摄影研究的放射性原子，例如tc99m或i123，或用于核磁共振(nmr)成像(也称为磁共振成像，mri)的自旋标记物，同样如碘-123、碘-131、铟-111、氟-19、碳-13、氮-15、氧-17、钆、锰或铁。肽与细胞毒性剂的缀合物可使用多种双功能蛋白质偶合剂制得，例如n-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(spdp)，琥珀酰亚胺基-4-(n-马来酰亚氨甲基)环己烷-1-羧酸酯(smcc)，亚氨基硫烷(it)，亚氨酸酯(诸如盐酸二甲基己二亚酰胺化物)、活性酯类(诸如辛二酸二琥珀酰亚胺基酯)、醛类(诸如戊二醛)、双叠氮化合物(诸如双(对-叠氮苯甲酰基)己二胺)、双重氮衍生物(诸如双(对-重氮苯甲酰基)己二胺)、二异氰酸酯(诸如甲苯2，6-二异氰酸酯)和双活性氟化合物(诸如1，5-二氟-2，4-二硝基苯)的双功能衍生物。举例来说，蓖麻毒蛋白免疫毒素可如vitetta等人，science(科学)238：1098(1987)中所述来制备。接头可以是促进细胞毒性药物在细胞中释放的“可切割接头”。举例来说，可使用酸不稳定接头、肽酶敏感性接头、光不稳定接头、二甲基接头或含二硫化物的接头(chari等人，cancerres.(癌症研究)52：127-131(1992)；美国专利号5,208,020)。本文中的肽缀合物明确涵盖，但不限于，用交联剂试剂制备的这些缀合物，该等交联剂试剂包括，但不限于：bmps、emcs、gmbs、hbvs、lc-smcc、mbs、mpbh、sbap、sia、siab、smcc、smpb、smph、硫代-emcs、硫代-gmbs、硫代-kmus、硫代-mbs、硫代-siab、硫代-smcc及硫代-smpb及svsb(琥珀酰亚胺基-(4-乙烯基砜)苯甲酸酯)，交联剂试剂可商购获得(例如购自piercebiotechnology，inc.，rockford，il.，美国)。在其他实施方案中，肽缀合物包括包含与另一种异源多肽或氨基酸序列融合的本文所公开的bace1结合肽的融合蛋白。在一个实施方案中，所述融合蛋白包含所述bace1结合肽与酶促活性毒素(如上文公开的那些中的任一种)的融合体。在一个备选的实施方案中，所述融合蛋白包含所述bace1结合肽与增强多肽细胞进入的氨基酸序列的融合体。在一个实施方案中，所述氨基酸序列式细胞穿透肽(ccp)，例如，tat肽，penetratin，疱疹病毒被膜蛋白vp22，transportan，模式两亲性肽(map)，精氨酸寡聚物，或其他本领域已知的ccp。例如，参见sebbage，(2009)biosciencehorizons2：64-72；和delcroix与riley，(2010)pharmaceuticals3：448-470。在一个实施方案中，所述融合蛋白包含所述bace1结合肽与通常进行通过血脑屏障的吸附介导的胞转作用或受体介导的胞转作用的蛋白的氨基酸序列的融合体。这些蛋白包括但不限于，针对脑毛细管内皮受体的配体，诸如针对转铁蛋白受体或针对胰岛素受体的单克隆抗体，组蛋白，生物素，叶酸，尼克酸，泛酸或糖肽。在另一个实施方案中，所述bace1结合肽连接在高度带正电荷的化合物上，所述高度带正电荷的化合物诸如赖氨酸、聚赖氨酸、精氨酸、聚精氨酸、赖氨酸-精氨酸肽、腐胺、精脒、精胺等，已知所有这些可能通过与受体结合而促进穿过血脑屏障。在备选的实施方案中，所述融合蛋白可以包含bace1结合肽与免疫球蛋白或免疫球蛋白的特定区域(例如，igg分子的fc区)的融合体。对于免疫球蛋白融合体的产生，参见，例如，1995年6月27日出版的美国专利号5,428,130。在备选的实施方案中，所述bace1结合肽与导致肽的提高的pk和/或药效学的试剂融合。在一些实施方案中，所述肽是白蛋白融合蛋白。在一些实施方案中，所述融合蛋白是聚乙二醇化的融合蛋白。i.药物组合物本发明的bace1结合肽或多肽可以结合在组合物中，所述组合物在一些实施方案中适于制药应用。所述组合物典型地包含所述肽或多肽以及可接受的载体，例如，药用载体。“药用载体”包括任一种和所有的与药物给药相容的溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗和吸附延迟剂等(gennaro，remington：thescienceandpracticeofpharmacy(雷明顿：制药科学与实践).lippincott，williams&wilkins，philadelphia，pa.(2000))。所述载体或稀释剂的实例包括但不限于，水、盐水、finger′s溶液、葡萄糖溶液和5％人血清白蛋白。也可以使用脂质体和非水性赋形剂如不挥发性油。除了当常规介质或试剂与活性化合物不相容时，都考虑这些组合物的使用。补充性活性化合物也可以结合在组合物中。1.一般考虑配制药物组合物使其与其意欲的给药途径相容，所述给药途径包括静脉内、皮内、皮下、口服(例如，吸入)、经皮(例如，局部)、经黏膜和直肠给药。用于肠胃外、皮内或皮下应用的溶液或混悬液可以包括：无菌稀释剂，如注射用水、盐水溶液、不挥发性油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其他合成的溶剂；抗菌剂，如苯甲醇或对羟基苯甲酸甲酯；抗氧化剂，如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂，如乙二胺四乙酸(edta)；缓冲液，如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐，和用于调节张力的试剂，如氯化钠或葡萄糖。ph可以用酸或碱调节，诸如用盐酸或氢氧化钠调节。肠胃外制剂可以包封在由玻璃或塑料制成的安瓿、一次性注射器或多剂量小瓶中。2.可注射的制剂适于注射的药物组合物包括无菌水溶液(在水溶性的情形中)或分散液或用于即时制备无菌注射溶液或分散液的无菌粉剂。对于静脉内给药，适当的载体包括生理盐水、抑菌水、cremophoreltm(basf，parsippany，n.j.)或磷酸盐缓冲盐水(pbs)。在所有情形中，所述组合物必须是无菌的，并且应该是流体，以用注射器给药。所述组合物应该在制备和储存过程中是稳定的，并且必须保持不受诸如细菌和真菌的微生物的污染。载体可以是溶剂或分散介质，例如，包含水、乙醇、多元醇(如甘油、聚乙二醇和液体聚乙二醇)和适当的混合物。可以保持适当的流动性，例如，通过使用诸如磷脂酰胆碱的包衣，在分散液的情形中通过保持需要的粒度，以及通过使用表面活性剂。多种抗细菌剂和抗真菌剂；例如，对羟苯甲酸酯，氯丁醇，苯酚，抗坏血酸和硫柳汞，可以包含微生物污染。等渗剂；例如，糖，多元醇，诸如甘露醇，山梨醇，和氯化钠可以包含在组合物中。可以延迟吸收的组合物包括诸如单硬脂酸铝和明胶的试剂。无菌注射溶液可以通过将需要量的活性化合物(例如，本发明任意的调节物质/分子)结合在适当的溶剂(具有一种需要的成分或需要的成分的组合)中，然后除菌而制备。一般地，分散液通过将活性化合物结合在包含基本的分散介质和其他需要的成分的无菌赋形剂中而制备。用于制备无菌注射溶液的无菌粉剂、制备方法包括真空干燥和冷冻干燥，其产生包含活性成分和来自无菌溶液的任意需要的成分的粉剂。3.口服组合物口服组合物通常包括惰性稀释剂或可食用的载体。其可以包封在明胶胶囊中或压缩成片剂。为了口服治疗给药的目的，活性化合物可以与赋形剂结合并且以片剂、药片或胶囊的形式使用。口服组合物还可以使用流体载体制备，用作漱口水，其中在流体载体中的化合物口服应用。可以包括药物相容的结合剂和/或辅药物质。片剂、丸剂、胶囊、药片等可以包含下述成分或相似性质的化合物中的任一种：结合剂，如微晶纤维素，黄蓍胶或明胶；赋形剂，如淀粉或乳糖，崩解剂，如海藻酸，primogel或玉米淀粉；滑润剂，如硬脂酸镁或sterotes；助流剂，诸如胶状二氧化硅；增甜剂，如蔗糖或糖精；或调味剂，如薄荷，水杨酸甲酯或橙味调味剂。4.用于吸入的组合物对于通过吸入给药，化合物作为气雾喷雾剂由喷雾器或含有适当的推进剂(例如，气体，如二氧化碳)的压缩容器递送。5.系统给药系统给药也可以是经黏膜的或经皮的。对于经黏膜或经皮给药，选择可以透过靶屏障的渗透剂。经黏膜渗透剂包括去污剂，胆汁盐和夫西地酸衍生物。鼻喷雾剂或栓剂可以用于经黏膜给药。对于经皮给药，活性化合物配制成软膏、油膏、凝胶或乳膏。化合物还可以以用于直肠递送的栓剂(例如，用基质如可可油和其他甘油酯)或保留灌肠剂的形式制备。6.载体在一个实施方案中，活性化合物用保护该化合物免于从机体中快速清除的载体制备，诸如可控释放的制剂，包括植入物和微胶囊化的递送系统。可以使用可生物降解的活生物相容的聚合物，诸如乙烯醋酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯和聚乳酸。此类物质可以从alza公司(mountainview，calif.)和诺华制药公司(novapharmaceuticals，inc.)(lakeelsinore，calif.)商购获得，或者由本领域技术人员制备。脂质体混悬液也可以用作药用载体。这些可以按照本领域技术人员已知的方法制备，诸如在(eppstein等，美国专利号4,522,811,1985)中的方法。7.单位剂量可以产生单位剂型的口服制剂或肠胃外组合物，以促进给药和剂量均一性。单位剂型是指适用作待治疗的受试者的单次剂量的物理上分离的单位，其包含与需要的药物载体联合的治疗有效量的活性活性化合物。关于单位剂型的说明由活性化合物特有的特征和特别需要的治疗效果以及配制所述活性化合物的固有限制所指示，并且直接取决于上述。8.基因治疗组合物编码本发明的肽或多肽的核酸可以插入到载体中并且用作基因治疗载体。基因治疗载体可以通过例如静脉内注射、局部给药(nabel和nabel，美国专利号5,328,470,1994)或通过立体定向注射(chen等，procnatlacadsciusa(美国国家科学院学报).91；3054-7(1994))而递送至受试者。基因治疗载体的药物制剂可以包括可接受的稀释剂，或可以包含缓慢释放的基质，其中包埋有所述基因递送赋形剂。备选地，在可以由重组细胞完整地产生完整基因递送载体(例如反转录病毒载体)的情形中，药物制剂可以包括一种或多种产生基因递送系统的细胞。j.治疗方法本文中提供的任何bace1结合肽或多肽可以用于治疗方法。在一方面中，提供用作药物的bace1结合肽或多肽。在另外的方面中，提供用于治疗神经疾病或病症(例如，ad)的抗-bace1抗体。在某些实施方案中，提供用于治疗方法中的bace1结合肽或多肽。在某些实施方案中，本发明提供bace1结合肽或多肽，其用于治疗患有神经疾病或病症的个体的方法，所述方法包括向所述个体给药有效量的所述bace1结合肽或多肽。在一个这样的实施方案中，所述方法还包括向所述个体给药有效量的至少一种另外的治疗剂。在其他实施方案中，本发明提供bace1结合肽或多肽，其用于减少或抑制有风险患有或患有神经疾病或病症(例如，ad)的患者中的淀粉状蛋白斑形成。在某些实施方案中，本发明提供bace1结合肽或多肽，其用于减少或抑制个体中aβ产生的方法，所述方法包括向所述个体给药有效量的bace1结合肽或多肽。根据任何以上实施方案的“个体”优选是人。在某些方面中，用于本发明的方法的bace1结合肽或多肽降低或抑制bace1活性。例如，所述bace1结合肽或多肽降低或抑制bace1切割app的能力。在另一个方面中，本发明提供bace1结合肽或多肽在生产或制备药物中的用途。在一个实施方案中，所述药物用于治疗神经疾病或病症。在另一个实施方案中，所述药物用于治疗神经疾病或病症的方法，所述方法包括向患有神经疾病或病症的个体给药有效量的所述药物。在一个这样的实施方案中，所述方法还包括向所述个体给药有效量的至少一种另外的治疗剂，例如，如以下所述的。在另一个实施方案中，所述药物用于抑制bace1活性。在另一个实施方案中，所述药物用于抑制个体中aβ产生或斑块形成的方法，所述方法包括向所述个体给药有效量的所述药物以抑制aβ产生或斑块形成。根据任何以上实施方案的“个体”可以是人。在另一个方面中，本发明提供用于治疗阿尔茨海默病的方法。在一个实施方案中，所述方法包括向患有ad的个体给药有效量的bace1结合肽或多肽。在一个这样的实施方案中，所述方法还包括向所述个体给药有效量的至少一种另外的治疗剂。根据任何以上实施方案的“个体”可以是人。在另一个方面中，本发明提供药物制剂，所述药物制剂包含本文提供的任一种bace1结合肽或多肽，例如，用于任何以上治疗方法。在一个实施方案中，药物制剂包含本文提供的任一种bace1结合肽或多肽和药用载体。在另一个实施方案中，药物制剂包含本文提供的任一种bace1结合肽或多肽和至少一种另外的治疗剂，例如，如以下所述的。在治疗中，本发明的bace1结合肽或多肽可以单独使用或与其他药剂组合使用。例如，本发明的肽或多肽可以与至少一种另外的治疗剂共同给药。这样的以上所述的组合疗法包括组合给药(其中两种以上治疗剂被包含在相同或分开的制剂中)，和分别给药，其中，本发明抗体的给药可以发生在另外的治疗剂和/或佐剂的给药前、同时和/或之后。本发明的肽或多肽还可以与放射疗法一起使用。本发明的肽或多肽(以及任何另外的治疗剂)可以通过任何合适的方法给药，包括肠胃外给药，肺内给药、鞘内和鼻内给药，并且，如果局部治疗需要，病变内给药。肠胃外输注包括肌肉内、静脉内、动脉内、腹膜内或皮下给药。在一定程度上根据用药是短期或长期性而定，可通过任何适合的途径，例如通过注射，例如静脉内或皮下注射用药。本文中涵盖各种用药时间方案，包括，但不限于，单次给药或在多个时间点多次给药、推注给药及脉冲输注。本发明的某些实施方案提供穿过血脑屏障的肽或多肽。某些神经退行性疾病与血脑屏障的渗透性提高相关，以致肽或多肽可以容易地被引入到脑中。当血脑屏障保持完整时，存在数种已知方法用于穿过血脑屏障运输分子，所述方法包括但不限于，物理方法，基于脂质的方法，以及基于受体和通道的方法。运输肽或多肽穿过血脑屏障的物理方法包括但不限于，完全绕开血脑屏障，或通过在血脑屏障中产生开口。绕行法包括但不限于，向脑中直接注射(见例如，papanastassiou等，genetherapy(基因治疗)9：398-406(2002))和将递送装置植入脑中(见例如，gill等，naturemed.(自然医学)9：589-595(2003)；和gliadelwaferstm，guildfordpharmaceutical)。在屏障中产生开口的方法包括但不限于，超声(见例如，美国专利公布号2002/0038086)，渗透压(例如，通过施用高渗甘露醇(neuwelt，e.a.，implicationoftheblood-brainbarrieranditsmanipulation(血脑屏障及其操作的意义)，卷1&2，plenumpress，n.y.(1989)))，通过例如缓激肽或渗透剂(permeabilizer)a-7的渗透化(见例如，美国专利号5,112,596，5,268,164，5,506,206，和5,686,416)，以及用包含编码抗体或其片段的基因的载体转染横跨血脑屏障的神经元(见例如，美国专利公布号2003/0083299)。基于脂质的运输肽或多肽穿过血脑屏障的方法包括但不限于，将肽或多肽包封在脂质体中，所述脂质体与抗体结合片段偶联，所述抗体结合片段结合血脑屏障的血管内皮上的受体(见例如，美国专利申请公布号20020025313)，以及将肽或多肽包被在低密度脂蛋白颗粒(见例如，美国专利申请公布号20040204354)或脱脂载酯蛋白e(见例如，美国专利申请公布号20040131692)中。基于受体的运输肽或多肽穿过血脑屏障的方法包括但不限于，将所述肽或多肽与识别在血脑屏障上表达的受体的配体缀合，导致在受体-介导的胞转作用后其被携带穿过血脑屏障(gabathuler(2010)neurobiologyofdisease(疾病的神经生物学)37；48-57)。这些配体包括但不限于，针对脑毛细管内皮受体的配体，如针对转铁蛋白受体或针对胰岛素受体的单克隆抗体，组蛋白，生物素，叶酸，尼克酸，泛酸或糖肽。本发明的肽或多肽将以与良好医疗实践相一致的方式配制、给药和施用。在该背景下考虑的因素包括待治疗的具体病症、待治疗的具体哺乳动物、个体患者的临床状态、病症的原因、递送试剂的位点、施药方法、施药时间安排和医疗从业者已知的其他因素。所述肽或多肽不需要，但任选地，与目前用于预防或治疗待讨论病症的一种或多种试剂一起配制。所述其他试剂的有效量取决于制剂中存在的抗体的量、病症或治疗的类型以及以上讨论的其他因素。这些一般以相同剂量，并使用如本文中所述的施药途径，或以本文中所述的剂量的约1-99％，或以通过经验/临床确定合适的任意剂量和任何途径来使用。为了预防或治疗疾病，本发明的肽或多肽的合适剂量(当单独或与一种或多种其他另外的治疗剂组合使用时)将取决于待治疗疾病的类型、疾病的严重性和进程、所述肽或多肽是以预防目的施用还是以治疗目的施用、以前的治疗、患者的临床病史和对所述肽或多肽的应答和主治医师的判断力。所述肽或多肽以一次治疗或经过一系列治疗合适地施用于患者。根据疾病的类型和严重性，合适的剂量水平一般为约0.01-500mg/kg患者体重/天，其可以以单次或多次剂量给药。优选地，剂量水平为约0.1-约250mg/kg/天；更优选地，约0.5-约100mg/kg/天。适当的剂量水平可以是约0.01-250mg/kg/天，约0.05-100mg/kg/天，或约0.1-50mg/kg/天。在该范围内，剂量可以是0.05-0.5，0.5-5或5-50mg/kg/天。对于口服给药，组合物优选以含有1.0-1000毫克活性成分、特别是1.0，5.0，10.0，15.0，20.0，25.0，50.0，75.0，100.0，150.0，200.0，250.0，300.0，400.0，500.0，600.0，750.0，800.0，900.0和1000.0毫克活性成分(用于针对症状调节用于待治疗的患者的剂量)的片剂的形式提供。化合物可以以每天1-4次、优选每天一次或两次的方案给药。然而，用于任意特定患者的具体的剂量水平和给药频率可能不同并且取决于多种因素，包括所用的具体化合物的活性，该化合物的代谢稳定性和作用时长，年龄，体重，一般健康，性别，饮食，给药方式和时间，排泄速率，药物组合，具体病症的严重性以及主要正在进行的治疗(hostundergoingtherapy)。通过常规技术和测定容易地监测该治疗的进展。k.制品在本发明的另一方面中，提供一种制品，所述制品包含可用于治疗、预防和/或诊断上述病症的物质。该制品包括容器和在容器上或与容器一起的标签或包装说明书。适合的容器包括，例如，瓶子、小瓶、注射器、iv溶液袋等。所述容器可以由各种材料诸如玻璃或塑料制成。容器装有组合物，所述组合物是单独地或与可有效用于治疗、预防和/或诊断所述病症的另一种组合物结合，并且可以具有无菌的存取口(例如，所述容器可以是具有可被皮下注射针刺穿的塞子的静脉内溶液袋或小瓶)。组合物中至少一种活性试剂是本发明的肽或多肽。标签或包装说明书标明该组合物是用于治疗所选的病症。此外，所述制品可以包含(a)其中包含组合物的第一容器，其中所述组合物包含本发明的肽或多肽；和(b)其中包含组合物的第二容器，其中所述组合物包含另一种细胞毒性剂或其他的治疗剂。本发明的该实施方案中的制品还可以包括包装说明书，所述包装说明书指明所述组合物可以用于治疗特定病症。备选地，或另外地，所述制品还可以包括第二(或第三)容器，所述第二(或第三)容器包含药用缓冲剂，如抑菌注射用水(bwfi)，磷酸盐缓冲盐水，ringer溶液和葡萄糖溶液。从商业和用户立场，它还可以包括所需的其他物质，包括其他缓冲剂、稀释剂、滤器、针头和注射器。包括下述实施例，以证明本发明的优选实施方案。本领域技术人员应该理解，下述实施例中公开的技术代表本发明人发现的在本发明的实践中作用良好的技术，并且因此可以被认为组成用于其实践的优选模式。然而，本领域技术人员根据本公开内容应该理解在所公开的具体的实施方案中可以进行多种改变并且仍然获得类似的或相似的结果，而并不背离本发明的精神和范围。实施例实施例1：bace1的肽抑制剂的选择和表征材料和方法材料。酶和m13-ko7辅助噬菌体获自newenglandbiolabs。maxisorp免疫平板获自nalgenenuncinternational(naperville，il)。myone链霉抗生物素蛋白获自invitrogen(carlsbad，ca)。3，3’，5，5’-四甲基-联苯胺/h2o2(tmb)过氧化物酶底物获自kirkegaard&perrylaboratories，inc(gaithersburg，md)。neutravidin和链霉抗生物素蛋白获自thermoscientific(rockford，il)。om99-2(cat.no.496000)获自emdbiosciences(sandiego，ca)。文库构建。利用标准kunkel诱变构建噬菌体展示的肽文库(kunkel，t.a.等(1987)methodsenzymol(酶学方法)154：367-82)。通过按照制备噬菌体展示文库的标准方法(sidhu，s.s.等(2000)methodsenzymol(酶学方法)328：333-63)将随机化的肽融合在m13主要衣壳蛋白的n端而构建两组噬菌体展示的肽文库，线性-lib和环形-lib(含有半胱氨酸二硫化物)。线性-lib由连续的简并密码子(nnk，其中n＝a/c/g/t并且k＝g/t)编码的长度为8，10，12，14，16个氨基酸的随机的肽组成。单独构建具有不同长度的文库并且汇集在一起，每个具有相同的浓度。环形-lib由在两个固定的半胱氨酸之间具有不同长度的14-mer随机的肽组成。其命名为x6cx3cx5，x5cx4cx5，x5cx5cx4，x4cx6cx4，x4cx7cx3，x3cx8cx3，x3cx9cx2，x2cx10cx2，其中x表示由nnk密码子编码的残基，数字表示残基数目，并且c表示固定的半胱氨酸。单独构建这些文库并且汇集在一起，每个的浓度相同。线性-lib和环形-lib的最终多样性分别为1.8×1011和7.8×1011。使用简并寡核苷酸构建软随机文库(softrandomizedlibrary)，所述简并寡核苷酸用核苷酸碱基的70-10-10-10混合物合成，其中野生型碱基是过量的。该结果是在靶位置以约50％的频率存在野生型氨基酸。选择针对人bace1(bace1)的肽配体。将线性-lib和环形-lib的噬菌体库用平板-包被的bace1使用标准噬菌体淘选流程(sidhu，s.s.等(2000)methodsenzymol(酶学方法)328：333-63)或用在溶液中的生物素酰化的bace1循环经过数轮的结合选择。bace1在体外用购自thermoscientific(rockford，il)的ez-link硫代-nhs-lc-生物素酰化试剂盒(cat.no.21435)按照供应商的使用说明进行生物素酰化。对于第1轮，将20μg生物素酰化的bace1与1ml的噬菌体文库(～1×1013pfu/ml)在4℃温育2h，在室温由200μl预先用封闭缓冲液(pbs，1％bsa和0.1％吐温20)封闭的myone链霉抗生物素蛋白捕获15分钟。弃去上清液，并且将珠子用洗涤缓冲液(具有0.1％吐温20的pbs)洗涤三次。结合的噬菌体用400μl0.1mhcl洗涤7分钟，并立即用60μl1mtris，ph13中和。洗脱的噬菌体按先前所述进行扩增(sidhu，s.s.等(2000)methodsenzymol(酶学方法)328：333-63)。对于第2轮，除了使用10μg生物素酰化的bace1和100μl之外，流程与第一轮相同。对于第3轮，2μg生物素酰化的bace1与前一轮扩增的噬菌体温育，并且通过预先用封闭缓冲液包被的neutravidin-包被的平板捕获噬菌体-bace1复合物。处理使用链霉抗生物素蛋白-包被的平板来捕获生物素-bace1-噬菌体复合物之外，第4轮与第3轮相同。4轮结合选择后，在高通量斑点噬菌体elisa(sidhu，s.s.等(2000)methodsenzymol(酶学方法)328：333-63)中使用平板-固定的bace1作为靶标分析单个噬菌体克隆。检测相同噬菌体颗粒与bsa的结合信号作为非特异性结合噪声。认为具有大于0.5的噬菌体与靶标结合信号和＞3的信号/噪声比率的克隆是阳性克隆，并且进行dna序列分析。通过人工或自动化(proteintechnologies，inc.symphony肽合成仪(symphonypeptidesynthesizer))基于fmoc的固相合成以0.25mmol规格使用聚苯乙烯树脂合成肽(参见bodanszky，m.，和bodanszky，a.(1984)，thepracticeofpeptidesynthesis(肽合成实践)，springer-verlag，纽约)。合成结束时，去除侧链保护基团，并且用95％三氟乙酸(tfa)，2.5％三异丙基硅烷和2.5％水将肽从树脂上切割下来。通过加入在乙酸中的饱和的碘溶液进行半胱氨酸到二硫键的氧化。通过使用含有0.1％tfa的水/乙腈梯度的反相hplc进行肽的纯化。每种肽的纯度通过分析型hplc确定为大于95％均质性，并且其性质通过质谱来验证。肽bms1、bms2和bms4分别与kornacker等biochemistry(生物化学)44：11567-11573(2005)中所述的肽1、肽2和肽4相同。bace1htrf活性测定。通过向384-孔proxiplate(perkinelmer)中的在bace1反应缓冲液(50mmnaoacph4.4和0.1％chaps)中的用肽或小分子抑制剂预先温育的6μl2.7nmrhbace1中加入2μl600nmbi27(生物素-kteeisevnldaefrhdsgyevhhqkl(seqidno：5)，americanpeptidecompany)起始bace1htrf反应。将8μl蛋白水解反应混合物在环境温度温育24小时，并且通过加入在检测缓冲液(200mmtrisph8.0，20mmedta，0.1％bsa，和0.8mkf)中含有150nm链霉抗生物素蛋白-d2和5nm用铕穴状化合物标记的6e10的8μlhtrf检测混合物而猝灭。最终反应混合物在室温温育60分钟，并且使用envision多标记平板读数仪(envisionmultilabelplatereader，perkin-elmer)(320nm激发，615与665nm发射)测量tr-fret信号。使用graphpadprism5(lajolla，ca)分析数据。使用微流体毛细管电泳(mce)进行的bace1、bace2和组织蛋白酶d活性测定。在384-孔微量平板中以每孔20μl的终体积使用caliperlabchip3000(hopkinton，ma)进行bace1，bace2和组织蛋白酶d反应。通过向5μl4x酶和5μl4x肽或小分子抑制剂中加入10μl2x底物起始的标准酶促反应含有12nmrhbace1，1μmfam-kteeisevnldaefrwkk-酰胺(seqidno：20)，50mmnaoac，ph4.4，0.1％chaps。对于rhbace2(5nm)和组织蛋白酶d(6nm)(cat.no.219394；emdbiosciences，sandiego，ca)使用相同的反应条件。在室温温育60min后，使用12-sipper微流体芯片分离每份反应物中的产物和底物。通过使用caliperoptimizer软件选择电压和压力而优化产物和底物的分离。分离缓冲液包含100mmhepes，ph7.2，0.015％brij-35，0.1％包被试剂#3，10mmedta和5％dmso。分离条件使用-500v的下游电压，-2250v的上游电压和-1.2psi的筛选压力。产物和底物荧光在488nm处激发并且在530nm处检测。使用htswell分析仪软件(htswellanalyzersoftware)由电泳图计算底物转换率。bace1荧光偏振竞争性结合测定。在黑色384-孔微量平板(proxiplate-plus；perkinelmer，waltham，ma)中以每孔10μl的终体积进行bace1结合测定。通过向2.5μl4x结合探针和2.5ml4x抑制剂中加入5μl2x酶起始的标准结合反应含有12nmrhbace1，3nm5-tamra-neesmycrllgigcg(seqidno：16)(5-tamra-bace020)，具有0.1％chaps的50mmnaoac，ph4.4。允许反应在环境温度继续2小时至平衡，然后使用envision(perkinelmer)测量荧光偏振。在每孔中在595nm处(激发531nm的偏振光)测量的平行和垂直的荧光发射用于使用下式确定毫偏振水平(mp)：mp＝1000*(s-g*p)/(s+g*p)，其中s＝平行发射，p＝垂直发射，g＝0.65。每孔中的mp值作为抑制剂浓度的函数绘图，并且利用prism5.0软件(graphpadsoftware，sandiego，ca)使用数据的非线性最小二乘拟合为四参数等式来确定50％抑制(ic50)值。5-tamra-标记的bace020购自americanpeptidecompany，inc(sunnyvale，ca)并且以100mm溶解在dmso中用于存储。在293-happ细胞中的aβ1-40测定。在稳定表达野生型人app(695)互补dna(cdna)的293-hek细胞(293-happ)中测量aβ1-40产生。细胞以每孔3x104个细胞接种在96孔平板中过夜。将含有多种抑制剂的新鲜培养基[dulbecco’s改良的eagle’s培养基(dmem)+10％胎牛血清(fbs)]与293-happ细胞温育24小时。收集细胞培养基并且用aβ1-40htrf测定(cisbio)按照供应商的使用说明测定aβ1-40的存在。将aβ1-40值针对细胞存活性标准化，细胞存活性用celltiter-glo发光细胞存活性测定(celltiter-gloluminescentcellviabilityassay，promega)确定。实验进行至少3次，并且每次实验中的每个点一式两份重复。数据用4-参数非线性回归曲线-拟合程序(kaleidagraph，synergysoftware)绘图。结果选择在外部位点结合bace1的肽两种类型的噬菌体展示的首次用于实验的肽文库，线性-lib和环形-lib用来选择bace1配体，最初使用平板分选形式进行。初始淘选鉴定一组具有保守的φpyfφ基序的肽，其与之前报道的来源于噬菌体展示的肽相似(图1a)(kornacker，m.g.等(2005)biochemistry(生物化学)44：11567-73)。合成选择的肽，bace010和bace11，并且在bace1htrf活性测定中检测。bace010是非常弱的bace1抑制剂，而bace011是bace1的激活剂(图1b)。噬菌体展示的肽bace010和bace011与bace1的结合与肽bms1竞争(图1c)，其之前描述为外部位点-结合肽(komacker，m.g.等(2005)biochemistry(生物化学)44：11567-73)。竞争性结合以及相似的序列基序表明这些肽结合bace1上相同的外部位点(exosite)。选择不与bace1外部位点结合的肽为了获得不与bace1的外部位点结合的肽，我们使用首次用于实验的文库在存在100μm外部位点-结合肽bace010(ac-sgpyfieymsav-nh2)(seqidno：21)的条件下进行bace1的溶液分选。在使用该竞争选择策略进行四轮溶液淘选后，环形肽文库中有一种肽，命名为bace017，被鉴定为也与bace1结合的具有不同序列的肽(图2)。为了提高bace017的亲和性，使用bace017序列作为母本构建软随机文库。以增加严谨性的四轮淘选后，鉴定了31种肽，其以比母本更强的斑点噬菌体elisa信号结合bace1，表现为超过5倍的显著的信号/噪声比提高。这些肽的序列比对和序列标识表明与母本的主要需要差异为his4变为ser4，这可能解释亲和力增加(图2)。肽选择性抑制bace1酶活性并且与活性位点结合配体竞争选择四种信号/噪声比超过20的环形肽用于肽合成，命名为bace018-021，并且进行两种类型的酶活性测定。bace025-028分别是bace018-021的肽，其中cys被ser置换，以研究二硫键对其抑制活性的重要性。在htrf酶活性测定(图3a)中，bace018-021肽以10-70nm的ic50值抑制酶活性，与bace017相比，具有多至100倍的效力提高。这些肽的线性版本，bace025-028，不再抑制bace1活性，这表明二硫键对于抑制作用是必需的(表2)。bace020是通过htrf酶活性测定所示具有最佳抑制活性的肽，并且选择其用于进一步的研究。使用生物素酰化的bace020和浓度依赖性的加入bace020、om99-2或bms1肽进行竞争性结合elisa实验。如预测的，生物素酰化的bace020与外部位点-结合肽配体bms1没有竞争(图3b)。然而，在活性位点结合的肽抑制剂om99-2不竞争生物素酰化的bace020的结合，这表明bace020也在所述活性位点结合。使用上文提及的用于确定ic50值的竞争性结合fp测定用系列稀释的肽测量bace1肽配体的亲和力。caliper测定用来测量肽配体对bace1酶活性的抑制。如表2所示，通过fp测定测量的亲和力与通过caliper测定测量的抑制活性相关。此外，对于肽bace017-021和bace025-028，通过caliper测定测量的ic50值与通过htrf测定测量的那些相一致。为了研究结构-活性关系，我们合成了一组在每个位置具有丙氨酸置换的肽以及从bace020的n端截短的肽。fp结合和caliper活性测定都用来评估对这些肽的亲和力和抑制活性(表2)。用a1a替换asp1，glu2，gly11，ile12，gly13和gly15，以及剪截asp1和gly2不影响bace020的亲和力和抑制活性，这表明这些残基如果有任何相互作用能的话没有贡献太多。glu3突变为ala，以及截短至位置4(bace031)减弱所述亲和力和抑制活性3-4倍，并且用ala置换tyr6和leu10具有相似的亲和力损失，这表明这些残基对结合能有中等贡献。当用丙氨酸置换arg8，leu9，ser4和met5时，观察到肽活性的最显著的减少。特别地，arg8突变为ala的突变体在竞争性结合和酶测定中完全没有活性。用精氨酸类似物赖氨酸、鸟氨酸和瓜氨酸置换arg8(分别为bace058-060)在某种程度上拯救肽活性，但是不能恢复全部活性。bace030是具有全部活性的抑制性肽配体的最小版本，并且用来获得肽-bace1复合物的晶体结构(参见实施例4)。由于没有紧密相关的天冬氨酸蛋白水解酶bace2或组织蛋白酶d的抑制，因此，bace030对bace1的抑制是特异性的。表2.通过fp竞争结合测定、caliperbace1活性测定和htrfbace1活性测定确定人bace1的肽配体(按出现的顺序分别为seqidnos22-24，21，25-26，14-17，27-31，19，18和32-53)的抑制活性和结合亲和力*速率增加的，数据是ec50而不是ic50#x＝l-鸟氨酸&x＝l-瓜氨酸在基于细胞的测定中，bace1肽抑制剂减少aβ由于肽是体外bace1酶活性的有力的抑制剂，接着在更代表生理状态的细胞环境的情形中确定其是否是bace1的抑制剂。使用稳定转染app的293-hek细胞进行浓度依赖性抑制测定。bace020确实是aβ产生形成的有力的抑制剂(图4)。bace030，其在n端截短两个残基，也表现出有力的抑制(图4)。bace027，bace020的cys突变为ser的线性类似物，以及外部位点结合肽bms1，没有表现出抑制，这与酶结果一致。然而，不是所有的酶促抑制剂都表现出有力的活性位点结合拟肽bace1抑制剂om99-2所显示的细胞活性(图4)。为了完整性和比较，对于有力的活性位点结合小分子抑制剂gsk-8e(charrier，等，j.med.chem.(医学化学杂志)51：3313-3317(2008))和外部位点结合抗-bace1抗体也显示细胞抑制作用(图4)(atwal，j.k.等(2011)scitranslmed3：84ra43)。实施例2：bace020溶液结构和与bace1结合的nmr谱nmr谱bace020溶解在含有50mm磷酸钠ph6.5和150mm氯化钠的缓冲液中至终浓度为2mm。为了在d2o中的测量，将样品冻干并且重新溶解在100％d2o中。在装配有室温三联共振探针的brukerdrx800光谱仪上以280k捕获nmr谱(1h1d谱，2d-2qfcosy，2d-tocsy和2d-noesy谱)。用topspin(bruker)处理谱图，并且使用ccpn分析软件(vranken，w.f.等(2005)proteins(蛋白质)59：687-96)进行光谱分析。通过标准方法分配1h化学位移(wüthrich，k.(1986)nmrofproteinsandnucleicacids(蛋白质和核酸的nmr).newyork，wiley)。距离抑制(distancerestraints)来源于在h2o和d2o中记录的具有300ms混合时间的1h同核二维noesy谱图(1hhomonucleartwo-dimensionalnoesyspectra)。骨架角的抑制来源于由高分辨率2qf-cosy谱确定的3j(hn，hα)偶联常数，ω2横截面通过hn-hα(kim，y.m.等(1989)jmagres(磁共振杂志)84：9-13)。由在d2o中测量的cosy-35谱获得关于χ1角的3j(hα，hβ)偶联常数(cavanagh，j.(2007)proteinnmrspectroscopy：principlesandpractice(蛋白质nmr谱：原理和实践).amsterdam；boston，academicpress)。为了确定bace020在bace1蛋白上的结合位点，用增加量的bace020滴定30μm完全2h/15n-标记的bace1的样品，直至达到1∶1.5的摩尔化学计量。超过1∶1的摩尔化学计量在记录的trosy1h，15n相关性谱图中没有观察到进一步的改变。对于在滴定过程中容易控制的共振，使用每个残基的加权化学位移变化定量化学位移微扰(chemicalshiftperturbations)：其中ddhn和ddn分别是1hn和15n的化学位移的变化。nmr结构计算对于bace020的实验确定的距离和二面角抑制(dihedralrestraints)(见表3)使用aria2.2(rieping，w.等(2007)bioinformatics(生物信息学)23：381-2)和cns(brunger，a.t.等(1998)actacrystallogrdbiolcrystallogr54：905-21)用于模拟的退火流程中。在计算过程中不用氢抑制。使用procheck分析结构性质(laskowski，r.a.等(1996)jbiomolnmr(生物分子nmr杂志)8：477-86)。用molmol(koradi，r.等(1996)jmolgraph14：51-5，29-32)和pymol(thepymolmoleculargraphicssystem，version1.3，llc)制作绘图显示。表3.关于bace020肽的溶液结构的nmr结构统计学统计学基于bace020的十个(在100个计算的中)最低能量溶液结构的全体而报道。cnserepel函数用来模拟范德华相互作用，使用‘prolsq′范德华半径，能量常数为25.0kcal1kcal＝4.18kj。坐标精确性作为关于其平均结构的nmr全体中的十个最低能量结构的cartesian坐标r.m.s.d.给出。#结构性质使用procheck进行分析(laskowski，r.a.等(1996)jbiomolnmr(生物分子nmr杂志)8：477-86)。noesy来源的距离抑制与使用50kcalmol-1的能量常数的软方阱势(softsquare-wellpotential)一起使用。二面角抑制使用200kcalmol-1rad-2的能量常数应用。关于键长的力常数为1000kcalmol-1关于角度和假二面角(improperdihedrals)的力常数为500kcalmol-1rad-2。bace020的nmr分析揭示其溶液结构bace020的1hnmr谱图分析表明bace020在溶液中具有确定的结构。基于该初始评估，通过同核nmr谱解析bace020的结构(图5a)。多肽充分限定在glu3与cys14之间。残基glu3至leu10形成n端螺旋，其通过cys7与cys14之间的二硫键与c端连接。tyr6，leu9，leu10和ile12的侧链在结构的一侧形成疏水簇。由于用丝氨酸残基置换半胱氨酸(bace027)导致结构和活性二者的丧失，因此，二硫键是至关重要的。bace020在bace1上的结合位点的图谱为了确定bace020在bace1上的结合位点的位置，使用完全2h/15n标记的bace1通过nmr谱进行滴定实验。用于此的bace1构建体(残基43-453)与公布化学位移指定的构建体非常相似，这允许转化几乎所有的指定并且在每个残基的水平上追踪化学位移微扰(liu，d.等(2004)jbiomolnmr(生物分子nmr杂志)29：425-6)。当向bace1中加入bace020时，未结合的bace1的大量共振逐渐消失，并且在谱图的不同位置出现新信号。因此，结合处于nmr时间范围的缓慢交换方案中，如关于高亲和性相互作用所预测的。将未结合的bace1的trosy谱与同bace020复合的bace1的谱进行比较(参见图5b)。对于多种共振，基于邻近性处于结合状态的哪种与处于游离状态的那种相对应是明显的。认为明显受bace020结合的影响但是具有未知的新位置的bace1共振是独立的一类，原因在于化学位移微扰不能进行量化。bace020诱导的变化位于围绕底物-结合沟的n和c端片状物(lobes)的界面上。(参见图5c)。两个催化天冬氨酸残基进行化学位移微扰(图5b)，这表明结合位点与活性位点紧密相邻。另外，添加bace020影响盖(flap)中的多种共振，这进一步表明所述肽结合在底物-结合沟中。已知该盖对不同分子在活性位点的结合非常敏感，并且可以采取多种构象来容纳不同的配体。实施例3：通过bace1的定点诱变绘制肽结合位点人bace1ecd突变体的构建、表达和纯化在prk载体中制备人bace1突变体，所述载体包含bace1信号肽，接着是其细胞外结构域(ecd)(残基22-457)和c端his8标签(seqidno：54)。使用iixl定点诱变试剂盒(agilenttechnologiesstratageneproducts，lajolla，ca)使用适当的寡核苷酸制备突变，并且通过dna测序证实。使用在1升发酵器中生长的中国仓鼠卵巢细胞瞬时表达蛋白，并且2周后收集培养物。离心后，通过在ni-nta琼脂糖(qiagen，valencia，ca)将来自培养液的突变蛋白纯化至均质性(纯度＞95％)。用含有10mm咪唑的pbs洗涤后，用含有200mm咪唑的pbs洗脱蛋白，并且汇集洗脱物，使用vivaspin20(sartorius-stedim，goettingen，德国)浓缩，并且应用到用20mmhepesph7.2，150mmnacl平衡的superdex20010/300gl柱(gehealthcarebio-sciencesab，uppsala，瑞典)上。收集蛋白峰，浓缩，并且通过a280确定蛋白浓度。纯化的蛋白通过sds-page显示正确的分子量；观察到的粗条带可能是由于异源糖基化所致。生物素酰化的bace020肽结合测定通过96孔平板测定确定生物素酰化的bace020与重组蛋白的结合。将maxisorp微量滴定平板(nalgenuncinternational，rochester，ny)用在50mm碳酸盐，ph9.6中的2μg/mlbace1突变体在4℃包被过夜。包被的孔用缓冲液(pbs，0.05％聚山梨醇酯20)洗涤，并用测定缓冲液(pbs，ph7.4，0.5％bsa，0.05％吐温20，15ppmproclin)在室温轻轻摇动下封闭1小时。封闭后，加入稀释在测定缓冲液中的不同浓度的具有聚乙二醇(peg)间隔体的c端生物素标记的bace020肽(ac-neesmycrllgigcg-(peg)3-生物素(seqidno：16)；ac-neesmycrllgigcg-conh-ch2-(ch2-ch2-o-)3-(ch2)3-nh-生物素(seqidno：16))，并且将平板在室温轻轻摇动温育1小时。洗涤后，通过加入链霉抗生物素蛋白-辣根过氧化物酶缀合物(gehealthcare，piscataway，nj)、然后加入tmb/h2o2底物(kpl，gaithersburg，md)检测与平板结合的肽的量。反应用1m磷酸猝灭，并且在moleculardevicesspectramaxplus384微量平板读数仪上测量a450。利用kaleidagraph使用4参数非线性回归曲线-拟合程序(synergysoftware，reading，pa)确定给出半最大有效浓度的浓度(ec50)。使用固定量的生物素酰化的bace020和浓度依赖性加入的肽(例如bace020，om99-2或bms1)进行竞争性结合实验。利用kaleidagraph使用4参数非线性回归曲线-拟合程序确定给出半最大有效浓度的浓度(ec50)。结果为了确定作为肽结合区域的活性位点，在由om99-2结合确定的底物-结合沟中制备bace1的突变体(hong，l.等(2000)science(科学)290：150-3)。使用elisa测定确定生物素酰化的bace020结合bace1和突变体的能力。以ec50(mut)/ec50(wt)的相对ec50值确定结合亲和力减少的倍数，其在表3中列出。表4.与bace1突变体的相对生物素酰化的bace020结合*(表示基于结构编号方式的残基号)实施例4：通过与bace1复合的bace030的x-射线晶体学确定结构bace1蛋白表达和纯化通过blueheron核查具有c端his6标签(seqidno：55)的人bace157-453或bace143-453dna，克隆到pet29a(+)载体中，并且转化到bl21(de3)细胞中。表达用1mm异丙基β-d-1-硫代吡喃型半乳糖苷(iptg)诱导在37℃进行4小时。细胞用微射流机(microfluidizer)裂解，并且分离包含bace1的包涵体，用te(10mmtris·hclph8.0和1mm乙二胺四乙酸(edta))缓冲液洗涤两次。包涵体用7.5m尿素，100mmampsoph10.8和100mmβ-巯基乙醇(bme)在室温溶解2小时，然后以12,000rpm离心30分钟。然后，用7.5m尿素，100mmampsoph10.8稀释上清液，以获得od280～1.5-2.0。通过先将溶解的bace11∶20倍稀释在冷水中，然后在4℃轻轻搅拌样品3周以允许重折叠反应发生而进行重折叠。重折叠的bace1的纯化包括3个柱步骤。首先将蛋白上样到50ml用具有0.4m尿素的20mmtrisph8.0预先平衡的q琼脂糖快速流动(qsepharosefastflow，gehealthcare)柱上，并用0-0.5mnacl的盐梯度洗脱。汇集峰级分，用20mmtrisph8.0缓冲液稀释5倍，并且上样到sourcetm15q柱(gehealthcare)上。使用0-0.3mnacl的梯度洗脱bace1。汇集含有bace1蛋白的级分，浓缩，用在superdexs75柱上进一步纯化在25mmhepesph7.5，150mmnacl中。与bace1复合的bace030的结晶将纯化的bace157-453在如上述相同的缓冲液中浓缩至11mg/ml，并且用1mm肽bace030(初始以100mm溶解在100％dmso中)在4℃温育1小时。然后，通过将0.2μlbace1蛋白储液与0.2μl含有20％peg3350和0.1mbis-trisph5.5的储库溶液(reservoirsolution)在环境温度混合通过坐滴蒸汽扩散法(settingdropvapordiffusionmethod)进行结晶。晶体出现并且在3天内生长至完全的尺寸。晶体从结晶液滴中成环析出并且迅速转移到冷冻保护剂溶液(母液加20％甘油)中少于1分钟，然后在液氮中骤冷而成环析出所述冷冻保护剂液滴。数据收集和结构确定使用单一x射线束在钻石光源(diamondlightsource，dls)光束线i02确定衍射数据。在数据收集的整个过程中保持晶体处于低温温度。x射线检测装置是放置在距离晶体170mm处的adsc量子-315ccd检测器。对于单一晶体应用旋转法，以收集完整的数据组，其中每帧摆动0.5°并且总的楔(wedge)大小为140°。然后将数据指标化，积分，并使用程序hkl2000(otwinowski，z.等(1997)methodsenzymol.(酶学方法)276：307-325)换算(scaled)。数据处理的统计学显示在表5中。使用分子置换(mr)法利用程序phaser(mccoy，a.j.等(2007)japplcrystallogr40：658-674)解析结构。matthews系数计算结果指示每个不对称单位由一种bace1/肽复合物和50％溶剂组成。因此，进行mr计算以搜寻bace1细胞外结构域的三个亚基的一个组。bace1的搜寻模型来自bace1结构1fkn(hong，l.等(2000)science(科学)290：150-3)。在bace1活性位点中，在由于肽结构导致的不同的电子密度谱图中观察到大的阳性峰。显著的构象变化发生在bace1中，特别是在盖区域中。利用程序coot(emsley，2004)进行手工重建。反复利用程序refmac5(murshudov，g.n.等(1997)actacrystallogrdbiolcrystallogr53：240-55)和phenix(adams，2010)使用最大相似度靶标函数、各向异性个体b-因子精修法和tls精修法进行结构精修以获得0.164的最终r因子和0.194的rfree。结构精修的统计数据显示在表5中。表5.晶体学数据统计1rsym＝∑|ihi-ih|/∑ihi，其中ihi是经换算的第i次对反射h的对称相关观察的强度，并且ih是平均值。2括号中的值是最高分辨率壳层的值。3rcryst＝∑h|foh-fch|/∑hfoh，其中foh和fch是反射h的观察的和计算的结构因子振幅。4对不包括在精修中的5％随机选择的反射计算rfree的值。靶向环形肽抑制剂的活性位点的结构基础为了表征bace030肽与bace1催化结构域之间的相互作用，以的分辨率确定二元复合物的晶体结构。在使肽渗透成几种已知的晶体形式的无用的试验后，通过共同结晶结合所述肽。如图7a所示，bace030结合在催化沟上，所述催化沟位于bace1通常称为盖区的柔性环片段下。所述盖区可以采用如在与bace1结合的om99-2和小分子抑制剂的晶体结构中观察到的多种构象(hong，l.等(2000)science(科学)290：150-3；cole等，(2008)bioinorganicmed.chem.lett.18：1063-1066；pael等，(2004)j.mol.biol.(分子生物学杂志)343：407-416)。当bace030结合时，与用典型的线性底物样抑制剂om99-2观察到的底物结合构象中的其闭合的位置(pdb登记编号1fkn)(hong，l.等(2000)science(科学)290：150-3)相比较，盖打开约(基于thr72的cα)，并且容纳更大的螺旋肽。结合状态的bace030保持在溶液中通过nmr观察到的α-螺旋结构(参见实施例2)。cys5与cys12之间的二硫键保持这样的二级结构，这强调对在这两个位置的半胱氨酸残基的绝对需要。其支持使用首次用于实验的环形噬菌体文库进行筛选的观点，尽管天然bace1底物是线性的并且与bace1活性位点的结合的α-螺旋肽似乎是违反直觉的。复合物的结构揭示与噬菌体展示结果紧密相关的特征。大部分肽残基参与结合相互作用。不变的arg6，称为“精氨酸指”，其侧链伸入到催化中心并且与两个催化半胱氨酸形成双配位的盐桥(图7b)。这样的官能性非常类似于通常在小分子bace1抑制剂中观察到的“弹头”基团的官能性。bace030的met3和leu7分别背离bace1表面上的疏水口袋s1和s3位点。s1位点似乎是混杂的，并且可以耐受相似尺寸的不同的疏水残基(例如，ile，leu，met，与肽噬菌体数据一致)，而s3位点需要leu。tyr4，肽中的另一个高度保守的残基，与bace1上包含残基107-111(y-环)的小沟(之前未认识到的用于抑制剂结合的位点)结合。鉴于其与催化中心的邻近性，该位点可能被潜在地靶向用于小分子抑制剂设计。y-环相互作用由于存在leu8而增强，并且又由于存在疏水性但较不保守的残基leu10而增强(图7c)。gly9和gly11为leu10提供柔性，以包装在疏水核心上。在肽的n端，高度保守的glu1侧链与bace1的arg235形成盐桥。ser2在螺旋的n端放置帽。与om99-2和om03-4非水解的底物模拟物(hong，l.等(2000)science(科学)290：150-3；turner，r.t.，3rd等(2005)biochemistry(生物化学)44：105-12)相比，bace030占据p侧(p1-p4)的底物沟，其中肽键朝向底物方向相反的方向。bace030利用“精氨酸指”在其催化天冬氨酸残基处与bace1结合，因此防止呈现易切断的肽键的任何机会。序列表<110>健泰科生物技术公司<120>bace1的肽抑制剂<130>gne-0394pct<140><141><150>61/627,573<151>2011-10-14<160>96<170>patentinversion3.5<210>1<211>501<212>prt<213>智人（homosapiens）<400>1metalaglnalaleuprotrpleuleuleutrpmetglyalaglyval151015leuproalahisglythrglnhisglyileargleuproleuargser202530glyleuglyglyalaproleuglyleuargleuproarggluthrasp354045glugluproglugluproglyargargglyserphevalglumetval505560aspasnleuargglylysserglyglnglytyrtyrvalglumetthr65707580valglyserproproglnthrleuasnileleuvalaspthrglyser859095serasnphealavalglyalaalaprohispropheleuhisargtyr100105110tyrglnargglnleuserserthrtyrargaspleuarglysglyval115120125tyrvalprotyrthrglnglylystrpgluglygluleuglythrasp130135140leuvalserileprohisglyproasnvalthrvalargalaasnile145150155160alaalailethrgluserasplysphepheileasnglyserasntrp165170175gluglyileleuglyleualatyralagluilealaargproaspasp180185190serleugluprophepheaspserleuvallysglnthrhisvalpro195200205asnleupheserleuglnleucysglyalaglypheproleuasngln210215220sergluvalleualaservalglyglysermetileileglyglyile225230235240asphisserleutyrthrglyserleutrptyrthrproileargarg245250255glutrptyrtyrgluvalileilevalargvalgluileasnglygln260265270aspleulysmetaspcyslysglutyrasntyrasplysserileval275280285aspserglythrthrasnleuargleuprolyslysvalphegluala290295300alavallysserilelysalaalaserserthrglulyspheproasp305310315320glyphetrpleuglygluglnleuvalcystrpglnalaglythrthr325330335protrpasnilepheprovalileserleutyrleumetglygluval340345350thrasnglnserpheargilethrileleuproglnglntyrleuarg355360365provalgluaspvalalathrserglnaspaspcystyrlyspheala370375380ileserglnserserthrglythrvalmetglyalavalilemetglu385390395400glyphetyrvalvalpheaspargalaarglysargileglypheala405410415valseralacyshisvalhisaspglupheargthralaalavalglu420425430glyprophevalthrleuaspmetgluaspcysglytyrasnilepro435440445glnthraspgluserthrleumetthrilealatyrvalmetalaala450455460ilecysalaleuphemetleuproleucysleumetvalcysglntrp465470475480cyscysleuargcysleuargglnglnhisaspaspphealaaspasp485490495ileserleuleulys500<210>2<211>476<212>prt<213>智人<400>2metalaglnalaleuprotrpleuleuleutrpmetglyalaglyval151015leuproalahisglythrglnhisglyileargleuproleuargser202530glyleuglyglyalaproleuglyleuargleuproarggluthrasp354045glugluproglugluproglyargargglyserphevalglumetval505560aspasnleuargglylysserglyglnglytyrtyrvalglumetthr65707580valglyserproproglnthrleuasnileleuvalaspthrglyser859095serasnphealavalglyalaalaprohispropheleuhisargtyr100105110tyrglnargglnleuserserthrtyrargaspleuarglysglyval115120125tyrvalprotyrthrglnglylystrpgluglygluleuglythrasp130135140leuvalserileprohisglyproasnvalthrvalargalaasnile145150155160alaalailethrgluserasplysphepheileasnglyserasntrp165170175gluglyileleuglyleualatyralagluilealaargleucysgly180185190alaglypheproleuasnglnsergluvalleualaservalglygly195200205sermetileileglyglyileasphisserleutyrthrglyserleu210215220trptyrthrproileargargglutrptyrtyrgluvalileileval225230235240argvalgluileasnglyglnaspleulysmetaspcyslysglutyr245250255asntyrasplysserilevalaspserglythrthrasnleuargleu260265270prolyslysvalpheglualaalavallysserilelysalaalaser275280285serthrglulyspheproaspglyphetrpleuglygluglnleuval290295300cystrpglnalaglythrthrprotrpasnilepheprovalileser305310315320leutyrleumetglygluvalthrasnglnserpheargilethrile325330335leuproglnglntyrleuargprovalgluaspvalalathrsergln340345350aspaspcystyrlysphealaileserglnserserthrglythrval355360365metglyalavalilemetgluglyphetyrvalvalpheaspargala370375380arglysargileglyphealavalseralacyshisvalhisaspglu385390395400pheargthralaalavalgluglyprophevalthrleuaspmetglu405410415aspcysglytyrasnileproglnthraspgluserthrleumetthr420425430ilealatyrvalmetalaalailecysalaleuphemetleuproleu435440445cysleumetvalcysglntrpcyscysleuargcysleuargglngln450455460hisaspaspphealaaspaspileserleuleulys465470475<210>3<211>457<212>prt<213>智人<400>3metalaglnalaleuprotrpleuleuleutrpmetglyalaglyval151015leuproalahisglythrglnhisglyileargleuproleuargser202530glyleuglyglyalaproleuglyleuargleuproarggluthrasp354045glugluproglugluproglyargargglyserphevalglumetval505560aspasnleuargglylysserglyglnglytyrtyrvalglumetthr65707580valglyserproproglnthrleuasnileleuvalaspthrglyser859095serasnphealavalglyalaalaprohispropheleuhisargtyr100105110tyrglnargglnleuserserthrtyrargaspleuarglysglyval115120125tyrvalprotyrthrglnglylystrpgluglygluleuglythrasp130135140leuproaspaspserleugluprophepheaspserleuvallysgln145150155160thrhisvalproasnleupheserleuglnleucysglyalaglyphe165170175proleuasnglnsergluvalleualaservalglyglysermetile180185190ileglyglyileasphisserleutyrthrglyserleutrptyrthr195200205proileargargglutrptyrtyrgluvalileilevalargvalglu210215220ileasnglyglnaspleulysmetaspcyslysglutyrasntyrasp225230235240lysserilevalaspserglythrthrasnleuargleuprolyslys245250255valpheglualaalavallysserilelysalaalaserserthrglu260265270lyspheproaspglyphetrpleuglygluglnleuvalcystrpgln275280285alaglythrthrprotrpasnilepheprovalileserleutyrleu290295300metglygluvalthrasnglnserpheargilethrileleuprogln305310315320glntyrleuargprovalgluaspvalalathrserglnaspaspcys325330335tyrlysphealaileserglnserserthrglythrvalmetglyala340345350valilemetgluglyphetyrvalvalpheaspargalaarglysarg355360365ileglyphealavalseralacyshisvalhisaspglupheargthr370375380alaalavalgluglyprophevalthrleuaspmetgluaspcysgly385390395400tyrasnileproglnthraspgluserthrleumetthrilealatyr405410415valmetalaalailecysalaleuphemetleuproleucysleumet420425430valcysglntrpcyscysleuargcysleuargglnglnhisaspasp435440445phealaaspaspileserleuleulys450455<210>4<211>432<212>prt<213>智人<400>4metalaglnalaleuprotrpleuleuleutrpmetglyalaglyval151015leuproalahisglythrglnhisglyileargleuproleuargser202530glyleuglyglyalaproleuglyleuargleuproarggluthrasp354045glugluproglugluproglyargargglyserphevalglumetval505560aspasnleuargglylysserglyglnglytyrtyrvalglumetthr65707580valglyserproproglnthrleuasnileleuvalaspthrglyser859095serasnphealavalglyalaalaprohispropheleuhisargtyr100105110tyrglnargglnleuserserthrtyrargaspleuarglysglyval115120125tyrvalprotyrthrglnglylystrpgluglygluleuglythrasp130135140leuleucysglyalaglypheproleuasnglnsergluvalleuala145150155160servalglyglysermetileileglyglyileasphisserleutyr165170175thrglyserleutrptyrthrproileargargglutrptyrtyrglu180185190valileilevalargvalgluileasnglyglnaspleulysmetasp195200205cyslysglutyrasntyrasplysserilevalaspserglythrthr210215220asnleuargleuprolyslysvalpheglualaalavallysserile225230235240lysalaalaserserthrglulyspheproaspglyphetrpleugly245250255gluglnleuvalcystrpglnalagly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