一种分离纯化姬松茸子实体活性蛋白的方法与流程

本发明涉及保健食品加工技术领域，特别是涉及一种分离纯化姬松茸子实体活性蛋白的方法。

背景技术：

姬松茸（agaricusblazeimurill）又名巴西蘑菇、柏氏蘑菇、小松菇，是一种珍稀的待开发的是要兼用真菌，原产于北美南部的巴西、秘鲁等地。姬松茸在降血脂、降血压、治疗糖尿病等方面具有神奇的功效，一度被日本称为“地球上最后的食品”，药用和保健价值受到医学、药学和美食界的极大关注。

姬松茸菌盖嫩，菌柄脆，口感极好，味纯鲜香，食用价值颇高。姬松茸富含蛋白质、糖、维生素、膳食纤维、矿物质、脂肪酸和微量元素等。新鲜子实体水分含量在85％~87％、干菇中含粗蛋白40％~50％、糖38％~45％、纤维质6％~8％、粗灰分5％~7％、脂肪3％~4％；此外，氨基酸含量非常丰富，高于其他食用菌；还含有多种维生素和丰富的微量元素。姬松茸蛋白质组成中包括18种氨基酸，人体的8种必需氨基酸齐全，含有多种维生素和麦角甾醇。

姬松茸是一种极具有市场开发价值的食药用真菌。姬松茸含有丰富的蛋白质和多糖，具有极高的营养价值和药用价值，主要应用于医药领域和保健食品行业。姬松茸含有多种生理活性物质，包括多糖、活性蛋白、类固醇、凝集素和核酸等，具有调节免疫力、抗肿瘤、抗菌等药用功效。

目前对姬松茸的研究大都集中在液体发酵工艺、栽培、多糖分离纯化方面，对姬松茸蛋白的研究较少。一方面，食用菌产品蛋白质含量高，脂肪含量低，营养价值要优于植物蛋白和动物蛋白，通常情况下食用菌蛋白是介于植物蛋白和动物蛋白的食品，能够很好的满足人类对营养的需求，被称之为“健美食品”。另一方面，姬松茸多糖提取后，下胶料中还含有大量的蛋白质，研究表明，姬松茸蛋白具有显著的抗癌作用。目前因此开展对姬松茸子实体活性蛋白的研究，建立完善的姬松茸子实体活性蛋白的分离纯化工艺，对于提高姬松茸产品的附加值具有重要的意义。

姬松茸子实体活性蛋白的分离纯化工艺的实现，提高了姬松茸产品的利用率，为姬松茸子实体活性蛋白的工业化生产提供技术参数和理论指导，为姬松茸子实体活性成分的全面开发研究提供了方向。

技术实现要素：

本发明的目的是分离纯化一种活性蛋白，而提供一种分离纯化的姬松茸子实体活性蛋白的方法。

为实现本发明的目的所采用的技术方案如下。

（1）干燥的姬松茸子实体粉脱脂后加入纤维素酶和果胶酶酶解细胞壁成分，控制酶解温度50℃，酶添加量为2%，酶解时间为3h。

（2）将上述酶解后的溶液进行超声波辅助提取，超声波功率为250w，超声波时间为35min。

（3）将上述经过酶解和超声波处理的姬松茸子实体蛋白粉末，采用热水浸提法对影响提取效果的因素（浸提温度、浸提时间、料液比、提取次数）进行优化处理。

（4）向姬松茸蛋白提取液中加入硫酸铵溶液至不同的饱和度，4℃静置盐析24h，离心，用pbs磷酸盐溶液溶解沉淀物，透析后冻干，即得姬松茸子实体蛋白粗品。

（5）用离子交换柱层析分离姬松茸子实体活性蛋白，采用考马斯亮蓝g250追踪测定，收集洗脱液。

（6）采用葡聚糖凝胶进一步纯化姬松茸子实体活性蛋白，透析脱盐，真空冷冻干燥，得纯度较高的姬松茸子实体活性蛋白。用sds-page测姬松茸子实体活性蛋白分子量。

采用热水浸提法优化姬松茸子实体活性蛋白的步骤如下：在实验确定酶解时间、酶添加量、超声波功率和超声波时间的基础上，经过酶解和超声波处理的姬松茸子实体粉末，对浸提温度、浸提时间、料液比、提取次数进行四因素三水平的正交实验优化，考察各因素对提取率的影响。

采用饱和硫酸铵沉淀姬松茸子实体活性蛋白的步骤如下：向姬松茸蛋白提取液中加入硫酸铵溶液至不同的饱和度，4℃静置12h，离心，用pbs磷酸盐溶液溶解沉淀物，测吸光值，确定硫酸铵溶液的最适的饱和度。边搅拌边加入h2o2溶液至颜色褪去，透析，真空冷冻干燥，得姬松茸子实体粗蛋白。

采用deae-52离子交换柱层析初分离姬松茸子实体活性蛋白的步骤如下：用磷酸钠缓冲液（ph6.0）平衡层析柱，将姬松茸蛋白粗提液上柱，吸附平衡后，用磷酸钠缓冲液分步洗脱，流速为0.5ml/min。采用考马斯亮蓝g250进行追踪测定，最后根据梯度洗脱曲线收集合并洗脱液。

采用sephadexg150葡聚糖凝胶纯化姬松茸子实体活性蛋白的步骤如下：将sephadexg150常温下蒸馏水浸泡2-3d，用50mmol/l磷酸钠缓冲液调节ph至6，将姬松茸蛋白初分离液上柱，吸附平衡后，用磷酸钠缓冲液进行分步洗脱，流速为0.5ml/min。采用考马斯亮蓝g250进行追踪测定，最后根据梯度洗脱曲线合并洗脱液。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

1、本发明在分离纯化姬松茸子实体活性蛋白的方法是在对姬松茸子实体粉末预处理时，采用纤维素酶和果胶酶酶解姬松茸细胞壁成分，并利用超声波辅助提取，有利于提高姬松茸蛋白的提取率。本方法高效、简便、经济、适合工业化规模生产；

2、本发明采用热水浸提的方法提取姬松茸子实体活性蛋白，避免了采用碱浸提的方法造成的蛋白质营养成分流失，减少了有色物质的产生，最大限度的保留了姬松茸子实体活性蛋白的活性；

3、本发明首次实现了对姬松茸子实体活性蛋白提取和纯化工艺的研究，纯化后蛋白质含量达88.56%，为今后姬松茸子实体活性蛋白规模化生产和功能性研究应用提供了理论基础。

附图说明

图1是deae-52离子交换柱层析初分离姬松茸子实体活性蛋白（所用柱子20*100mm）；

图2是sephadexg-150葡聚糖凝胶纯化姬松茸子实体活性蛋白（所用柱子15*650mm）。

具体实施方式

1、将干燥姬松茸子实体粉碎，过60目筛后脱脂，加入纤维素酶和果胶酶酶解细胞壁成分，酶添加量为2%，酶解温度50℃，酶解时间为3h。

2、将上述酶解后的溶液进行超声波辅助提取，超声波功率为250w，超声波时间为35min。

3、在实验确定酶解时间、酶添加量、超声波功率、超声波时间的基础上，采用热水浸提法，对经过酶解和超声波处理的姬松茸子实体进行蛋白提取的优化处理，浸提温度为90℃，浸提时间为2.5h，料液比为1:2，提取次数为2次，在此条件下姬松茸子实体活性蛋白提取率为38.78%。

4、取12份5ml姬松茸蛋白提取液，分别加(nh4)2so4至饱和度为10％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、75％和100％，4℃静置盐析24h，3000r/min离心30min，收集蛋白沉淀，加少量pbs使之溶解，置入透析膜，加10mmol/lph7.0磷酸缓冲液，置于4℃冰箱中，透析24h，真空冷冻干燥，即为姬松茸子实体活性蛋白粗品。确定了硫酸铵的饱和度为80%。

5、采用deae-52离子交换柱层析初分离姬松茸子实体活性蛋白：用50mmol/l磷酸钠缓冲液（ph6.0）平衡deae-52层析柱（20×100mm），直到柱流出液体ph为6.0为止，将5ml姬松茸蛋白粗提液上柱，吸附平衡后，依次用盐浓度为0、0.1、0.2、0.3、0.5mo1/l磷酸钠缓冲液进行分步洗脱，流速为0.5ml/min。采用考马斯亮蓝g250进行追踪测定，根据梯度洗脱曲线收集合并洗脱液。分离得到一个明显的洗脱峰和三个小峰，并依次命名为abmp-1、abmp-2、abmp-3、abmp-4，收集abmp-2洗脱峰，进行进一步的分离纯化。

6、采用sephadexg-150葡聚糖凝胶纯化姬松茸子实体活性蛋白：称取3.5gsephadexg150，常温下用蒸馏水浸泡2-3d，用50mmol/l磷酸钠缓冲液(ph6.0)平衡sephadexg150葡聚糖凝胶（15×650mm），直到柱流出液体ph为6.0为止，将5ml姬松茸蛋白初分离液上柱，吸附平衡后，用盐浓度为0.3磷酸钠缓冲液进行分步洗脱，流速为0.5ml/min。采用考马斯亮蓝g250进行追踪测定，根据梯度洗脱曲线收集合并洗脱液。经过凝胶柱层析，该洗脱峰又分离出两个洗脱峰，依次命名为abmp-21、abmp-22。收集这两个洗脱峰，透析脱盐，真空冷冻干燥，得较纯化的姬松茸子实体活性蛋白粉末，纯化后蛋白含量为88.56%。

7、采用聚丙烯酰胺凝胶电泳（sds-page）测定姬松茸子实体活性蛋白分子量：样品蛋白质浓度10mg/ml，用13%浓度的分离胶，通过sdspage分析姬松茸蛋白亚基分子质量，主要蛋白质分子量为85.3kd。

本发明综合利用复合酶法协同超声波法、热水浸提法、离子交换柱层析、葡聚糖凝胶柱层析、冷冻干燥技术和sds-page法，制备的姬松茸子实体活性蛋白纯度较高。

本发明需要指出的是，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。