一种普通小麦低分子量麦谷蛋白及其编码基因和应用的制作方法

本发明涉及到生物技术领域，具体指一种普通小麦低分子量麦谷蛋白及其编码基因和应用。

背景技术：

小麦属于禾本科小麦属，一年生或越年生草本植物，是小麦系植物的统称；小麦适应性强，分布广，用途多，是世界上重要的粮食作物之一，其总面积、总产量及总贸易额均居粮食作物的第一位。近年来，对小麦品质的改良越来越受到重视，而蛋白质的含量和质量对小麦加工品质具有决定性作用。根据小麦筋度的不同，大致可将小麦分为强筋型、中筋型和弱筋型小麦；强筋和弱筋小麦一般称为优质麦。不同筋度小麦可制作不同食品，强筋型小麦多用于制作面包，弱筋型小麦多用于制作饼干、糕点等。随着人们生活水平的不断提高，对面粉制品的要求也越来越高；然而在我国强筋型小麦和弱筋型小麦品种较少，生产上种植的多数为中筋型小麦。

小麦贮藏蛋白主要包括麦谷蛋白和醇溶蛋白，麦谷蛋白的含量对面筋强度有着重要影响。根据分子量大小的不同，可将麦谷蛋白分为高分子量麦谷蛋白亚基(hmw-gs)和低分子量麦谷蛋白亚基(lmw-gs)，其中lmw-gs约占麦谷蛋白的60％。由于低分子量麦谷蛋白亚基拷贝数较多，其分子量与醇溶蛋白分子量相似，传统分离方法sds-page很难将其区分开来，对lmw-gs的分析、分离以及鉴定技术还不够完善，因此对lmw-gs的研究远不及对hmw-gs的研究那么深入。近年来，采用基因特异性引物从小麦栽培品种及其近等基因系和近缘种中发现的lmw-gs基因、基因片断和假基因已经超过200个。目前，无论是在普通小麦或是近缘种材料中，在d染色体上的lmw-gs基因研究要比在a和b染色体上的研究多一些。但是3个位点中不同等位基因的亚基间分子量很接近，且有的亚基的鉴定需要依赖其浓度进行区分，所以很难发现新的亚基。

近年来，采用基因特异性引物已经从小麦栽培品种及其近等基因系和近缘种中获得了很多lmw-gs的编码基因及相应的单元型。wang等从glu-a3位点分离出3个lmw-gs基因glua3-1、glua3-2和glua3-3，共包含有6个等位基因，并从glu-b3位点分离出4个lmw-gs基因glub3-1、glub3-2、glub3-3和glub3-4以及其相应的9个等位变异类型(wanglh，zhaoxl，hezh，etal.characterizationoflow-molecular-weightgluteninsubunitglu-b3genesanddevelopmentofstsmarkersincommonwheat(triticumaestivuml.)[j].theoreticalandappliedgenetics，2009，118(3)：525-539)。

许多研究认为，在glu-3位点编码的lmw-gs等位基因对小麦品质有重要影响，其中glu-a3位点上的glu-a3b和glu-a3d等位基因对增强面团特性和改善烘烤品质方面有着重要贡献。由于lmw-gs对小麦加工品质的重要性，鉴定lmw-gs基因的等位变异，开发出相应的分子标记，对小麦品质育种具有重要意义。

根据n-末端起始氨基酸的不同，分别为甲硫氨酸、丝氨酸和异亮氨酸，又可将低分子量麦谷蛋白亚基分为lmw-m、lmw-s和lmw-i3种类型。

目前为止，已经研发出了一些lmw-gs基因的功能标记，如zhang等(zhangw，gianibellimc，ramplinglr，etal.characterisationandmarkerdevelopmentforlowmolecularweightgluteningenesfromglu-a3allelesofbreadwheat(triticumaestivuml.)[j].theoreticalandappliedgenetics，2004，108(7)：1409--1419)根据glu-a3位点的1个lmw-gs基因的等位变异，开发出一套glu-a3位点等位基因的pcr标记，可以有效地鉴定出该位点的等位基因类型，并在小麦资源及育种材料的筛选中加以利用。

小麦麦谷蛋白亚基的质量和数量对面团筋度的高低有直接影响，而lmw-gs是麦谷蛋白的重要组成部分。探讨不同筋力小麦品种的lmw-gs基因差异，为小麦品质育种中亲本的选择提供理论依据。

技术实现要素：

本发明第一个目的提供了一种普通小麦低分子量麦谷蛋白，命名为p-13(seqid№：1)，该小麦低分子量麦谷蛋白亚基的氨基酸序列含有7个半胱氨酸残基，其缺少的氨基酸位于c-末端保守区上的第8个半胱氨酸的位置上；

将p-13与现有技术中的1条肽链p-11(seqid№：3)进行比较，相似性在90％以上；p-13不同于比对的肽链主要是由于p-13含有7个cys，而比对的肽链含有8个cys，与含有8个半胱氨酸残基lmw-gs材料的面粉相比，含有7个半胱氨酸残基的lmw-gs会减弱形成分子间二硫键，进而降低和面时间、显著减弱面团强度、减少蛋白聚合体，增强抗延阻力。

典型的低分子量麦谷蛋白亚基含有8个半胱氨酸残基，在第1和第7位上的半胱氨酸残基形成分子间二硫键，其余6个形成分子内二硫键，然而在普通小麦偃展4110获得了含有7个半胱氨酸残基的lmw-gs，p-13是在c-末端保守区上的第8个半胱氨酸的位置上缺失一个半胱氨酸残基。进一步对偃展4110获得含有7个半胱氨酸残基的lmw-gs的二级结构进行了预测；结果发现，p-13蛋白二级结构中α-螺旋和β-折叠所占的比例之和为24.86％，这明显高于glud3-1基因的其他等位变异(24.00％-24.57％)，这种二级结构的变化与缺少一个半胱氨酸残基有关，含有7个半胱氨酸残基的lmw-gs比含有8个半胱氨酸残基lmw-gs材料的面粉更不利于形成分子间二硫键，从而影响到其三级结构的构型，进而会影响到蛋白的功能及面粉品质，比如会降低和面时间、降低面团强度、减少蛋白聚合体，增强抗延阻力。因此，偃展4110是小麦优质育种的基因资源，可为弱筋型小麦提供良好的亲本材料。

本发明第二个目的提供了一种普通小麦低分子量麦谷蛋白的编码基因，命名为glud3-13，具有下列核苷酸序列之一：

1)所述小麦低分子量麦谷蛋白亚基的编码基因的核苷酸序列如seqid№：2所示。

2)与序列表中seqid№：2的dna具有95％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的dna序列；

将单元型glud3-13与从genbank中收索到的，来源于普通小麦中glud3-1基因的1个等位变异类型glud3-11(seqid№：4)进行相比，相似性高达95％以上。由于glud3-13和等位变异类型glud3-11(seqid№：4)的核苷酸序列都是含有完整的开放阅读框，在核苷酸中，由于碱基间的不同，使得glud3-13翻译成的肽链p-13结构不同于其他肽链，使得肽链的三级结构较不易形成网络结构，蛋白聚合体减少，从而减弱面团强度。

在普通小麦中1a染色体上提供了一个含有7个半胱氨酸残基的低分子量麦谷蛋白亚基及其对应的基因。

glud3-13基因是glud3-1基因的等位变异类型。

glud3-13基因的核苷酸序列全长为1341bp，其中编码区长度为1056bp，起始密码子atg，双联体终止密码子tgataa，等位变异glud3-13包含完整的开放阅读框(orf)，且可以编码完整的氨基酸序列，在编码区的下游区域有多个多聚腺苷酸aataaa结构。在编码区内，与等位变异类型glud3-11相比，glud3-13中有两个错义突变，对应的变化分别发生在glud3-11核苷酸序列的第1939bp和第2302bp处，分别是碱基a替换成g，使得对应氨基酸s替换成了g，碱基t替换成c，使得对应氨基酸c替换成r，从而使对应的肽链p-13(seqid№：1)在c-术端保守区内缺少了一个半胱氨酸残基，含有7个cys。p-13(seqid№：1)的n-末端为metsrvp-，属于lmw-m类型，分子量约为39.8kda。

含有本发明glud3-13(seqid№：2)基因的重组表达载体、转基因细胞系、工程菌、对应的肽链p-13(seqid№：1)以及检测手段均属于本发明的保护范围。

本发明第三个目的提供了一种普通小麦低分子量麦谷蛋白的编码基因在小麦作物育种中的应用。

偃展4110中含有优质的lmw-gs基因glud3-13，可将偃展4110作为亲本或者亲本之一，通过杂交、筛选等手段把这个优质亚基传递给子代，从而达到提高小麦品质的目的。

本发明第四个目的提供了一种鉴定普通小麦是否含有如权利要求2所述seqid№：2编码基因的方法，其特征在于：包括如下步骤：

(1)提取待测普通小麦的基因组dna，对其glud3-1基因在1a染色体上以seqid№：5和seqid№：6组成的引物lb2f/lb2r进行pcr扩增；将pcr扩增产物进行测序；

pcr扩增条件：pcr扩增体系25μl，其中包括模板dna50ng，上、下游引物各0.5μl(20umoll^-1)，taqdna聚合酶(5uμl^-1，takaraex)0.5μl，10×pcrbuffer2.5μl，dntpmix(2.5mmoll^-1)2μl，加无菌水补充反应体系至25μl；

pcr扩增程序为：94℃预变性5min；94℃变性40s，57℃退火40s，72℃延伸90s，共30个循环；最后72℃延伸10min，4℃保存；

(2)测序：pcr扩增产物测序采取两种方法，一是直接测序，二是克隆后进行测序，每个样品重复测序3-6次，步骤分别采用上述两种方法对pcr产物测序，采用两种方法得到的测序结果一致才可确认检测普通小麦含有seqid№：2基因；测序结果经过核苷酸序列分析软件(dnaman.6.0.3.99汉化版)软件拼接、比对分析，确定普通小麦含有seqid№：2基因。

本发明技术优点即取得的积极效果：

1、首次在偃展4110的1a染色体上发现了等位变异类型glud3-13，可为小麦育种提供优异的外源基因，同时对lmw-gs的功能的研究以及分子标记的开发奠定了理论基础。

2、本发现的等位变异类型glud3-13所对应的肽链p-13，含有7个半胱氨酸残基的lmw-gs，相对不利于形成分子间二硫键，从而影响到其三级结构的构型，从而不利于形成谷蛋白聚合体，会降低面粉的蛋白，从而可提升面粉品质的弱筋性。因此，偃展4110将是小麦优质育种的基因资源，可作为杂交优质小麦材料的良好亲本。

3、偃展4110中含有优质的lmw-gs基因glud3-13，可将偃展4110作为亲本或者亲本之一，通过杂交、筛选等手段把这个优质亚基传递给子代，从而达到提高小麦品质的目的，对小麦品质改良具有重要意义。

附图说明

图1等位变异glud3-13与glud3-1基因的部分编码区的碱基序列比对结果；

图2等位变异glud3-13与glud3-1基因的部分编码区的碱基序列所对应的氨基酸序列比对结果。

具体实施方式

下面结合实施例，对本发明的原理和特征进行描述，但本发明的实施方式不限于此，不能以下述实施例来限定本发明的保护范围。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中小麦材料均由河南农业科学院小麦研究所提供。

本发明利用lmw-gs基因特异性引物分别对不同筋力的10份小麦材料进行扩增，其中在偃展4110获得了glud3-1基因的新的等位变异类型，命名为glud3-13(seqid№：2)，并将该新的等位变异所翻译的氨基酸命名为p-13(seqid№：1)。供试材料为不同筋力的10份小麦样本，包括3份强筋型-郑麦366、郑麦9023和师栾02-1，4份中筋型-矮抗58、周麦18、石家庄8号和偃展4110，3份弱筋型-郑麦004、豫麦50和扬麦13号。

实施例1

一种普通小麦低分子量麦谷蛋白的编码基因，命名为glud3-13，具有核苷酸序列如seqid№：2所示。

1、等位变异glud3-13的发现

以强筋型、中筋型和弱筋型小麦共计10份小麦作为供试材料，对其lmw-gs基因在1a染色体上进行以序列表中序列5(seqid№：5)和序列6(seqid№：6)组成的引物1b2f/lb2r进行pcr扩增，然后测序，pcr产物测序采取两种方法，一是直接测序，二是克隆(利用北京全式金生物技术有限公司的peasy-t1载体)后进行测序，每个样品重复测序3-6次(测序由南京金斯瑞生物技术有限公司完成)。本发明分别采用上述两种方法对pcr产物测序，采用两种方法得到的测序结果一致。

实验结果表明：测序结果经过核苷酸序列分析软件(dnaman.6.0.3.99汉化版)拼接、比对分析，发现glud3-13为glud3-1基因的一个新的等位变异。在偃展4110中扩增出新的glud3-1基因的新的等位变异，命名为glud3-13。

图1为等位变异glud3-13与glud3-1基因的部分编码区的碱基序列比对结果：

图1中glud3-11为基因库中已经注册的在普通小麦中得到的glud3-1基因的等位变异，glud3-13为本实验在偃展4110中获得的glud3-1基因的等位变异。

2、等位变异glud3-13的获得

glud3-13的获得：以基因组dna为模板，以序列表中序列5(seqid№：5)和序列6(seqid№：6)组成的引物lb2f/lb2r进行pcr扩增；

pcr扩增条件：pcr扩增体系25μl，其中包括模板dna50ng，上、下游引物各0.5μl(20umoll^-1)，taqdna聚合酶(5uμl^-1，takaraex)0.5μl，10×pcrbuffer2.5μl，dntpmix(2.5mmoll^-1)2μl，加无菌水补充反应体系至25μl。

pcr扩增程序为：94℃预变性5min；94℃变性40s，57℃退火40s，72℃延伸90，共30个循环；最后72℃延伸10min，4℃保存。

将等位变异glud3-13核苷酸序列经dnaman.6.0.3.99汉化版软件分析推导相应氨基酸序列，得到肽链p-13。p-13具有典型的lmw-gs结构，n-末端为metsrvp-，属于lmw-m类型，含有7个cys。

实施例2

一种普通小麦低分子量麦谷蛋白，命名为p-13(seqid№：1)，氨基酸序列如seqid№：1所示。由glud3-13(seqid№：2)编码基因制得：通过ctab法提取偃展4110基因组dna，以偃展4110基因组dna为模板，以序列表中序列5(seqid№：5)和序列6(seqid№：6)组成的引物lb2f/lb2r进行pcr扩增，得到glud3-13核苷酸序列，利用dnaman.6.0.3.99汉化版软件可得到该核苷酸序列的编码区序列。

典型的lmw-gs多肽链结构主要包括4个结构区域，分别是起始序列是一高度保守的包括20个氨基酸的信号肽，其后是n-末端保守区、n-末端重复区和c-末端保守区(又分为3个亚区即半胱氨酸富集区、谷氨酰胺富集区和末端保守区)，通常p-1的cys在半胱氨酸富集区内含有5个，在n-末端重复区内含有1个cys，谷酰胺富集区内含有1个cys，末端保守区含有1个cys，而p-13缺少的一个cys在末端保守区内，通过用dnaman.6.0.3.99汉化版软件得到p-13的氨基酸序列。该小麦低分子量麦谷蛋白亚基的氨基酸序列含有7个半胱氨酸残基，其缺少的氨基酸位于末端保守区上的第8个半胱氨酸的位置上；

将p-13与现有技术中的肽链p-11(seqid№：3)进行比较序列测定结果比较，两条肽链利用dnaman.6.0.3.99汉化版软件进行比对)，相似性在90％以上；

p-13不同于比对肽链主要是由于p-13含有7个cys，而比对的肽链p-11(seqid№：3)含有8个cys，与含有8个半胱氨酸残基lmw-gs材料的面粉相比，含有7个半胱氨酸残基的lmw-gs较不利于形成分子间二硫键，进而降低和面时间、降低面团强度、减少蛋白聚合体，增强抗延阻力。

实施例3

一种普通小麦低分子量麦谷蛋白的编码基因在小麦作物育种中的应用。

应用小麦的品种为偃展4110，从普通小麦偃展4110中得到了含有7个cys残基的lmw-gs，可通过杂交技术等手段将偃展4110作为亲本进行育种。随着技术和方法进一步发展，在lmw-gs新基因的发掘、各等位基因与小麦品质的关系等方面取得新的突破，使lmw-gs很好地应用于小麦育种中，最终达到获得优质小麦的目的。

实施例4

一种鉴定普通小麦是否含有如seqid№：2所示基因glud3-13和seqid№：1所示p-13蛋白的方法，包括如下步骤：

(1)提取待测普通小麦的基因组dna，对其glud3-1基因在1a染色体上进行以序列表中序列5(seqid№：5)和序列6(seqid№：6)组成的引物lb2f/lb2r进行pcr扩增；将pcr扩增产物进行测序；

pcr扩增条件：pcr扩增体系25μl，其中包括模板dna50ng，上、下游引物各0.5μl(20umoll^-1)，taqdna聚合酶(5uμl^-1，takaraex)0.5μl，10×pcrbuffer2.5μl，dntpmix(2.5mmoll^-1)2μl，加无菌水补充反应体系至25μl。

pcr扩增程序为：94℃预变性5min；94℃变性40s，57℃退火40s，72℃延伸90s，共30个循环；最后72℃延伸10min，4℃保存。

(2)测序：pcr扩增产物测序采取两种方法，一是直接测序，二是克隆(利用北京全式金生物技术有限公司的peasy-t1载体)后进行测序，每个样品重复测序3-6次(测序由南京金斯瑞生物技术有限公司完成)。本发明分别采用上述两种方法对pcr产物测序，采用两种方法得到的测序结果一致才可确认检测普通小麦含有seqid№：2基因。

测序结果经过核苷酸序列分析软件(dnaman.6.0.3.99汉化版)软件拼接、比对分析，确定普通小麦含有seqid№：2基因。

(3)氨基酸序列推导

将普通小麦供试材料的等位变异核苷酸序列经dnaman.6.0.3.99汉化版软件分析推导相应氨基酸序列，得到肽链，判断其含有有典型的lmw-gs结构，n-末端为metsrvp-，属于lmw-m类型，含有7个cys。

如果该普通小麦供试材料的基因组dna即含有seqid№：2基因，而且又可以通经dnaman.6.0.3.99汉化版软件分析推导相应氨基酸序列，得到对应的肽链，判断其含有典型的lmw-gs结构，n-未端为metsrvp-，属于lmw-m类型，含有7个cys，则该普通小麦供试材料可做为备选材料，应用于小麦育种中，以达到获得优质小麦的目的。