核酸和重组质粒及其制备方法和应用与流程

本发明涉及蛋白表达与纯化领域，具体涉及一种核酸，一种重组质粒，一种重组质粒的制备方法，一种重组菌株、一种制备骨形态发生蛋白bmp-2成熟肽的方法以及相关的应用。
背景技术：
：骨形态发生蛋白(bonemorphogeneticprotein，bmp)属于转化生长因子(tgf-β)超家族成员，由骨基质分泌的一种疏水性蛋白。成熟肽中含有7个高度保守的半胱氨酸，它们形成三个链内二硫键及一个链间二硫键并将两条多肽链连接为二聚体，bmp家族包括bmp-1、bmp-2、bmp-4、bmp-6、bmp-7、bmp-9、bmp-12和bmp-14等，其中bmp-2具有明显诱导未分化的成纤维细胞走向分化为成骨细胞的作用并能调节成骨细胞和成软骨细胞的分化，诱导异位骨形成和促进骨折愈合的功能。bmp-2蛋白在骨科领域中治疗新鲜骨折、骨缺损、骨不连、脊柱融合、股骨头缺血性坏死，骨形态发生蛋白与基因治疗等方面具有应用前景。目前纯化的人和牛的bmp-2已经用于临床。它具有募集间充质干细胞、趋化、促进血管生成及加速骨的愈合修复，但bmp-2靠天然纯化提取的量极少，难以满足临床需求。cn101235084a公开了一种rhbmp-2(骨形态发生蛋白bmp-2)成熟肽在原核生物中表达方法：删除dsba基因信号肽第2-18个氨基酸编码基因，保留第一个甲硫氨酸的密码子作为起始密码子，得到的片段重组于表达载体中，获得重组质粒1；将骨形态发生蛋白bmp-2完整成熟肽的dna重组于重组质粒1中dsba基因的下游，获得重组质粒2：将重组质粒2转化入表达宿主菌株的菌体中，得到工程菌。经培养、添加诱导剂使目的基因表达，破菌、分离纯化得到dsbabmp-2融合蛋白，蛋白酶酶切dsba-bmp-2融合蛋白，经分离得到所述的骨形态发生蛋白bmp-2成熟肽。但是该专利申请的方法较复杂，rhbmp-2成熟肽的产量和纯度(或活性)仍有待提高。技术实现要素：本发明的目的是为了克服现有技术中骨形态发生蛋白bmp-2成熟肽制备方法复杂、产量低的缺陷，提供了一种核酸、重组质粒及其制备方法、重组菌株、制备骨形态发生蛋白bmp-2成熟肽的方法和相关的应用。采用本发明的方法，操作过程相对简单，表达骨形态发生蛋白bmp-2成熟肽产量高，并能保持蛋白活性。具体地，第一方面，本发明提供了一种核酸，该核酸能够编码骨形态发生蛋白bmp-2成熟肽，其中，所述核酸为seqidno：1所示的核酸，或者在seqidno：1的5’末端和/或3’末端连接有标签的核酸序列所示的核酸。第二方面，本发明提供了一种重组质粒，该重组质粒含有上述本发明提供的核酸。第三方面，本发明提供了一种重组质粒的制备方法，该方法包括以下步骤：(1)提供或制备具有seqidno：3所示序列的核酸序列；(2)将具有seqidno：3所示序列的核酸序列和pet30a(+)载体分别使用kpni和xhoi内切酶进行酶切，并将酶切后的产物连接。第四方面，本发明提供了一种重组菌株，所述重组菌株含有上述本发明提供的重组质粒。第五方面，本发明提供了一种制备骨形态发生蛋白bmp-2成熟肽的方法，该方法包括：第六方面，本发明提供了上述核酸、重组质粒或重组菌株在制备用于促进骨再生和/或骨修复的骨形态发生蛋白bmp-2成熟肽或药物中的应用。(1)表达：(37±0.5℃条件下)培养上述本发明提供的重组菌株至od600＝0.6-0.8时，加入异丙基-β-d-硫代半乳糖苷至其终浓度为0.1±0.02mm，在15±0.5℃的条件下诱导培养13-15h；(2)纯化：将诱导培养后的细胞产物进行裂解处理，将裂解处理获得的上清液加入ni-nta纯化柱中进行吸附处理，随后依次使用洗涤缓冲液和洗脱缓冲液分别对ni-nta纯化柱进行洗涤处理和洗脱处理，收集洗脱处理得到的洗脱液。上述的核酸、重组质粒、重组菌株在制备用于促进骨再生和/或骨修复的骨形态发生蛋白bmp-2成熟肽或药物中的应用。采用本发明的核酸、质粒或蛋白表达纯化方法，获得了高产量的骨形态发生蛋白bmp-2成熟肽，并且所得蛋白活性好。通过使用优选的表达载体及表达菌株，配合特定的表达和纯化蛋白的条件，可以进一步提高产量和活性。附图说明图1是实施例3制备的骨形态发生蛋白bmp-2成熟肽进行sds-page凝胶电泳检测图；图2是骨形态发生蛋白bmp-2成熟肽的碱性磷酸酶的酶活力测试结果图；图3分别是植入骨形态发生蛋白bmp-2成熟肽0周、2周、4周后大鼠股骨的x光检查结果图；图4是sd大鼠肌袋植入骨形态发生蛋白bmp-2成熟肽后新生组织he染色结果，其中，a为术后2周的结果，↑所示为成软骨细胞，▲所示为新生血管，所示为骨岛；b为术后4周的结果，↑所示为板层骨组织。具体实施方式在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。本发明提供了一种核酸，该核酸能够编码骨形态发生蛋白bmp-2成熟肽，其中，所述核酸为seqidno：1所示的核酸，或者在seqidno：1的5’末端和/或3’末端连接有标签的核酸序列所示的核酸。seqidno：1所示的核酸序列为：caagcgaaacacaaacagcgtaaacgcctgaaaagcagctgcaaacgtcatccgctgtacgttgactttagcgacgtcggttggaacgattggattgttgcaccgccgggttatcacgcattttattgtcacggcgagtgtccgtttccgctggcagatcatctgaatagcaccaaccacgcgattgttcagaccctggttaacagcgttaacagcaaaatcccgaaagcctgctgcgttccgaccgaactgtctgctattagcatgctgtacctggacgagaacgagaaagtcgtcctgaaaaactaccaggacatggtcgtcgaaggctgcggttgtcgctga在本发明中，所述“连接有标签”指的使用本领域常见的标签对seqidno：1所示的核酸进行添加修饰，便于进行蛋白制备或纯化。例如，连接有标签可以通过在seqidno：1所示的核酸的5’末端和/或3’末端连接下表1所示的标签(如poly-arg、poly-his、flag、strep-tagⅱ和c-myc中的至少一种)而获得。所述标签不会影响本发明的骨形态发生蛋白bmp-2成熟肽的活性，在实际应用过程中，可以根据需求选择是否添加标签。表1标签残基数氨基酸序列poly-arg5-6(通常为5个)rrrrr(seqidno：4)poly-his2-10(通常为6个)hhhhhh(seqidno：5)flag8dykddddk(seqidno：6)strep-tagⅱ8wshpqfek(seqidno：7)c-myc10eqkliseedl(seqidno：8)本发明提供的核酸序列通常可以用聚合酶链式反应(pcr)扩增法、重组法、或人工合成的方法获得。例如，本领域技术人员根据本发明所提供的核苷酸序列，可以很容易得到模板和引物，利用pcr进行扩增获得有关序列。一旦获得了有关核酸序列，就可以用重组法大批量的获得有关氨基酸序列。通常将所得核酸序列克隆入载体，再转入基因工程菌中，然后通过常规的方法从增殖后的宿主细胞分离得到有关核酸序列。此外，还可用公知的人工化学合成的方法来合成有关核酸序列。本发明的核酸所编码的bmp-2成熟肽的氨基酸序列如seqidno：2所示：qakhkqrkrlkssckrhplyvdfsdvgwndwivappgyhafychgecpfpladhlnstnhaivqtlvnsvnskipkaccvptelsaismlyldenekvvlknyqdmvvegcgcr(seqidno：2)本发明还提供了一种重组质粒，该重组质粒含有上述本发明提供的能够编码骨形态发生蛋白bmp-2成熟肽的核酸。在本发明中，所述重组质粒中所使用的质粒优选为pet30a(+)质粒(可以商购获得)。所述重组质粒可采用能够在载体多克隆位点具有切割位点的各种核酸内切酶(例如对于pet30a(+)，可用xholi、noti、eagi、hindiii、ecori、bamhi、ncoi、kpni、bgiii和ndei等)进行酶切获得线性质粒，与采用相同核酸内切酶切割的基因片段连接，获得重组质粒。本发明优选采用xholi和kpni对pet30a(+)进行双酶切。所述重组质粒为在pet30a(+)载体的kpni和xhoi酶切位点之间插入上述本发明提供的核酸而得到的表达载体。本发明还提供了一种重组质粒的制备方法，该方法包括以下步骤：(1)提供或制备具有seqidno：3所示序列的核酸序列；(2)将具有seqidno：3所示序列的核酸序列和pet30a(+)载体分别使用kpni和xhoi内切酶进行酶切，并将酶切后的产物连接。seqidno：3所示序列(含seqidno：1所示序列(划线部分)，即编码骨形态发生蛋白bmp-2成熟肽的核酸序列)为：cgccatatggacgacgacgacaagcaagcgaaacacaaacagcgtaaacgcctgaaaagcagctgcaaacgtcatccgctgtacgttgactttagcgacgtcggttggaacgattggattgttgcaccgccgggttatcacgcattttattgtcacggcgagtgtccgtttccgctggcagatcatctgaatagcaccaaccacgcgattgttcagaccctggttaacagcgttaacagcaaaatcccgaaagcctgctgcgttccgaccgaactgtctgctattagcatgctgtacctggacgagaacgagaaagtcgtcctgaaaaactaccaggacatggtcgtcgaaggctgcggttgtcgctgaggatccgcg本发明还提供了一种重组菌株，所述重组菌株含有上述本发明提供的重组质粒。本发明可以采用本领域常规方法将重组质粒转化进入宿主细胞(菌株)中从而得到重组菌株，如氯化钙法化学转化、高压电击转化，优选氯化钙法化学转化。所述宿主细胞可以为大肠杆菌，例如用于保存重组质粒的大肠杆菌dh5α菌株和/或top10菌株，用于表达的大肠杆菌origami2菌株。优选地，所述重组菌株为重组大肠杆菌origami2，也即以大肠杆菌origami2作为宿主细胞可以得到bmp-2成熟肽表达效果更好地重组菌株。本发明还提供了一种制备骨形态发生蛋白bmp-2成熟肽的方法，该方法包括：(1)表达：(37±0.5℃条件下)培养本发明的重组菌株至od600＝0.6-0.8时，加入异丙基-β-d-硫代半乳糖苷至其终浓度为0.1±0.02mm，在15±0.5℃的条件下诱导培养13-15h；(2)纯化：将诱导培养后的细胞产物进行裂解处理，将裂解处理获得的上清液加入ni-nta纯化柱中进行吸附处理，随后依次使用洗涤缓冲液和洗脱缓冲液分别对ni-nta纯化柱进行洗涤处理和洗脱处理，收集洗脱处理得到的洗脱液。本发明对步骤(1)中的培养条件没有特别的限定，可以采用常规条件。例如，所述培养温度可以为37±0.5℃，培养基可以为lb培养基，摇床转速可以为150-250rpm。本发明优选在裂解处理之前通过离心除去培养基，条件可以包括：温度为2-6℃，转速为6000-8000g，时间为8-12min。优选还包括使用pbs缓冲液重悬之后再次离心。根据本发明的优选实施方式，在步骤(2)中，所述裂解处理包括：将诱导培养后的细胞产物与裂解缓冲液接触，随后进行超声处理。所述裂解处理的条件可以包括：温度为2-6℃，时间为15-25min。优选地，所述裂解缓冲液含有100mmnacl和20mmtris，ph为8。可以采用常规的超声方式进行超声处理，优选地，所述超声处理为间歇式处理，例如，所述超声处理的条件可以包括：超声波破碎10±1s，停20±1s，共7-10min。在本发明中，所述吸附处理的条件可以包括：温度为2-6℃，时间为0.1-2小时。在本发明中，所述洗涤处理的条件可以包括：温度为2-6℃，次数为2-5。优选地，所述洗涤缓冲液含有：500mmnacl、20mmtris和100mm咪唑，ph为8。在本发明中，所述洗脱处理的温度可以为2-6℃。优选地，所述洗脱缓冲液含有：500mmnacl、20mmtris和500mm咪唑，ph为8。根据本发明，洗脱处理得到的蛋白洗脱液可以通过sds-page进行检测，bradford法测定蛋白的浓度，根据浓度用浓缩管对洗脱液进行浓缩。经无菌过滤后，-20℃保存。本发明还提供了上述核酸、重组质粒或重组菌株在制备用于治疗促进骨再生和/或骨修复的骨形态发生蛋白bmp-2成熟肽或药物中的应用。使用本发明的核酸、重组质粒或重组菌株能够制备高产量、高纯度、具有高骨再生和/或骨修复活性的骨形态发生蛋白bmp-2成熟肽，适于推广应用。以下将通过实施例对本发明进行详细描述。以下实施例中：核酸序列由华大基因合成。kpni、xhoi内切酶、t4连接酶和taqdna聚合酶均购自宝生物工程有限公司，货号分别为1618、1635、6022和r001a。凝胶回收试剂盒购自omega公司，货号d2500。质粒提取试剂盒购自omega公司，货号为d6943。大肠杆菌origami2感受态细胞购自millipore公司，货号为71346。ni-nta纯化柱购自ge公司，货号为17-5268-01。小鼠成肌细胞c2c12购自武汉普诺赛生命科技有限公司，货号为cl-0044。碱性磷酸酶检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所，货号为a059。实施例1本实施例用于说明本发明重组质粒的构建方法(1)双酶切载体pet30a(+)的酶切体系目的片段酶切体系注：目的片段为seqidno：3所示序列的核酸。将上述酶切体系各组分加入离心管中并涡旋混合均匀，置于37℃水浴3h。然后将载体酶切体系和目的片段酶切体系加入1重量％琼脂糖凝电泳中进行分离，在紫外光下，切割符合要求的电泳条带。使用凝胶回收试剂盒回收条带。(2)酶切产物连接将各组分加入体系中，涡旋混匀，16℃下水浴16h。实施例2本实施例用于说明重组菌株的构建(1)连接产物转化取100μl感受态细胞大肠杆菌top10加入到ep管中，然后加入10μl连接产物，用移液器轻轻混匀，冰上放置30min，转入42℃中水浴30s，立即转至冰上冷却2min。取500μl的lb培养基加入其中，37℃，150r培养1.5h。取50μl菌液涂布在含有卡拉霉素(50μg/ml)的lb平板上，37℃培养14h，有单个的菌落出现。(2)阳性克隆鉴定挑取单菌，加入到10μlddh2o中，移液枪轻轻混匀后进行pcr检测。pcr体系如下：上游引物序列(seqidno：9)：5’-caagcaagcgaaacacaaacag-3’下游引物序列(seqidno：10)：3’-ctcagcgacaaccgcagcctt-5’pcr反应条件：95℃反应5min；95℃变性30s，63℃退火30s，72℃延伸90s，共30个循环；72℃延伸10min，4℃保存。取5μl的pcr产物与10×loadingbuffer混匀，在1重量％琼脂糖凝胶中电泳，紫外光下验证目的条带存在。挑选有目的条带存在的菌株转入10mllb培养基中，37℃，250r培养12h，取样600μl样品加入400μl甘油，混匀密封后保存在-80℃超低温冰箱中。另取5ml菌液利用质粒提取试剂盒提取质粒，并将质粒送上海英俊公司测序。利用dnaman软件分析测序结果，与bmp-2基因序列比对，选择完全正确的质粒命名为pet30a(+)-bmp2。(3)表达菌株的构建将pet30a(+)-bmp2转化到大肠杆菌origami2感受态细胞中，转化过程同上。取50μl培养的菌液涂布在含有卡拉霉素(50μg/ml)及氯霉素(34μg/l)的lb平板上，37℃培养14h，有白色的单个菌落出现。实施例3本实施例用于说明本发明提供的制备骨形态发生蛋白bmp-2成熟肽的方法(1)取含有pet30a(+)-bmp2的origami2菌落加入10ml含有卡拉霉素的lb培养基中，培养15h。分别取1ml菌液转入100ml含卡拉霉素的lb培养基中，37℃，250rpm，培养od600＝0.6时，加入iptg至终浓度为0.1mm，15℃，220rpm诱导14h。(2)将步骤(1)得到的菌液全部装入50ml离心管中，4℃下8000g离心10min，除去上清后加入10ml预冷的pbs缓冲液重悬，4℃，8000g离心10min，弃上清，尽量除去残留的液体。(3)在管中加入20ml裂解缓冲液(100mmnacl，20mmtris，ph8.0)，4℃，100r反应20min，超声波破碎10s，停20s，共8min，11000r离心15min，取上清。(4)把上清加入到有1mlni-nta的纯化柱中，待上清全部流出后，加入4ml洗涤缓冲液(500mmnacl，20mmtris，100mm咪唑，ph8.0)，重复4次，然后加入4ml洗脱缓冲液(500mmnacl，20mmtris，500mm咪唑，ph8.0)，收集洗脱液。(5)将纯化后的洗脱液收集混合，并对蛋白进行sds-page检测，bradford法测定纯化蛋白的浓度，根据浓度用浓缩管对洗脱液进行浓缩。经无菌过滤后，-20℃保存。实施例4本实施例用于说明本发明制备的骨形态发生蛋白bmp-2成熟肽(rhbmp-2)的性能测试将实施例3制备的骨形态发生蛋白bmp-2成熟肽进行sds-page凝胶电泳检测，如图1所示。采用bradford法测定骨形态发生蛋白bmp-2成熟肽的表达产量达到1mg/l，纯度达到85％。对小鼠成肌细胞c2c12进行培养，按每孔1×105个细胞接种于含10％胎牛血清(fbs)的dmem培养基的24孔细胞培养板中，置于5％的二氧化碳培养箱种37℃培养24h后，向各孔中加入浓度分别为10μg/ml、20μg/ml、40μg/ml、60μg/ml、80μg/ml的rhbmp-2，选择pbs作为空白对照。诱导培养4d后，收集细胞，用pbs缓冲液洗涤2次后，利用碱性磷酸酶检测试剂盒测定酶活力，通过标准曲线计算akp活力，结果如图2所示。碱性磷酸酶活性检测显示加入不同浓度的rhbmp-2均高于空白对照组，有显著性差异(p＜0.05)，rhbmp-2具有成骨活性良好。sd大鼠肌袋rhbmp-2异位成骨动物实验：将合成的rhbmp-2蛋白冻干埋入大鼠的股四头肌内，手术过程如下：7重量％水合氯醛腹腔内注射麻醉，成功后备皮，常规消毒铺巾，选取sd大鼠右大腿后方中上侧，作一切口长约1cm，分离筋膜后暴露股四头肌，在肌肉上钝性分离，沿肌纤维方向做一长、深均0.5cm的肌袋(勿穿破肌肉)，植入rhbmp-2蛋白(1μg)，缝合肌袋及皮肤，标记。左侧大腿为空白对照组。术后青霉素20万u腹腔内注射，连续三天。0、2、4周时x光检查(结果如图3所示)，植入2周和4周进行病理组织切片he染色(结果如图4所示)。图3和图4表明植入本发明的rhbmp-2显示出明确异位成骨，效果良好。以上实验结果表明，使用seqidno：1所示的核酸转化表达菌株大肠杆菌origami2能够以较高产量和纯度表达骨形态发生蛋白bmp-2成熟肽。进一步地，本发明的发明人发现：使用其它常规表达菌株(如大肠杆菌rosetta-gami2)表达的bmp-2成熟肽产量较少，而且纯化的时候存在难以去除的杂蛋白，致使最终产物纯度不高。因此，使用优选的大肠杆菌origami2作为表达菌株比使用其它常规表达菌株转化seqidno：1所示的核酸时，骨形态发生蛋白bmp-2成熟肽的产量和纯度进一步提高。以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于此。在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，包括各个技术特征以任何其它的合适方式进行组合，这些简单变型和组合同样应当视为本发明所公开的内容，均属于本发明的保护范围。sequencelisting<110>中国人民解放军第三军医大学第一附属医院<120>核酸和重组质粒及其制备方法和应用<130><160>10<170>patentinversion3.3<210>1<211>345<212>dna<213>artificialsequence<220><223>thesequenceissynthesized<400>1caagcgaaacacaaacagcgtaaacgcctgaaaagcagctgcaaacgtcatccgctgtac60gttgactttagcgacgtcggttggaacgattggattgttgcaccgccgggttatcacgca120ttttattgtcacggcgagtgtccgtttccgctggcagatcatctgaatagcaccaaccac180gcgattgttcagaccctggttaacagcgttaacagcaaaatcccgaaagcctgctgcgtt240ccgaccgaactgtctgctattagcatgctgtacctggacgagaacgagaaagtcgtcctg300aaaaactaccaggacatggtcgtcgaaggctgcggttgtcgctga345<210>2<211>114<212>prt<213>bmp-2成熟肽<400>2glnalalyshislysglnarglysargleulyssersercyslysarg151015hisproleutyrvalasppheseraspvalglytrpasnasptrpile202530valalaproproglytyrhisalaphetyrcyshisglyglucyspro354045pheproleualaasphisleuasnserthrasnhisalailevalgln505560thrleuvalasnservalasnserlysileprolysalacyscysval65707580prothrgluleuseralailesermetleutyrleuaspgluasnglu859095lysvalvalleulysasntyrglnaspmetvalvalgluglycysgly100105110cysarg<210>3<211>378<212>dna<213>artificialsequence<220><223>thesequenceissynthesized<400>3cgccatatggacgacgacgacaagcaagcgaaacacaaacagcgtaaacgcctgaaaagc60agctgcaaacgtcatccgctgtacgttgactttagcgacgtcggttggaacgattggatt120gttgcaccgccgggttatcacgcattttattgtcacggcgagtgtccgtttccgctggca180gatcatctgaatagcaccaaccacgcgattgttcagaccctggttaacagcgttaacagc240aaaatcccgaaagcctgctgcgttccgaccgaactgtctgctattagcatgctgtacctg300gacgagaacgagaaagtcgtcctgaaaaactaccaggacatggtcgtcgaaggctgcggt360tgtcgctgaggatccgcg378<210>4<211>5<212>prt<213>artificialsequence<220><223>thesequenceissynthesized<400>4argargargargarg15<210>5<211>6<212>prt<213>artificialsequence<220><223>thesequenceissynthesized<400>5hishishishishis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