本发明涉及生物化工技术领域，具体涉及一种低分子量肝素钠的生产方法。
背景技术：
肝素是广泛存在于动物器官和组织(如小肠粘膜、肺等)中提取的硫酸化的葡糖胺聚糖化合物，具有抗凝、抗炎、抗过敏、抗病毒、抗癌、降血脂等多种生物学功能。而低分子肝素是由普通肝素经物理、化学或酶解聚方法而得，分子量范围为3000～8000，具有较肝素更优的抗血栓活性，且与肝素相比，出血副作用少、生物利用度高、半衰期长、抗凝效果可以预测且无需实验室监测，目前临床适应症不断扩大。
目前，低分子量肝素(包括低分子量肝素钠和低分子量肝素钙)的生产均是使用肝素钠精品作为起始原料，通过降解得到的小分子肝素制品，具有生物利用率高、血浆半衰期长等优点，特别是其引起的出血副作用大幅降低。目前，低分子量肝素(钠)的生产制备多是以精品肝素钠作为起始原料，制得低分子量肝素钠的成本较高；现有技术cn103214596a公开了一种由肝素钠粗品直接生产低分子量肝素钠的方法，该方法采用肝素钠粗品为原料制备低分子量肝素钠，但是其制备工艺中仅使用超滤器对肝素中的蛋白等大分子物质进行截留，这样的处理工艺难免会使肝素钠成品中残留一定量的小分子蛋白等杂质，使得最终低分子量肝素钠的蛋白含量偏高，从而影响低分子量肝素钠的质量。
技术实现要素：
为了解决上述技术问题，本发明提供了一种低分子量肝素钠的生产方法。
本发明的技术方案为：
一种低分子量肝素钠的生产方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)称取80～120g的粗品肝素钠，用纯化水溶解，并控制溶液温度为30℃以下，搅拌溶解，制备成10％～20％(w/v)的粗品肝素钠溶液；
(2)步骤(1)得到的粗品肝素钠溶加入浓度为2％的nacl溶液，制成5％～10％(w/v)的粗品肝素钠溶液，再加入碱性蛋白酶，于35～50℃下保温酶解3～6h，得到酶解液；
(3)将步骤(2)所得酶解液升温至90～96℃灭活，降温至40～50℃，滴加naoh溶液调节ph为11～12，加入蒙脱土，搅拌后高速离心，取上层清液；
(4)将步骤(3)所得层清液降温至0～4℃之间，加入聚合硅酸铝盐，用hcl溶液调节ph值至2～3，高速离心，弃去不溶杂质；
(5)步骤(4)所得清液加naoh溶液调节ph为5.8～7.0，加入0.3～0.8倍溶液体积的无水乙醇沉淀，调整温度至0～4℃，放置5～12h，收集沉淀物，并将沉淀物溶于4～8倍体积的蒸馏水中，完全溶解后，加入溶液体积0.5％～1.2％的过氧化氢氧化8～12h，用滤膜过滤，加入溶液体积2倍量的浓度为95％乙醇沉淀，沉淀放置6～15h，得到沉淀物；
(6)将步骤(5)所得沉淀物溶于蒸馏水中，搅拌下缓慢加入亚硝酸钠降解肝素钠，直至降解反应结束，加入用氢氧化钠，再加入硼氢化钠对肝素钠进行还原；
(7)在步骤(6)还原结束后使用超滤器进行大分子截留，超滤液中加入乙醇沉淀，用乙醇脱水干燥后即得低分子量肝素钠。
进一步地，步骤(2)中，所述碱性蛋白酶用量为粗品肝素钠溶液的0.5％～1％。
进一步地，步骤(3)中，所述蒙脱土的量为步骤(2)所得酶解液质量的0.10～0.15％，所述蒙脱土的目粒度为150～650目。
进一步地，步骤(6)中，所述亚硝酸钠降解肝素钠的反应条件为：hcl溶液调节ph值2.6～3.5，温度15～22℃，添加亚硝酸钠直至使用淀粉指示剂检测溶液不变蓝色为止。
进一步地，步骤(7)中，还原结束后采用1万分子量的超滤器对大分子进行截留，调节超滤液的ph到6.2～7.0，再加入超滤液体积1.5倍的乙醇沉淀3～12小时，最后用浓度为95％的乙醇脱水干燥，即得低分子量肝素钠。
本发明与现有技术相比具有如下优点：
1、本发明采用了超滤器进行大分子量的截留，使用超滤法也使得生产出的低分子量肝素中的残留蛋白质等大分子物质一同被截留掉，提高了低分子量肝素的安全性。
2、本发明采用粗品肝素钠作为原料制备低分子量肝素钠，制备成本低；在制备低分子量肝素钠的工艺中，使用碱性蛋白酶酶解粗品肝素钠中含有的蛋白质，目的是进一步纯化肝素钠；在肝素钠粗品中，有部分肝素分子是和蛋白质分子通过一定的化学键连接在一起的，在碱性蛋白酶的作用下，能水解这种连接，从而使肝素游离出来，进一步提高产品的收率，并且，有助于除去这部分蛋白质，获得纯度更高的肝素钠；使用蒙脱土对碱性蛋白进行加速吸附沉淀，蒙脱土对蛋白质有吸附作用；选用絮凝剂中的聚合硅酸铝盐对酸性蛋白进行加速吸附沉淀，在低ph值条件下，聚合硅酸铝盐能快速吸附溶液中的酸性蛋白，采用蒙脱土及聚合硅酸铝盐吸附蛋白质后再通过高速离心，能很好且更迅速的除去溶液中的各种蛋白成分；综上所述，该粗品肝素钠生产低分子量肝素钠的方法的优点是低分子量肝素钠制备成本低，所得低分子量肝素钠蛋白含量低、纯度高，而且收率高。
具体实施方式
实施例1
本实施例提供一种低分子量肝素钠的生产方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)称取80g的粗品肝素钠，用纯化水溶解，并控制溶液温度为30℃以下，搅拌溶解，制备成10％(w/v)的粗品肝素钠溶液；
(2)步骤(1)得到的粗品肝素钠溶加入浓度为2％的nacl溶液，制成5％(w/v)的粗品肝素钠溶液，在加入碱性蛋白酶，于35℃下保温酶解3h，得到酶解液；
(3)将步骤(2)所得酶解液升温至90℃灭活，降温至40℃，滴加naoh溶液调节ph为11，加入蒙脱土，搅拌后高速离心，取上层清液；
(4)将步骤(3)所得层清液降温至0℃之间，加入聚合硅酸铝盐，用hcl溶液调节ph值至2，高速离心，弃去不溶杂质；
(5)步骤(4)所得清液加naoh溶液调节ph为5.8，加入0.3倍溶液体积的无水乙醇沉淀，调整温度至0℃，放置5h，收集沉淀物，并将沉淀物溶于4倍体积的蒸馏水中，完全溶解后，加入溶液体积0.5％的过氧化氢氧化8h，用滤膜过滤，加入溶液体积2倍量的浓度为95％乙醇沉淀，沉淀放置6h，得到沉淀物；
(6)将步骤(5)所得沉淀物溶于蒸馏水中，搅拌下缓慢加入亚硝酸钠降解肝素钠，直至降解反应结束，加入用氢氧化钠，再加入硼氢化钠对肝素钠进行还原；
(7)在步骤(6)还原结束后使用超滤器进行大分子截留，超滤液中加入乙醇沉淀，用乙醇脱水干燥后即得低分子量肝素钠。
进一步地，步骤(2)中，所述碱性蛋白酶用量为粗品肝素钠溶液的0.5％。
进一步地，步骤(3)中，所述蒙脱土的量为步骤(2)所得酶解液质量的0.10％，所述蒙脱土的目粒度为150目。
进一步地，步骤(6)中，所述亚硝酸钠降解肝素钠的反应条件为：hcl溶液调节ph值2.6，温度15℃，添加亚硝酸钠直至使用淀粉指示剂检测溶液不变蓝色为止。
进一步地，步骤(7)中，还原结束后采用1万分子量的超滤器对大分子进行截留，调节超滤液的ph到6.2，再加入超滤液体积1.5倍的乙醇沉淀3小时，最后用浓度为95％的乙醇脱水干燥，即得低分子量肝素钠。
实施例2
一种低分子量肝素钠的生产方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)称取120g的粗品肝素钠，用纯化水溶解，并控制溶液温度为30℃以下，搅拌溶解，制备成20％(w/v)的粗品肝素钠溶液；
(2)步骤(1)得到的粗品肝素钠溶加入浓度为2％的nacl溶液，制成10％(w/v)的粗品肝素钠溶液，在加入碱性蛋白酶，于50℃下保温酶解6h，得到酶解液；
(3)将步骤(2)所得酶解液升温至96℃灭活，降温至50℃，滴加naoh溶液调节ph为12，加入蒙脱土，搅拌后高速离心，取上层清液；
(4)将步骤(3)所得层清液降温至4℃之间，加入聚合硅酸铝盐，用hcl溶液调节ph值至3，高速离心，弃去不溶杂质；
(5)步骤(4)所得清液加naoh溶液调节ph为7.0，加入0.8倍溶液体积的无水乙醇沉淀，调整温度至4℃，放置12h，收集沉淀物，并将沉淀物溶于8倍体积的蒸馏水中，完全溶解后，加入溶液体积1.2％的过氧化氢氧化12h，用滤膜过滤，加入溶液体积2倍量的浓度为95％乙醇沉淀，沉淀放置15h，得到沉淀物；
(6)将步骤(5)所得沉淀物溶于蒸馏水中，搅拌下缓慢加入亚硝酸钠降解肝素钠，直至降解反应结束，加入用氢氧化钠，再加入硼氢化钠对肝素钠进行还原；
(7)在步骤(6)还原结束后使用超滤器进行大分子截留，超滤液中加入乙醇沉淀，用乙醇脱水干燥后即得低分子量肝素钠。
进一步地，步骤(2)中，所述碱性蛋白酶用量为粗品肝素钠溶液的1％。
进一步地，步骤(3)中，所述蒙脱土的量为步骤(2)所得酶解液质量的0.15％，所述蒙脱土的目粒度为650目。
进一步地，步骤(6)中，所述亚硝酸钠降解肝素钠的反应条件为：hcl溶液调节ph值3.5，温度22℃，添加亚硝酸钠直至使用淀粉指示剂检测溶液不变蓝色为止。
进一步地，步骤(7)中，还原结束后采用1万分子量的超滤器对大分子进行截留，调节超滤液的ph到7.0，再加入超滤液体积1.5倍的乙醇沉淀12小时，最后用浓度为95％的乙醇脱水干燥，即得低分子量肝素钠。
实施例3
一种低分子量肝素钠的生产方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)称取100g的粗品肝素钠，用纯化水溶解，并控制溶液温度为30℃以下，搅拌溶解，制备成15％(w/v)的粗品肝素钠溶液；
(2)步骤(1)得到的粗品肝素钠溶加入浓度为2％的nacl溶液，制成8％(w/v)的粗品肝素钠溶液，在加入碱性蛋白酶，于40℃下保温酶解4.5h，得到酶解液；
(3)将步骤(2)所得酶解液升温至93℃灭活，降温至45℃，滴加naoh溶液调节ph为11.5，加入蒙脱土，搅拌后高速离心，取上层清液；
(4)将步骤(3)所得层清液降温至3℃之间，加入聚合硅酸铝盐，用hcl溶液调节ph值至2.5，高速离心，弃去不溶杂质；
(5)步骤(4)所得清液加naoh溶液调节ph为6.5，加入0.5倍溶液体积的无水乙醇沉淀，调整温度至3℃，放置8h，收集沉淀物，并将沉淀物溶于6倍体积的蒸馏水中，完全溶解后，加入溶液体积0.8％的过氧化氢氧化10h，用滤膜过滤，加入溶液体积2倍量的浓度为95％乙醇沉淀，沉淀放置10h，得到沉淀物；
(6)将步骤(5)所得沉淀物溶于蒸馏水中，搅拌下缓慢加入亚硝酸钠降解肝素钠，直至降解反应结束，加入用氢氧化钠，再加入硼氢化钠对肝素钠进行还原；
(7)在步骤(6)还原结束后使用超滤器进行大分子截留，超滤液中加入乙醇沉淀，用乙醇脱水干燥后即得低分子量肝素钠。
进一步地，步骤(2)中，所述碱性蛋白酶用量为粗品肝素钠溶液的0.8％。
进一步地，步骤(3)中，所述蒙脱土的量为步骤(2)所得酶解液质量的0.12％，所述蒙脱土的目粒度为400目。
进一步地，步骤(6)中，所述亚硝酸钠降解肝素钠的反应条件为：hcl溶液调节ph值3.2，温度18℃，添加亚硝酸钠直至使用淀粉指示剂检测溶液不变蓝色为止。
进一步地，步骤(7)中，还原结束后采用1万分子量的超滤器对大分子进行截留，调节超滤液的ph到6.8，再加入超滤液体积1.5倍的乙醇沉淀8小时，最后用浓度为95％的乙醇脱水干燥，即得低分子量肝素钠。
以上所述实施例仅表达了本申请的具体实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本申请保护范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请技术方案构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本申请的保护范围。