硒化莲藕多糖及其制备方法和应用与流程

本发明涉及硒化多糖领域，具体而言，涉及硒化莲藕多糖及其制备方法和应用。

背景技术：

硒是生命必需的微量元素，中国约有2/3的地区属于国际公认的缺硒地区，其中近1/3为严重缺硒地区。许多疾病比如克山病、糖尿病、心血管疾病等都与体内硒元素缺乏有关。

硒化合物的存在形式包括有机硒和无机硒两种，有机硒主要包括：硒多糖、硒氨基酸、硒蛋白和硒核酸等，无机硒主要包括：硒酸和亚硒酸。无机硒具有蓄积性毒性和致突变作用，使用时剂量难以控制，在医疗保健行业应用范围较窄。相较于无机硒而言，有机硒食用安全、无毒副作用，吸收率高，且营养价值也较高。采用液体发酵的方法对大球盖菇菌丝进行富硒培养，并提取硒多糖进行抗氧化能力测定的研究结果表明,大球盖菇硒多糖能明显提高小炙血中sod、gsh-px的含量,能在一定程度上显著降低血中mda的含量。

多糖的生物活性往往与其结构单元的构成及糖链上所连接的基团有着直接的关系，采取一定的方法对多糖分子结构进行适当修饰可以改变多糖的活性。将硒与多糖结合使之成为有机硒化合物硒多糖，它不仅保持了多糖的基本构型和生物活性，而且有机硒化合物很大程度更易于为机体吸收和利用，降低了毒性和不良反应，是一种安全、有效、健康的硒营养源。硒化多糖因具有特殊的化学键(se＝o)，因此较普通多糖具有了更多的生理活性，且更易被机体吸收和利用。但是由于天然硒多糖在生物体内的含量甚微，一定程度上限制硒多糖的研究。通过对多糖的硒化修饰，将硒或含硒的功能基团接枝到多糖分子上，是获得较高活性硒多糖的一种有效途径。

近几年，人们开始对提取出来的天然多糖进行硒化来提高生物活性和生物利用度，研制高含硒量的硒化多糖,具有重要的理论价值和潜在的应用价值。

莲藕(nulumbonuciferageartn)，属睡莲科植物，是一种多年生宿根水生草本植物，莲藕的肥嫩根状茎供食用，是我国极重要的水生蔬菜。不但味道鲜美，营养丰富，同时还具备改善血症、缓解疲劳、降压、延缓衰老等功效。现代研究已经不满足于传统的烹饪给人们带来的感观感受，而深入研究莲藕中包含的生理活性成分，通过物质和功效的对应研究进一步明确莲藕中起作用的成分，从而有助于开发新一代功能产品。莲藕中多糖含量丰富，具有多种生物活性功能。

现有技术中对于莲藕多糖也有着一定的研究基础，例如：罗登宏(罗登宏，周桃英，袁仲，等.莲藕多糖的降血糖活性及对体内抗氧化能力的影响.《安微农业科学》，2011，39(6)：3334-3335)的研究表明莲藕多糖还可不同程度地提高糖尿病小鼠肝、肾和胰腺等重要组织的sod活性,降低mda含量。周桃英(周桃英，袁仲，崔东波.莲藕多糖保健饮料抗疲劳活性试验研究.《江苏农业科学》，2011，(1)：329-330)发现莲藕多糖保健饮料具有显著的抗疲劳活性，它能显著延长小鼠负重游泳时间,降低血乳酸、血清尿素氮的含量,提高肝糖原含量。王瑜(王瑜，高畅，姜丽艳，张博珣，梁小璇，佟立全，孟庆繁.莲藕多糖的提取及生物活性的研究.《食品科技》，2007(5)：113-116)发现莲藕多糖对超氧阴离子的清除作用较弱，对羟自由基具有很强的清除作用，并能有效抑制过氧化氢诱导的红细胞氧化溶血。

虽然目前现有技术中对于莲藕多糖的提取以及进一步利用有着较多的研究，然而，对于硒化莲藕多糖的制备以及性质和应用等方面研究并不多见，虽然现有技术中已经在此方面进行了一定的尝试，但效果并不理想，对于其作用机理也没有进行深入研究。因此，进一步探索和优化莲藕多糖的提取工艺，以及硒化莲藕多糖的合成工艺以及其作用机理，将具有重要的使用价值。

有鉴于此，特提出本发明。

技术实现要素：

本发明的第一目的在于提供一种硒化莲藕多糖的制备方法，所述方法具有制备流程简便，所制得的硒化莲藕多糖硒含量高等优点。

本发明的第二目的在于提供一种由本发明所述方法制备的硒化莲藕多糖，本发明硒化莲藕多糖硒含量高，同时能够有效抑制脂肪细胞分化，并起到有效控脂、降脂的作用。

本发明的第三个目的在于提供一种本发明所述硒化莲藕多糖在制备降脂药物或保健品中的应用。

本发明的第四个目的在于提供一种包含本发明所述硒化莲藕多糖的药物、药物组合物或者保健品。

为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：

一种硒化莲藕多糖的制备方法，所述方法包括如下步骤：将莲藕浸提、醇沉，得到莲藕多糖粗品；然后，将莲藕多糖粗品纯化，得到莲藕多糖；所得莲藕多糖与硒化试剂反应，得到硒化莲藕多糖。

可选的，本发明中，所述将莲藕浸提、醇沉包括如下步骤：将莲藕粉碎，然后在热水中浸提，所得提取液中加入乙醇，静置过夜，离心得到沉淀物；将所得沉淀物溶解，然后酶解处理，脱蛋白后透析，所得上清液醇沉，得到莲藕多糖粗品。

可选的，本发明中，所述酶为木瓜蛋白酶和淀粉酶。

可选的，本发明中，所述将莲藕多糖粗品纯化包括如下步骤：将莲藕多糖粗品以离子交换柱层析纯化，并采用不同浓度的氯化钠进行洗脱，分别收集多糖单一峰；将采用0.3％氯化钠洗脱所得洗脱液再次层析纯化，收集单一峰；所收集的多糖单一峰洗脱液分别旋转蒸发后醇沉，得到莲藕多糖。

可选的，本发明中，所述硒化试剂亚硒酸钠。可选的，本发明中，莲藕多糖与硒化试剂的质量比为1:3～3:1；优选的，莲藕多糖与硒化试剂的质量比为1:2～2:1；更优选的，莲藕多糖与硒化试剂的质量为1:1～2:1。

可选的，本发明中，莲藕多糖与硒化试剂反应的时间为24～48h；优选的，莲藕多糖与硒化试剂反应的时间为36～48h。

同时，本发明还提供了由本发明所述方法制得的硒化莲藕多糖。

同样的，本发明还提供了所述硒化莲藕多糖在制备降脂药物或保健品中的应用。

进一步的，本发明也提供了包含所述硒化莲藕多糖的药物、药物组合物或者保健品。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

本发明方法中，通过对莲藕粗多糖提取步骤以及纯化步骤的选择和调整，使得所制备的莲藕多糖纯度高，且不含有蛋白质或者核酸等杂质；

同时，通过对于硒化反应所用原料，以及原料配比和反应时间的调整和优化，也进一步提高了所得硒化莲藕多糖中的硒含量。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，以下将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1为硒化莲藕多糖(se-ngp-1)和莲藕多糖(ngp-1)对前脂肪细胞增殖影响的数据对比图；

图2为硒化莲藕多糖(se-ngp-1)和莲藕多糖(ngp-1)对前脂肪细胞分化影响的数据对比图；

图3为硒化莲藕多糖(se-ngp-1)对前脂肪细胞pparγ和c/ebpαmrna表达水平影响的数据对比图。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

有鉴于目前我国缺硒现象严重，同时有机硒是一种重要的硒营养补充剂，本发明中特采用反应合成的方法，将硒与莲藕多糖进行有机结合，这不仅能够有效的解决硒缺乏的问题，同时也能够起到良好的降脂保健效果，本发明硒化莲藕多糖的制备工艺可具体参考如下：

(1)莲藕粗多糖提取：

本发明中，是以莲藕为原料提取莲藕多糖，优选的，本发明中，是将莲藕粉碎后，再将莲藕渣进行热水浸提；

进一步优选的，可以将莲藕渣按照1:50的比例加入蒸馏水，然后在水浴条件下加热，水浴的温度优选的控制在100℃左右，水浴的时间控制在3h左右；

在浸提的同时，对体系进行减压浓缩，从而提高浸提物的浓度，而这也有利于进一步将浸提所得粗产品醇沉收集；

在一次浸提后，进行固液分离，将滤渣再次按照如上所述方法重复浸提两次，并将三次所得滤液合并；

然后，向合并的上清液中加入3倍体积的95％的乙醇溶液，并优选的在4℃条件下静置过夜，将沉淀物离心分离，收集固形物；

将收集的固形物在蒸馏水中溶解后，加入木瓜蛋白酶和淀粉酶，进行酶解处理，以除去莲藕多糖中所混有的蛋白和淀粉等杂质；酶解处理优选的在水浴条件下进行，水浴的温度优选的控制在37℃左右，水浴的时间控制在2h；

然后，按照体积比1:1加入sevage试剂，以除去蛋白质；优选的，所用sevage试剂中氯仿与正丁醇的体积比为4:1；

在加入sevage试剂后，进行反复的振荡，然后静置过夜，直至体系分层清晰；分液后保留水相，然后按照如上所述方法再次进行蛋白质除去，直至不出现蛋白质层；

然后，将水相收集，并于流动水相中用透析袋进行透析，透析的时间优选的在2d左右，然后，将清夜收集，醇沉，收集沉淀即为莲藕粗多糖；

(2)莲藕粗多糖纯化

莲藕粗多糖主要是通过层析的方法进行提纯，提纯方法参考如下：

首先，将莲藕多糖粗品以离子交换柱层析纯化，优选的，所用离子交换柱为dea52离子交换柱；此步骤中，所用洗脱剂为氯化钠溶液，并依次使用浓度为0～0.5mol/l的氯化钠溶液进行洗脱，并分别收集由不同浓度洗脱液洗脱得到的单一峰的莲藕多糖；

然后，将以0.3％氯化钠洗脱所得洗脱液再次层析纯化，收集单一峰；优选的，此步骤中使用sephadexg-100进行纯化；

所收集的多糖单一峰洗脱液分别旋转蒸发后醇沉，得到莲藕多糖。所得莲藕多糖的平均分子量约为5600，且不含蛋白质和核酸；

(3)莲藕多糖硒化

将提纯后的莲藕多糖按照1:3～3:1(质量比)的比例与硒化制剂进行反应，反应的时间控制在24～48h，得到硒化莲藕多糖；

具体反应步骤可参考如下：将莲藕多糖、硒化试剂加入溶液中反应，然后加入水终止反应，反应过程中自然升温/降温；反应液醇沉后，将沉淀物过滤得到，然后再次溶解，加入naoh调节溶液的ph至7～8，然后再次醇沉，将所得沉淀物干燥，即得到产物硒化莲藕多糖。

经红外检测，由本发明方法所制备的硒化莲藕多糖化合物中，有明显的se＝o双键，且产物中硒含量较高，是一种高硒含量的多糖化合物。

进一步的，本发明硒化莲藕多糖化合物能够有效抑制前脂肪细胞分化，且在相同浓度条件下，抑制能力要高于莲藕多糖。因而，本发明硒化莲藕多糖具有良好的降脂活性，能够进一步用于制备相应的降脂类药品或者保健品。

实施例1

(1)取粉碎后所得莲藕渣，按照1：50加入蒸馏水,于100℃水浴中煮3h，进行热水浸提；同时，在浸提过程中，减压浓缩浸提液；

将浸提后体系过滤，滤渣按照如上方法再进行两次浸提；

将三次浸提所得浸提液收集，然后加入3倍体积的95％乙醇，并在4℃静置过夜；离心分出沉淀物,溶于蒸馏水中，得到溶液

称取木瓜蛋白酶和淀粉酶,加入所得溶液中，将体系于37℃水浴中2h；然后按1∶1的体积加入sevage试剂(氯仿∶正丁醇＝4∶1,体积比),反复振荡，静置过夜直至分层清晰，保留水相；

然后，按照如前所述反复除蛋白直至无蛋白层，然后于流动水中用透析袋透析2d,95％乙醇醇沉后收集沉淀，即为莲藕多糖粗品；

(2)使用dea52离子交换柱层析纯化粗多糖，使用0～0.5％氯化钠洗脱，并分别收集由不同浓度洗脱液洗脱得到的单一峰的莲藕多糖；

然后，将以0.3％氯化钠洗脱所得洗脱液再次使用sephadexg-100进行纯化，收集单一峰；

所收集的多糖单一峰洗脱液分别旋转蒸发后醇沉，得到莲藕多糖。

(3)将所得莲藕多糖与亚硒酸钠按照2:1的比例(莲藕多糖质量与亚硒酸钠质量比为2:1)加入有机溶剂中，并在搅拌条件下反应36h，然后加入水终止反应；

反应液醇沉后，将沉淀物过滤得到，然后再次溶解，加入naoh调节溶液的ph至7～8，然后再次醇沉，将所得沉淀物干燥，即得到产物硒化莲藕多糖。

经红外光谱检测，由实施例1方法所制备的硒化莲藕多糖中含有se＝o键；同时，经检测，所得硒化莲藕多糖中，硒含量为1570μg/g。

实施例2

按照实施例1的方法制备硒化莲藕多糖，其中，步骤(3)中，莲藕多糖与亚硒酸钠的比例为3:1；

经红外光谱检测，由实施例2方法所制备的硒化莲藕多糖中含有se＝o键；同时，经检测，所得硒化莲藕多糖中，硒含量为1350μg/g。

实施例3

按照实施例1的方法制备硒化莲藕多糖，其中，步骤(3)中，莲藕多糖与亚硒酸钠的比例为1:1；

经红外光谱检测，由实施例3方法所制备的硒化莲藕多糖中含有se＝o键；同时，经检测，所得硒化莲藕多糖中，硒含量为1425μg/g。

实施例4

按照实施例1的方法制备硒化莲藕多糖，其中，步骤(3)中，莲藕多糖与亚硒酸钠的比例为1:2；

经红外光谱检测，由实施例4方法所制备的硒化莲藕多糖中含有se＝o键；同时，经检测，所得硒化莲藕多糖中，硒含量为1380μg/g。

实施例5

按照实施例1的方法制备硒化莲藕多糖，其中，步骤(3)中，硒化反应的时间为30h；

经红外光谱检测，由实施例5方法所制备的硒化莲藕多糖中含有se＝o键；同时，经检测，所得硒化莲藕多糖中，硒含量为1170μg/g。

实施例6

按照实施例1的方法制备硒化莲藕多糖，其中，步骤(3)中，硒化反应的时间为42h；

经红外光谱检测，由实施例6方法所制备的硒化莲藕多糖中含有se＝o键；同时，经检测，所得硒化莲藕多糖中，硒含量为1420μg/g。

实验例1

实验材料：硒化莲藕多糖(se-ngp-1)，莲藕多糖(ngp-1)；其中，硒化莲藕多糖(se-ngp-1)由本发明实施例1方法制得；莲藕多糖(ngp-1)为本发明实施例1步骤(2)产物。

(1)硒化莲藕多糖(se-ngp-1)和莲藕多糖(ngp-1)对前脂肪细胞增殖的影响：

采用四甲基偶氮唑盐(mtt)法测定不同浓度的se-ngp-1和ngp-1对前脂肪细胞增殖能力的影响，结果如图1所示；

由图1的结果可知，在4d的实验时间内，se-ngp-1和ngp-1均不抑制3t3-l1前脂肪细胞的增殖。

(2)硒化莲藕多糖(se-ngp-1)和莲藕多糖(ngp-1)对前脂肪细胞分化的影响：

前脂肪细胞经诱导分化及不同浓度se-ng-1和ngp-1作用4d，通过对分化细胞油红染色后进行吸光度值测定，可以定量检测细胞内脂肪的含量，判断前脂肪细胞的分化程度，结果如图2所示；

由图2的结果可知，诱导4d后，在不同浓度下的se-ngp-1和ngp-1均可明显抑制3t3-l1前脂肪细胞的分化；而相同浓度下，se-ngp-1抑制前脂肪细胞分化的能力优于ngp-1。

(3)硒化莲藕多糖(se-ngp-1)对前脂肪细胞pparγ和c/ebpαmrna表达水平的影响：

前脂肪细胞经诱导分化及不同浓度se-ngp-1作用4d后用trizol抽提细胞总rna，逆转录合成cdna；real-timepcr结果如图3所示；

由图3的对照检测结果可知，se-ngp-1能降低前脂肪细胞分化过程中pparγ和c/ebpαmrna表达水平。由此可见，se-ngp-1抑制3t3-l1前脂肪细胞增殖和分化，其机制可能是通过抑制前脂肪细胞分化相关因子pparγ和c/ebpα的表达。

由如上三个实验对照检测结果可知，本发明硒化莲藕多糖能够有效抑制前脂肪细胞的分化，具有良好的降脂活性；同时，相较于莲藕多糖而言，硒化莲藕多糖的降脂活性更高。

尽管已用具体实施例来说明和描述了本发明，然而应意识到，在不背离本发明的精神和范围的情况下可以作出许多其它的更改和修改。因此，这意味着在所附权利要求中包括属于本发明范围内的所有这些变化和修改。