7‑羟基香豆素吡唑啉衍生物在制备GRP94抑制剂中的应用的制作方法

本发明涉及一种香豆素吡唑啉荧光化合物的应用，尤其涉及7-羟基香豆素吡唑啉衍生物即3-(1,5-二苯基-4,5-二氢-1h-吡唑-3-基)-7-羟基-2h-色烯-2-酮在制备grp94抑制剂中的应用。

背景技术：

grp94(葡萄糖调节蛋白94)由hsp90b1基因编码，是hsp90(热休克蛋白90)在内质网中的亚型，在结构上与hsp90高度保守。grp94主要参与细胞内分泌蛋白和膜蛋白的折叠和装配。临床研究表明，grp94参与黑色素瘤、卵巢癌、多发性骨髓瘤、肺癌等一系列癌症的发展和转移，grp94已成为肿瘤治疗的新靶点。此外，grp94也会参与到自身免疫以及炎症相关疾病中。grp94的分子伴侣功能主要依赖于它的atp酶结构域，在结构上不同于hsp90，因此设计合成特异性靶向grp94的抑制剂用于肿瘤等疾病的治疗具有重要意义。然而，目前关于grp94抑制剂的研究较少，亟待开发可以用于临床研究的grp94抑制剂。

香豆素是自然界中一类重要的天然有机化合物，具有抗肿瘤、抗菌、抗hiv、抗氧化、抗凝血、抗抑郁、消炎止痛和保护肝脏等药理作用。新生霉素是香豆素类抗生素的代表药，对多种癌细胞有抑制作用，能与抗癌药联合应用，逆转抗癌药的耐药性。新生霉素可抑制hsp90的活性，通过与hsp90的c端atp位点结合，而产生抗肿瘤作用。香豆素类化合物具有药理运用较广、生物利用度高、合成较为简单、分子量较小和低毒性等特点。

吡唑啉衍生物是一类重要的含氮五元杂环化合物。吡唑啉类化合物具有抗肿瘤、抗菌、抗病毒、抗变形虫、抗高血压、抗抑郁、消炎止痛和抑制免疫等功能。此类化合物还具有良好的光学性质，普遍应用于纺织品的荧光增白剂、荧光探针、染料等方面。

香豆素和吡唑啉衍生物均为重要的有机化合物，在有机合成领域获得广泛应用。3-(1,5-二苯基-4,5-二氢-1h-吡唑-3-基)-7-羟基-2h-色烯-2-酮即为香豆素吡唑啉衍生物，其结构式为：

分子式：c24h18n2o3

分子量：382.1317，性状：固体粉末。

经权威机构检索查新，利用上述香豆素吡唑啉衍生物3-(1,5-二苯基-4,5-二氢-1h-吡唑-3-基)-7-羟基-2h-色烯-2-酮作为grp94抑制剂的研究与应用，目前国内外尚未见报道。

技术实现要素：

针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种3-(1,5-二苯基-4,5-二氢-1h-吡唑-3-基)-7-羟基-2h-色烯-2-酮在制备grp94抑制剂中的应用。

本发明所述3-(1,5-二苯基-4,5-二氢-1h-吡唑-3-基)-7-羟基-2h-色烯-2-酮(hcp1)在制备grp94抑制剂中的应用。

其中：有效抑制grp94生物学功能的3-(1,5-二苯基-4,5-二氢-1h-吡唑-3-基)-7-羟基-2h-色烯-2-酮的浓度为1～10μm。

优选的，有效抑制grp94生物学功能的3-(1,5-二苯基-4,5-二氢-1h-吡唑-3-基)-7-羟基-2h-色烯-2-酮的浓度为10μm。

为了更好地理解本发明的实质，下面用3-(1,5-二苯基-4,5-二氢-1h-吡唑-3-基)-7-羟基-2h-色烯-2-酮的生化和细胞实验及结果来阐明其在制备grp94抑制剂及其相关研究中的应用。

采用生物化学、细胞生物学和分子生物学的方法，进行如下实验：其中所述3-(1,5-二苯基-4,5-二氢-1h-吡唑-3-基)-7-羟基-2h-色烯-2-酮在以下实验中简称hcp1。

1、hcp1与grp94直接相互作用

通过biacore表面等离子体共振的方法在体外检测hcp1与grp94蛋白之间的相互作用。将grp94蛋白固定于cm5芯片上，分别使用2.74μm,1.83μm,1.22μm,0.81μm和0.54μm的hcp1进行注射，获得hcp1与grp94相互作用时的传感图和平衡解离常数。

结果表明：通过biacoret200所得的响应值和hcp1成浓度对应关系，hcp1和grp94相互作用的平衡解离常数为1.683μm，说明hcp1可以直接结合到grp94上。(见图1)。

2、hcp1在细胞内与grp94共定位

利用hcp1的荧光特性，通过激光扫描共聚焦显微镜检测hcp1在a549细胞内的发光情况和分布情况。

通过免疫荧光染色检测hcp1与grp94在a549细胞内的共定位情况。

结果表明：(1)在405nm，488nm和546nm的激发波长下hcp1在细胞内发射荧光。633nm和647nm波长激发时hcp1不发荧光。hcp1分布于a549细胞的胞质中，在细胞核内没有分布。(2)hcp1和grp94在细胞内共定位。说明hcp1特异性的靶向grp94(见图2)。

3、hcp1抑制grp94的生物学功能

grp94作为内质网中重要的分子伴侣蛋白，参与协助tlr9由内质网到溶酶体和内体的转运过程。通过免疫荧光双染法检测hcp1对tlr9在a549细胞内由内质网向溶酶体转运的影响。使用溶酶体标记蛋白lamp2对溶酶体进行标记。a549细胞经grp94sirna干扰grp94的蛋白表达，hcp1(10μm)或hsp90α和hsp90β的抑制剂auy922(50nm)处理24h后进行免疫荧光双染检测tlr9和溶酶体的共定位情况。通过westernblot检测grp94sirna对grp94蛋白表达的干扰效率。

hsp90在胞质中的亚型hsp90α和hsp90β受抑制时会引起hsp70蛋白水平的升高，而grp94的抑制剂对hsp70的蛋白水平没有影响。使用不同浓度的hcp1(1μm，5μm和10μm)处理a549细胞24h,westernblot检测hsp70的蛋白水平变化。

结果表明：(1)hcp1处理和grp94sirna可以降低tlr9和溶酶体的共定位。说明hcp1可以抑制tlr9由内质网到溶酶体的转运。(2)hcp1处理并不引起细胞内hsp70蛋白水平的变化。说明hcp1抑制grp94的生物学功能，同时并不影响胞质中hsp90的功能。这为hcp1作为grp94的抑制剂提供了很好的理论基础(见图3)。

上述的实验数据统计学处理：

实验数据以平均值±标准误差表示，经t检验：p<0.05表示有显著性差异；p<0.01表示有极显著性差异。

由上述实验及其结果，可以得出如下结论：

hcp1与grp94直接相互作用。在细胞内hcp1仍然具有荧光特性，与grp94存在共定位。说明hcp1特异性的靶向grp94。hcp1抑制grp94协助tlr9在胞内的转运功能，并且不影响细胞质中hsp90的功能。这为hcp1作为grp94的抑制剂提供了很好的理论基础。

grp94作为hsp90在内质网中的亚型，参与到肿瘤，自身免疫和炎症相关的疾病中。grp94的抑制剂可以通过抑制grp94的生物学功能抑制肿瘤的发展和转移。本发明提供的3-(1,5-二苯基-4,5-二氢-1h-吡唑-3-基)-7-羟基-2h-色烯-2-酮为研制开发有关grp94的抑制剂奠定了基础。该化合物还可以作为一种有效的化学工具为研究grp94的生物学功能提供有力手段。

附图说明

图1：hcp1与grp94直接相互作用。

a：hcp1化学结构式。

b：通过biacoret200测定hcp1和grp94之间的结合情况。不同浓度的hcp1(2.74μm,1.83μm,1.22μm,0.81μm和0.54μm)与固定于cm5芯片的grp94蛋白相互作用，测定其响应值。平衡解离常数kd＝1.683μm。

图2：hcp1与grp94共定位。

a：hcp1在细胞内的发光情况。hcp1(10μm)处理a549细胞3h，使用激光扫描共聚焦显微镜观察不同波长激发光(405nm，488nm，546nm，633nm和647nm)激发时hcp1在细胞内的发光情况。bar＝20μm。

b：hcp1与grp94的共定位情况。hcp1(10μm)处理a549细胞3h，免疫荧光染色结果显示hcp1和grp94共定位(共定位系数：0.83)，dapi染细胞核。bar＝20μm。

图3：hcp1抑制grp94的功能。

a：hcp1抑制tlr9与溶酶体的共定位。使用grp94sirna干扰grp94的蛋白表达，hcp1(10μm)或auy922(50nm)处理a549细胞24h，免疫荧光双染结果显示grp94sirna和hcp1处理可以抑制tlr9和lamp2的共定位，dapi染细胞核。共定位系数分别为control(0.75)，sigrp94(0.59)，hcp1(0.57)和auy922(0.71)。bar＝20μm。

b：grp94sirna的干扰效率。westernblot结果显示grp94sirna处理a549细胞24h的干扰效率。

c：hcp1不影响hsp70的蛋白水平。不同浓度的hcp1(1μm，5μm，10μm)处理a549细胞24h，westernblot检测hsp70的蛋白水平。

具体实施方式

实施例1：3-(1,5-二苯基-4,5-二氢-1h-吡唑-3-基)-7-羟基-2h-色烯-2-酮的制备

将2,4-二羟基苯甲醛(20mmol)、乙酰乙酸乙酯(24mmol)溶于30ml乙醇溶液中，滴加1ml哌啶作催化剂。反应液加热回流3h至反应终点，冷至室温后析出大量草绿色固体。抽滤得粗产品，再用乙醇重结晶得到绿色产品7-羟基-3-乙酰基香豆素。

将7-羟基-3-乙酰基香豆素、苯甲醛与催化量的哌啶(约1ml)溶于20ml无水乙醇，反应液回流4h冷至室温。由于此反应在弱碱条件下转化率低，故加入10当量的苯甲醛反应，反应进行的彻底，多余的苯甲醛用亚硫酸氢钠水溶液洗去，再用乙酸将溶液调至中性，析出沉淀。抽滤，得粗产品，用无水乙醇重结晶得到α,β-不饱和化合物，可直接用于下一步反应。

将上述α,β-不饱和化合物(2mmol)、苯肼(6mmol)溶于热乙醇(50ml)中，滴加催化量的乙酸，回流反应4h。反应液冷至室温后倒入2倍体积冰水中，析出深红色固体。抽滤，所得粗产品用无水乙醇重结晶，或利用硅胶柱层析(乙酸乙酯/石油醚＝4:1)，得红色粉末即为3-(1,5-二苯基-4,5-二氢-1h-吡唑-3-基)-7-羟基-2h-色烯-2-酮。产率32％。

实施例2：hcp1与grp94直接相互作用

通过biacoret200进行表面等离子体共振分析检测hcp1与全长grp94蛋白的结合情况。将全长的grp94蛋白通过氨基偶联的方法固定到cm5芯片表面。分别使用2.74μm,1.83μm,1.22μm,0.81μm和0.54μm的hcp1进行注射。hcp1的进样时间为120s,流速10ul/min，解离时间600s。进样缓冲液为pbs(10mm磷酸盐,137mmnacl,2.68mmkcl,0.1％二甲基亚砜[v/v],ph8.0)，温度25℃。每次进样后使用10mmnaoh进行芯片再生。结合响应值为ru值，数据处理扣除空白对照，使用biacoret200评估软件以1:1结合模拟分析。

结果表明：通过biacoret200所得的响应值和hcp1成浓度对应关系，hcp1和grp94相互作用的平衡解离常数为1.683μm，说明hcp1可以直接结合到grp94上(见图1)。

实施例3：hcp1与grp94共定位

将a549细胞接种于直径3.5cm的玻璃培养皿中，37℃，co2孵箱内培养24h之后，加入hcp1(10μm)处理3h，去除培养液，0.1mpbs缓冲液洗2次，加入1640原液，置于激光共聚焦显微镜下不同波长激发光(405nm，488nm，546nm，633nm和647nm)拍照。

将a549细胞接种于直径3.5cm的玻璃皿底培养皿中，37℃，co2孵箱内培养24h之后，加入hcp1(10μm)处理3h，去除培养液，0.1mpbs洗两遍，4％多聚甲醛固定细胞15min。弃4％多聚甲醛，0.1mpbs缓冲液洗3次，每次5min；弃0.1mpbs缓冲液，加入正常血清封闭液，室温封闭20min；弃封闭液，加入grp94一抗(用pbs做阴性对照)，一抗稀释比为1：100，湿盒中4℃过夜(18h以上)；弃一抗，用0.1mpbs缓冲液洗3次，每次5min；弃0.1mpbs缓冲液，加入相应alexafluor647荧光二抗，37℃反应60min；弃二抗，用0.1mpbs缓冲液洗3次，每次5min；用激光扫描共聚焦显微镜观察、分析结果。

结果表明：(1)在405nm，488nm和546nm的激发波长下hcp1在细胞内发射荧光。633nm和647nm波长激发时hcp1不发荧光。hcp1分布于a549细胞的胞质中，在细胞核内没有分布。(2)hcp1和grp94在细胞内共定位。说明hcp1特异性的靶向grp94(见图2)。

实施例4：hcp1抑制grp94的功能

将a549细胞接种于直径3.5cm的玻璃皿底培养皿中，37℃，co2孵箱内培养24h之后，转染grp94sirna或分别加入hcp1(10μm)或auy922(50nm)处理24h。去除培养液，0.1mpbs洗两遍，100％冰甲醇-20℃固定细胞10min，去除hcp1荧光。弃甲醇，0.1mpbs缓冲液洗3次，每次5min；弃0.1mpbs缓冲液，加入正常血清封闭液，室温封闭20min；弃封闭液，加入一抗(用pbs做阴性对照)，一抗稀释比为1：100，湿盒中4℃过夜(18h以上)；弃一抗，用0.1mpbs缓冲液洗3次，每次5min；加入另一种一抗(用pbs做阴性对照)，一抗稀释比为1：100，湿盒中4℃过夜(18h以上)；弃一抗，用0.1mpbs缓冲液洗3次，每次5min；弃0.1mpbs缓冲液，加入两种相应荧光二抗，37℃反应60min；弃二抗，用0.1mpbs缓冲液洗3次，每次5min；用激光扫描共聚焦显微镜观察、分析结果。

将a549细胞接种于直径6cm的培养皿中，37℃，co2孵箱内培养24h之后，转染grp94sirna24h之后，裂解细胞，收集细胞裂解液，4℃12000g离心15min，取上清，westernblot检测grp94的干扰效率。

将a549细胞接种于直径6cm的培养皿中，37℃，co2孵箱内培养24h之后，加入不同浓度的hcp1(1μm，5μm和10μm)处理细胞24h之后，裂解细胞，收集细胞裂解液，4℃12000g离心15min，取上清，westernblot检测hsp70的蛋白水平。

结果表明：(1)hcp1处理和grp94sirna可以降低tlr9和溶酶体的共定位。说明hcp1可以抑制tlr9由内质网到溶酶体的转运。(2)hcp1处理并不引起细胞内hsp70蛋白水平的变化。说明hcp1抑制grp94的生物学功能，同时并不影响胞质中hsp90的功能。这为hcp1作为grp94的抑制剂提供了很好的理论基础(见图3)。