一种制备特异性的丙酰甲基化赖氨酸泛抗体方法与流程
本领域涉及抗原设计、抗原制备以及利用抗原产生抗体的领域，具体而言，本发明涉及人工合成的一种新型的修饰性单甲基化赖氨酸以及修饰性单甲基化赖氨酸衍生化多肽，以及利用用该修饰性单甲基化赖氨酸，以及修饰性单甲基化赖氨酸衍生化多肽作为抗原产生一种全新的抗体，该抗体可用于识别与富集赖氨酸单甲基化多肽发生体外衍生化后的修饰性多肽，本发明还涉及所述抗体的制备方法。
背景技术：
蛋白或多肽的修饰是生物体内自然存在的一种现象，主要是构成多肽或蛋白的氨基酸的残基被一些基团修饰，然后调控生物体内一系列生命活动。通常修饰可以是甲基化、乙酰化、磷酸化修饰等。作为重要的赖氨酸甲基化修饰，修饰的类型分为单甲基化，二甲基化或三甲基化修饰(chengx,zhangx.mutatres(2007)).。如何有效的检测体内是否存在甲基化修饰，特别是单甲基化修饰，可以为有效检测一些重要的疾病提供一种新的方法。因为，一些自然发生的甲基化修饰，例如单甲基化修饰异常，会导致一些严重疾病的产生，例如癌症等。(yutakakondo等人,molcellbiol.23(1):206–215(2003),berdascom等人,procnatlacadsci,106:21830-21835(2009))。
赖氨酸甲基化修饰是蛋白质修饰的一种常见方式。通常情况下，蛋白质修饰的检测需要有特异性识别该修饰的抗体，如蛋白质赖氨酸乙酰化修饰可由赖氨酸乙酰化泛抗体识别(kouzarides,t.cell,128,693–705(2007),berger,s.l.nature,447,407–412(2007)。赖氨酸甲基化修饰按甲基基团在赖氨酸上的结合形式包括单甲基化、二甲基化与三甲基化三种形式。相应地，高灵敏度、高特异性赖氨酸单甲基化、二甲基化与三甲基化抗体的开发是检测蛋白质赖氨酸甲基化修饰的前提。(barski,a.等人,cell129,823–837(2007).rea,s.等人,nature406,593–599(2000))。目前，虽然已有成功开发的赖氨酸二甲基化与三甲基化抗体用于赖氨酸二甲基化或三甲基化修饰的检测，然而并没有成功开发的赖氨酸单甲基化修饰的抗体用于赖氨酸单甲基化修饰的检测(ziqianliang等人,proteomescience,第6卷，(1)6:2(2008))。由于赖氨酸单甲基化修饰的基团很小，仅有15da的分子量，极难产生高的免疫反应，此外单甲基基团的有机属性(organic)进一步削弱赖氨酸残基的免疫原性。这些内在的属性导致直接以赖氨酸单甲基化基团作为免疫原或赖氨酸单甲基化修饰多肽作为免疫原的抗体开发存在巨大的困难。
因此，有必要开发一种全新的抗体用于检测赖氨酸单甲基化修饰。
技术实现要素：
本发明涉及人工合成的修饰性单甲基化赖氨酸，以及修饰性单甲基化赖氨酸衍生化多肽，利用修饰性单甲基化赖氨酸，以及修饰性单甲基化赖氨酸衍生化多肽作为抗原产生的抗体可用于识别与富集赖氨酸单甲基化多肽发生体外衍生化后的修饰性多肽，从而起到检测赖氨酸单甲基化修饰多肽与修饰底物的作用。
一方面，本发明提供一种修饰性单甲基化赖氨酸，所述修饰性单甲基化赖氨酸具有如下结构式：
在一些优选的方式中，其中，r为修饰基团，1)r为
另一方面，本发明还提供一种修饰性单甲基化赖氨酸衍生化多肽。所述修饰性单甲基化赖氨酸衍生化多肽的序列为cxnggk*ggxn，其中x为19中常见氨基酸中除半胱氨酸之外的任意一氨基酸，n为1-20；其中，，k*的结构如下：
在一些优选的方式中，其中，r为修饰基团，1)r为
优先地，该多肽序列为cegrgdsgggk*ggsg，其中k*选自甲基丙酰化、甲基乙酰化或甲基丁酰化修饰性赖氨酸，在一些优选的实施例中，k*为甲基丙酰化赖氨酸。
又一方面，本发明提供一种抗原。抗原由上述修饰性单甲基化赖氨酸或者修饰性单甲基化赖氨酸衍生化多肽与含有活化基团的载体蛋白偶联而成，所述载体蛋白包括但不限于血蓝蛋白(klh)、牛血红蛋白、牛血清蛋白(bsa)或卵清蛋白(ova)等。
优先地，与载体蛋白活化基团偶联的修饰性单甲基化赖氨酸为丙酰化单甲基化赖氨酸。
优选的，与载体蛋白活化基团偶联的修饰性单甲基化赖氨酸衍生化多肽为单甲基丙酰化赖氨酸多肽，多肽的序列为cxnggk*ggxn，其中x为19中常见氨基酸中除半胱氨酸之外的任意一氨基酸，n为1-20，；k*为单甲基丙酰化赖氨酸。优先地，该多肽序列为cegrgdsgggk*ggsg，其中k*为甲基丙酰化赖氨酸。
又一方面，本发明提供一种抗体。该抗体由上述的抗原免疫动物制备而成。与载体蛋白活化基团偶联的修饰性单甲基化赖氨酸为抗原免疫兔子可制备多克隆抗体，优先地，载体蛋白活化基团与单甲基丙酰化赖氨酸为抗原免疫兔子制备获得多克隆抗体。与载体蛋白活化基团偶联的修饰性单甲基化赖氨酸衍生化多肽为抗原免疫小鼠可制备单克隆抗体。与载体蛋白活化基团偶联的多肽的序列为cxnggk*ggxn，其中x为19中常见氨基酸中除半胱氨酸之外的任意一氨基酸，n为1-20，为氨基酸残基的数目；k*为单甲基丙酰化赖氨酸。优先地，载体蛋白活化基团偶联的多肽序列为cegrgdsgggk*ggsg，其中k*为甲基丙酰化赖氨酸。
由本发明提供的抗体能够特异结合一种多肽，该多肽包括一个或一个以上修饰性单甲基赖氨酸，其结构如下：
在一些优选的方式中，其中，r为修饰基团，1)r为
除了免疫动物获得具备上述特性的抗体外，根据抗体开发的原理，该抗体还可以通过修饰性单甲基赖氨酸或修饰性单甲基化赖氨酸衍生化多肽从噬菌体展示库、酵母展示库、细菌展示库以及核糖体展示库中筛选制备而成。优先地，修饰性单甲基赖氨酸为单甲基丙酰化赖氨酸，修饰性单甲基化赖氨酸衍生化多肽序列为cxnggk*ggxn，其中x为19中常见氨基酸中除半胱氨酸之外的任意一氨基酸，n为1-20，为氨基酸残基的数目；k*为单甲基丙酰化赖氨酸。优先地，该多肽序列为cegrgdsgggk*ggsg，其中k*为甲基丙酰化赖氨酸。
本发明的有益效果
本发明提供一种人工合成的修饰性单甲基化赖氨酸及修饰性单甲基化赖氨酸衍生化多肽，利用该修饰性单甲基化赖氨酸及修饰性单甲基化赖氨酸衍生化多肽作为抗原，经过免疫动物可制备一种特异性抗体，的抗体可用于识别与富集赖氨酸单甲基化多肽发生体外衍生化后的修饰性多肽，从而起到检测赖氨酸单甲基化修饰多肽与修饰底物的作用。
细胞杂交株保藏说明
保藏中心名称：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的，保藏号为cgmccno.9109的pmt-001细胞株，分类名：鼠源杂交瘤细胞，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。
附图说明
图1所示为斑点印迹实验检测赖氨酸单基丙酰化兔源多克隆抗体特异性。每一斑点印迹所对应的上样量为20纳克。1：赖氨酸甲基丙酰化多肽库；2：赖氨酸甲基丙酰化gg多肽；3：甲基丙酰化赖氨酸小分子化合物；4：klh偶联的甲基丙酰化赖氨酸小分子化合物；5：赖氨酸丙酰化多肽库；6：赖氨酸丙酰化gg多肽；7：赖氨酸甲基乙酰化多肽库；8：赖氨酸甲基乙酰化gg多肽；9：赖氨酸甲基丁酰化多肽库；10：赖氨酸甲基丁酰化gg多肽；11：未修饰的赖氨酸多肽库；12：未修饰的赖氨酸gg多肽；13：klh。
图2所示为斑点印迹实验检测赖氨酸甲基丙酰化兔源多克隆抗体特异性。每一斑点印迹所对应的上样量如图左标记所示。1：赖氨酸甲基丙酰化多肽库；2：赖氨酸丙酰化多肽库；3：赖氨酸丁酰化多肽库；4：赖氨酸单甲基化多肽库；5：赖氨酸二甲基化多肽库；6：赖氨酸三甲基化多肽库。
图3所示为竞争elisa实验检测赖氨酸甲基丙酰化兔源多克隆抗体特异性。实验中所用多肽序列见表1及表2。
图4所示为斑点印迹实验检测赖氨酸单基丙酰化鼠源单克隆抗体特异性。每一斑点印迹所对应的上样量为20纳克。1：赖氨酸甲基丙酰化多肽库；2：甲基丙酰化赖氨酸小分子化合物；3：赖氨酸甲基丙酰化gg多肽；4：klh偶联的甲基丙酰化赖氨酸小分子化合物；5：赖氨酸丙酰化多肽库；6：赖氨酸丙酰化gg多肽；7：赖氨酸甲基乙酰化多肽库；8：赖氨酸甲基乙酰化gg多肽；9：赖氨酸甲基丁酰化多肽库；10：赖氨酸甲基丁酰化gg多肽；11：未修饰的赖氨酸多肽库；12：未修饰的赖氨酸gg多肽；13：klh。实验中所用多肽序列见表3及表4。
图5所示为斑点印迹实验检测赖氨酸单基丙酰化鼠源单克隆抗体特异性。。每一斑点印迹所对应的上样量如图左标记所示。1：赖氨酸甲基丙酰化多肽库；2：赖氨酸丙酰化多肽库；3：赖氨酸丁酰化多肽库；4：赖氨酸单甲基化多肽库；5：赖氨酸二甲基化多肽库；6：赖氨酸三甲基化多肽库；实验中所用多肽序列见表1及表2。
图6所示为竞争elisa实验检测赖氨酸单基丙酰化鼠源单克隆抗体特异性特异性。实验中所用多肽序列见表1及表2。
详细说明
定义
除非另外定义，在此使用的所有技术和科学术语与本发明所属技术领域的一般技术人员所使用的术语具有相同的含义。
赖氨酸的修饰和抗原的设计
在一些优选的实施方式中，在赖氨酸单甲基化修饰的基础上，可以进一步对单甲基化赖氨酸进行乙酰基、丙酰基或丁酰基的修饰，然后用经过双重修饰的小分子化合物或多肽抗原来免疫动物可以获得特异识别赖氨酸单甲基乙酰化(kme-ac)、单甲基丙酰化(kme-prop)或单甲基丁酰基化(kme-buty)的抗体。
通常，在对从生物体提取的蛋白样品进行胰酶裂解后，可对酶解多肽进行体外衍生化反应，如丙酰化反应。如某条多肽中存在赖氨酸单甲基化修饰，则体外衍生化后将生成赖氨酸单甲基化丙酰化多肽。然后再将经过衍生化反应的赖氨酸单甲基化丙酰化多肽和上述开发的抗体孵育，根据抗原-抗体特异性亲和结合的特性，赖氨酸单甲基丙酰化抗体将会特异性识别并富集赖氨酸单甲基化丙酰化多肽。经过酸洗脱将与抗体结合的赖氨酸单甲基化丙酰化多肽洗脱，通过后继的质谱分析可知道赖氨酸单甲基丙酰化修饰的多肽序列与修饰位点信息，而这些信息实际上对应的是赖氨酸单甲基化修饰的多肽序列与修饰位点，最后通过进一步的蛋白质数据搜索可以获得赖氨酸单甲基化修饰的蛋白底物信息。
在氨基酸上进行基团修饰是本领域一般技术人员所知晓的技术，这种修饰可以从已经发现的修饰的自然生物体上进行分离和纯化，也可以人工进行体外修饰获得最终的经过修饰的氨基酸。赖氨酸根据其属性，在体内很容易发生多种修饰，如乙酰化赖氨酸、甲基化赖氨酸等。在体外，在优化的反应体系和反应条件下，也可以合成特定的赖氨酸修饰形式，如单甲基乙酰化赖氨酸、单甲基丙酰化赖氨酸与单甲基丁酰化赖氨酸。这种人工合成的修饰性赖氨酸小分子，一方面可以作为小分子抗原与必要的载体蛋白偶联免疫动物产生抗血清，经过必要的抗体纯化工艺，可产生特异性识别该修饰赖氨酸的抗体。另一方面，以合成的修饰性赖氨酸作为基本原料(rawmaterial)，进一步人工合成多肽抗原。该多肽抗原与必要的载体蛋白偶联免疫动物后产生抗血清，经过必要的抗体纯化工艺，可产生特异性识别该修饰赖氨酸的抗体。
人工合成的含有修饰赖氨酸多肽抗原的长度可以是修饰性赖氨酸两侧各30个氨基酸残基以内。优选的序列长度为cxnggk*ggxn，其中x为19种常见氨基酸中除半胱氨酸之外的任意氨基酸，n为1-20，；k*为修饰性赖氨酸，优选k*选自甲基丙酰化、甲基乙酰化或甲基丁酰化修饰性赖氨酸。在一些优选的实施方式中，k*为甲基丙酰化赖氨酸。在一些优选的实施方式中，被修饰的氨基酸可以处于多肽序列的中间位置，也可处于该多肽抗原偏氨基端(-nh2)或羧基端(-cooh)的位置。优选地，多肽抗原序列为cegrgdsgggk*ggsg。
抗原多肽的合成
修饰性赖氨酸多肽的合成为现有公知的技术。可以采用溶液法合成本发明的多肽，也可以采用常用的固相合成法合成本发明的多肽。多肽的化学合成技术无论是液相法还是固相法都已成熟。在一些优选的实施方式中，合成多肽的技术为固相合成法。1978年，changmeienlofer和atherton等人采用carpino报道的fmoc(9-芴甲氧羰基)作为α氨基保护基，fmoc基对酸很稳定，但能用哌啶-ch2cl2或哌啶-dmf脱去。近年来，fmoc合成法得到了广泛的应用。在另一些优选的方式中，采用fmoc合成法合成本发明的肽链序列(fmoc固相多肽合成-一种实用方法(fmocsolidphasepeptidesynthesis)–apracticalapproach.牛津大学出版社,2000)。
采用fmoc合成法合成本发明的肽链序列基本方法是：首先将一个用fmoc基团对α-氨基进行保护的氨基酸通过一个支臂连结到一个不溶性载体上，随后将α-氨基脱保护，用溶液洗涤氨基酸―支臂―树脂。将第二个预先活化的α-氨基保护的氨基酸通过耦联反应连接上去。此外，也可以用α-n端及侧链保护的肽片断代替单个的氨基酸进行耦联反应，缩合反应完成后，用溶液洗涤，重复进行脱保护、偶联，直到得到目的肽。最后将肽―支臂―树脂裂解。这种延长肽链的固相合成法既可采用间断的方法，也可使用连续流动的方法。
抗体以及抗体的产生
这里的抗体是指通过利用本发明的修饰性赖氨酸小分子或修饰性赖氨酸多肽作为抗原免疫动物获得抗体。
在一些优选的实施方式中，在碳化二亚胺，如1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(edc)存在的条件下，修饰性赖氨酸小分子的羧基端(-cooh)能与n-羟基琥珀酰亚胺磺酸(sulfo-nhs)反应，形成半稳定的sulfo-nhs酯，接着与载体蛋白的氨基端(-nh2)偶联(taros,j.v.,等人,analbiochem，156:220-2(1986))。本发明的小分子化合物单甲基丙酰化赖氨酸(lys(me-prop)-oh)，通过edc介导，可以与一些载体蛋白-nh2端偶联，形成活化全抗原来免疫动物。在多肽全抗原的准备过程中，载体蛋白上的氨基(-nh2)先与4-(n-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯钠盐(sulfo-smcc)反应，形成稳定的肽键，随后与抗原多肽末端的半胱氨酸反应，通过二硫键形成稳定的复合物，由此形成活化的全抗原来免疫动物。
在一些优选的实施方式中，本发明的修饰性赖氨酸小分子或抗原多肽通过与载体蛋白的偶联而活化，带有载体蛋白的修饰性赖氨酸小分子或多肽抗原具有更强的免疫活性，因为单独的修饰性赖氨酸小分子或多肽序列本身通常不具有免疫活性或免疫活性很低。偶联的载体蛋白可以是，但并不局限于血蓝蛋白(keyholelimpethemocyanin,klh)、牛血清蛋白(bovineserumalbumin,bsa)、卵清蛋白(ovalbumin,ova)、牛血红蛋白(bovinegammaglobulin,bgg)、牛甲状腺蛋白(bovinethyroglobulin,btg)、抹香鲸肌球素(spermwhalemyoglobin,swm)、破伤风类毒素(tetanustoxoid,tt)、甲基化的牛血清蛋白(methylatedbovineserumalbumin,mbsa)、人免疫球蛋白igg或iga(humanimmunoglobulinsigg,iga)或者其他现有技术的免疫原蛋白等等。
用以上偶联有活性基团的修饰性赖氨酸小分子或多肽可以来免疫动物，例如鼠，兔，或其他哺乳动物来生产多克隆抗体，也可以用杂交瘤细胞来产生单克隆抗体，这些方法是本领域现有公知的技术，在此不再赘述，可以参见一些教科书或免疫手册来获得本发明的抗体或抗体片段(制备和使用抗体-实用手册(makingandusingantibodies-apracticalhandbook).crcpress,2007)。当然，抗体也可以经过自然产生，也可以是经过人工合成的抗体或抗体片段。这些抗体可以特异识别包括经过修饰的赖氨酸残基，而与其周边序列无关。在一些优选的实施方式中，本发明的抗体可以特异识别某一含有单甲基丙酰化修饰的赖氨酸多肽，而不能识别那些含有其他赖氨酸修饰形式的多肽。所谓“特异性”是指该抗体仅能识别或结合某一特定类型的抗原，而不识别或结合其他类型的抗原。在本发明中，所制备的抗体只是识别单甲基丙酰化修饰的赖氨酸的肽链序列，而不能识别其它类型赖氨酸修饰的多肽序列，如包括但不局限于赖氨酸二甲基化，三甲基化，乙酰化、丙酰化、丁酰化修饰，或其他氨基酸残基的修饰形式，如酪氨酸磷酸化等。
作为结合或识别赖氨酸甲基丙酰化修饰的抗体可以是本发明的抗体。抗体可以是免疫球蛋白分子或部分抗原特定位点的免疫球蛋白分子，例如那些具有抗原结合位点的分子能够特异(被免疫)结合被分析物质，被分析物质的拟态物质或配体。抗体也包括人工合成的杂交抗体或者经过修饰过的抗体或抗体分子片段，包括，但不局限于，抗体片段和fv片段。具有结合抗原功能的抗体上具有自然发生的抗体上的一些片段。一个结合片段或抗体片段包括，但不局限于，(i)fab片段，它包括vl,vh,cl和ch1区域；(ii)fd片段，它包括vh和ch1区域(iii)fv片段，它包括抗体的一个单链上的vl和vh区域；(iv)dab区域(wardetal.,nature341:544-546(1989)，它包括vh区域；(v)一个独立的决定簇(cdr)；(vi)一个f(ab')2片段，一个二价片段包括两个通过二硫化物在铰链区连接的fab片段。另外，虽然这fv片段上的两个区域是不同的基因编码所决定，人工合成的连接试剂可以让他们形成单一的蛋白链(已知的单一fv(scfv)链)(bird等人,science242:423-426(1988)；和huston等人,pnas85:5879-5883(1988))。蛋白片段包括那些可以交联结合他们的目标抗原的片段，例如二价片段，如f(ab')2片段。可选的，那些不能自我交联结合目标抗原的蛋白片段也可与第二抗体一起结合目标抗原。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。。
本发明实施例中使用的试剂如下列表：
表1
本发明实施例中各种溶液配方如下：
表2
实施例1多克隆抗体的制备
1、单甲基丙酰化赖氨酸小分子的合成(lys(me-prop)-oh)的合成即在赖氨酸ε-残基上连接甲基丙酰基基团，nhfmoc为保护基团)。
合成路线：
1)将14g(0.029mol)2-1(n'-叔丁氧羰基-n-芴甲氧羰基-n'-甲基-l-赖氨酸,c27h34n2o6)用二氯甲烷(dcm)溶解，常温下持续通入新制hcl气体1.5小时后，在hcl强酸下常温继续反应5小时，薄层色谱tlc确认反应结束；50℃，0.03mpa条件下旋干后，得14.7g粘稠固体，然后进行硅胶柱层析(洗脱剂比例：dcm-dcm：meoh＝50:1—dcm:meoh＝20:1)得到10.8g(0.0283mol)2-2(n-芴甲氧羰基-n'-甲基-l-赖氨酸,c22h26n2o4)。
2)10.8g2-2加入30ml丙酮溶解，再加入1.1mnahco3水溶液70ml后室温搅拌2小时(充分搅拌，除去原料中结合的hcl)，冰水浴下缓慢加入溶有3.93g(0.03mol)丙酸酐的丙酮溶液50ml，反应1小时；反应结束后2n盐酸调ph至3.0左右，加入dcm100ml萃取两次，取有机相50℃，0.03mpa旋转蒸发得12.4g粘稠固体，进行硅胶柱层析(洗脱剂比例：dcm-dcm：meoh＝50:1—dcm:meoh＝30:1)得到10g(0.0228mol)2-3(n'-丙酰-n-芴甲氧羰基-n'-甲基-l-赖氨酸,c25h30n2o5)。
3)10g2-3加入70mln,n-二甲基甲酰胺(dmf)和45ml四氢呋喃(thf)溶解后加入6ml(0.061mol)哌啶，常温搅拌过夜，tlc确认反应结束；油泵减压蒸馏蒸干(0.88kpa)溶剂后得8g混合产物，进行硅胶柱层析(洗脱剂比例：dcm-dcm：meoh＝50:1—dcm:meoh＝30:1)，得到3.4g(0.0147mol)纯的酯化产物；加0.585g氢氧化钠、35ml水，35ml甲醇进行水解，冰水浴下反应2小时，酯化产物完全水解后用2nhcl调ph至3.0。50℃，0.03mpa旋干溶剂，再加入20ml乙醇溶解产物，过滤后滤液旋干，得最终产物2-4(lys(me-prop)-oh,n'-丙酰-n'-甲基-l-赖氨酸c10h20n2o3)2.6g。
2、单甲基丙酰化赖氨酸化合物与载体蛋白klh偶联制备免疫原
(1)10mgklh溶于1mlmes缓冲液中；
(2)分别加入0.4mg的edc与1.1mgsulfo-nhs；充分混匀，室温反应15分钟；
(3)随后加入1.4μlβ-巯基乙醇，反应10min后用pbs将ph调至7.4；
(4)2mglys(me-prop)化合物溶于pbs后，加至步骤(3)中活化后的klh溶液中，充分混匀，室温反应2小时；
(5)随后加入50mmtris反应15min，pbs溶液中4℃透析过夜。
3、动物免疫程序
1)8周龄新西兰大白兔，皮下多点注射；
2)第一次免疫：取500μl浓度为0.8mg/ml的klh偶联的小分子免疫原与同体积完全福氏佐剂混合乳化，背部皮下多点免疫；
3)3周后，取500μl浓度为0.4mg/ml的免klh偶联的小分子疫原与同体积不完全福氏佐剂混合乳化后，背部皮下多点注射；
4)每隔2周，按步骤3的剂量与方法加强免疫一次；
5)第4次免疫后10天取1ml血清，用elisa方法检测血清滴度。若血清滴度大于3万，即通过心脏采血。若血清滴度不合格，则继续重复步骤4，直至血清滴度大于3万。
4、多克隆抗体纯化
proteina预纯化：
1)滴度大于3万的血清10ml10000r/min离心10分钟，吸取上清用0.45μm微孔滤膜过滤；
2)3mlproteina树脂室温平衡1小时，4倍柱体积的磷酸盐缓冲液(pbs，ph7.2)清洗树脂；
3)过滤后的血清20ml上样到含有proteina树脂的柱子中，并与proteina柱子室温孵育90min后，静置15min；
4)分别用10倍柱体积的清洗缓冲液a洗1次，15倍柱体积pbs洗柱子1次；
5)5倍柱体积的洗脱buffer洗脱，随后加入中和缓冲液，4℃pbs透析过夜；
6)超滤igg至浓度为5-10mg/ml。
抗原多肽偶联柱子制备
1)室温平衡sulfolinkcouplingresin1小时，混匀后吸取5ml于层析空柱中，4倍柱体积的偶联缓冲液清洗两次；
2)称取5mg抗原多肽，分别溶于偶联缓冲液中，加入sulfolinkcouplingresin层析柱柱中混匀，室温孵育15分钟；
3)静置30分钟，15倍柱体积的偶联缓冲液洗柱子；
4)加入1倍柱体积封闭缓冲液，室温孵育15分钟后，6倍柱体积清洗缓冲液b清洗柱子；5)分别获得含有多肽1偶联柱子和多肽2偶联柱子。
抗原多肽亲和纯化
将5mgproteina预纯化超滤后得到的igg加入至抗原多肽偶联柱子中，室温孵育2小时；舍弃流出液后，分别用5倍柱体积的清洗缓冲液和10倍柱体积的pbs清洗柱子，然后按以下步骤活动纯化抗体：
1)4倍柱体积洗脱缓冲液洗脱；
2)洗脱液中加入中和缓冲液，透析袋中于4℃pbs透析过夜；
3)超滤igg至浓度为5-10mg/ml；
4)将上述超滤后的igg加入至多肽2偶联柱子中，室温孵育30分钟，收集流出液，即为纯化好的抗体。
5、斑点印迹(dotblot)检测：
1)将表3与表4中所列的多肽溶于水中，配置成初始浓度为100ng/μl的多肽溶液；
2)裁剪合适大小的pvdf膜，无水甲醇处理大约40秒，去离子水中漂洗3次，自然干燥2分钟；
3)将初始浓度为100ng/μl的多肽溶液进一步分别稀释为20ng/μl与4ng/μl。然后依次点样，1μl/点，干燥10分钟后放入六孔板中；
4)5％脱脂奶粉室温封闭60分钟，tbst洗液漂洗两次，5分钟/次；
5)用5％脱脂奶粉稀释抗体，室温孵育1小时，用tbst洗液漂洗三次，10分钟/次；
6)用5％脱脂奶粉稀释羊抗兔hrp标记抗体，室温45分钟，tbst洗液漂洗三次，10分钟/次；
7)将化学发光显色液均匀铺于膜上，孵育5分钟后曝光，结果见图1与图2。
表3：图1和图4斑点印迹实验中所用多肽的序列(k*表示经过修饰的赖氨酸，其中x为19中常见氨基酸中除半胱氨酸之外的任意一氨基酸)
表4：图2和图5斑点印迹实验中所用多肽的序列(k*表示经过修饰的赖氨酸，其中x为19中常见氨基酸中除半胱氨酸之外的任意一氨基酸)
斑点印迹检测表明，通过本发明设计的单甲基化丙酰化赖氨酸小分子作为抗原获得的多克隆抗体可以特异性识别赖氨酸甲基丙酰化多肽库、赖氨酸甲基丙酰化gg多肽、单甲基化丙酰化赖氨酸小分子及klh偶联的单甲基化丙酰化赖氨酸小分子，但并不识别其他类型赖氨酸修饰的多肽(图1)，由此说明了抗体良好的特异性。图2的结果表明，所开发的单甲基化丙酰化赖氨酸多克隆抗体能够识别4纳克的赖氨酸甲基丙酰化多肽库，但不识别结构类似的直至100纳克其他修饰性赖氨酸多肽库，这既表明所开发抗体的灵敏度，也进一步表明了该多克隆抗体的特异性。
6、elisa检测：
1)包被：用去离子水稀释赖氨酸甲基丙酰化多肽至1x10-3mg/ml，50μl/孔，4℃包被酶标板过夜；
2)封闭：第二天用tbst洗1次，5分钟/次，200μl/孔，拍干，1％bsa/tbs70μl封闭45分钟；
3)竞争：纯化的赖氨酸单甲基化丙酰化多克隆抗体用pbs1:200稀释，随后分别加入0纳克，10纳克,50纳克和100纳克表1及表2中所列举多肽，4℃反应过夜；
4)加入纯化的赖氨酸单甲基化丙酰化多克隆抗体：第二日，3000g离心取上清，稀释10倍，加入到酶标板中，50μl/孔。26℃孵育2小时。
5)加hrp标记的羊抗兔igg二抗：tbst洗3次，5分钟/次，200μl/孔，拍干，加入二抗，1:10000稀释(1％bsa/tbs)，50μl/孔，26℃孵育45分钟。
6)加底物：按步骤5的方法，tbst洗3次，拍干。50μl/孔加入tmb显色底物，26℃反应30分钟；
7)终止：加入2m硫酸，50μl/孔。
8)显色：酶标仪od450测定吸光度。
从图3的结果可以看出，逐渐提高与纯化抗体相竞争的赖氨酸甲基丙酰化多肽库、赖氨酸甲基丙酰化gg多肽的量，抗体与预包被的赖氨酸甲基丙酰化多肽反应的elisa信号也随之逐渐降低，而与其他修饰性赖氨酸多肽竞争后抗体则与预包被的赖氨酸甲基丙酰化多肽反应的elisa信号基本保持不变，由此进一步说明所开发的赖氨酸单甲基化丙酰化多克隆抗体的特异性。
实施例2单克隆抗体的制备
1、抗原多肽序列的确定及以合成
用于免疫的多肽序列：cegrgdsgggk*ggsg，其中，第十一位赖氨酸(k)残基上联接单甲基基团(me)和丙酰化(prop)基团。
对照多肽序列(对照序列，不用于免疫)：cegrgdsgggkggsg，第十一位赖氨酸(k)残基无任何基团修饰。
抗原多肽合成步骤如下：
a.丙酰化单甲基赖氨酸原料(fmoc-lys(me-prop)-oh)的合成(即在赖氨酸ε-残基上连接单甲基丙酰基基团))
1)氯甲酸苄基-赖氨酸(三氟乙酸,甲基)-甲酯(z-lys(tfa,me)-ome)的制备：氯甲酸苄基-赖氨酸(三氟乙酸)-oh(z-lys(tfa)-oh)、碘甲烷(me2i)、k2co3与dmf一起反应回流，取反应液送质谱检测确定合成成功；
2)氯甲酸苄基-赖氨酸(甲基)-oh(z-lys(me)-oh)的生成：步骤1生成的z-lys(tfa,me)-ome与lioh饱和溶液在ph大于12.0下反应，取反应液送质谱检测确定合成成功；
3)氯甲酸苄基-赖氨酸(甲基-丙酰基)-oh(z-lys(me-prop)-oh)的生成：z-lys(me)-oh、丙酸酐与三乙胺在ph为9.0的条件下反应，取反应液送质谱检测。反应完全，酸化，醋酸乙酯萃取。浓缩成油状物。
4)h-lys(me-prop)-oh的生成：步骤3获得的z-lys(me,prop)-oh在甲醇中溶解，加入钯碳pd/c,通氢气，tlc跟踪反应。反应完后，过滤，滤液浓缩得固体，随后用乙醚洗4次，烘干。
5)fmoc-lys(me-prop)-oh的生成：h-lys(me-prop)-oh、芴甲氧羰酰琥珀酰亚胺(fmoc-osu)饱和nahco3溶液与丙酮在ph为9.0反应，tlc跟踪反应。反应完全后，常规处理，酸化，产品用醋酸乙酯萃取，干燥浓缩至油状物。
b.抗原多肽的合成
多肽合成在abi433多肽合成仪上进行。
1)树脂溶胀：n-芴甲氧羰基-甘氨酸王树脂(fmoc-gly-wangresin)用二氯甲烷浸泡15分钟，待树脂膨胀，抽去二氯甲烷；
2)脱除氨基保护：加入体积比为1:4的六氢吡啶/dmf溶液，使用氮气鼓动，反应2次，时间为5分钟和15分钟，反应结束后用dmf洗涤树脂9次。取少量树脂加入验色剂abc各2-3滴(a液：茚三酮/无水乙醇溶液；b液：吡啶；c液：苯酚/无水乙醇溶液)在100℃下共热3分钟，溶液及树脂颜色为蓝色(有的氨基酸为紫红色)，即可判断氨基保护已经脱除
3)缩合反应：加入fmoc-gly-oh和1-羟基苯并三唑(hobt)，用适量dmf溶解，加入diea，氮气鼓动，反应1小时，反应结束后用dmf洗涤树脂6次。取少量树脂验色，方法同步骤2，溶液及树脂颜色应为无色，即可认定反应完成。
4)重复步骤2-3，依次连接预先按等摩尔比例混合的多肽序列中的氨基酸，直至序列的完成，将树脂用二氯甲烷和乙醚浸泡后抽干
5)将多肽从树脂上切掉：加入tfa，在恒温摇床中反应2小时，摇床转速110转/分钟，温度25度。
6)析出粗品：滤去树脂，向滤液中加入无水乙醚，用离心机离心后获得固体，加入无水乙醚洗涤，再离心，重复数次后烘干即可获得粗品多肽。
2、多肽全抗原制备
1)将20mgklh溶于2ml5mmedta/h2o中；
2)5mgsμlfo-smcc完全溶于40μldmso后，加入160μlpbs，混合均匀；
3)将sμlfo-smcc溶液逐滴加入klh溶液中，边加边搅拌。室温放置1小时，接着将上述活化的klh溶液在1l4℃预温的pbs中4℃透析1小时；换液后，4℃透析2小时，重复1次；称取5mg抗原多肽，溶于100μldmso中，再加入400μlpbs，混合均匀，随后加入500μl上述透析好的活化klh溶液，4℃冰箱过夜；
4)上述连接有klh的抗原多肽的交联复合物于4lpbs溶液中，4℃透析过夜；
5)第二日取出klh-抗原多肽，-20℃储存。
3、动物免疫程序
1)6-8周龄balb/c小鼠，皮下多点注射；
2)第一次免疫为100μl1mg/ml免疫原与同体积完全福氏佐剂混合乳化，背部皮下多点免疫；
3)3周后，0.5mg/ml免疫原100μl与同体积不完全福氏佐剂混合乳化后，背部皮下多点注射；
4)以后每隔2周，按步骤3的剂量与方法加强免疫；
5)第4次免疫10天后取20μl血清，用elisa方法检测血清滴度。若血清滴度不合格(血清滴度要大于3万)，则继续重复步骤4直至血清滴度大于3万。
4、细胞融合
1)小鼠拉颈处死后，取出脾脏，在铁丝网上磨碎，收集脾细胞，dmem培养基清洗两遍，计数；
2)将sp2/0骨髓瘤细胞收集到50ml离心管中，离心5分钟，计数；
3)脾细胞和sp2/0细胞按1:4比例混合吹匀后离心收集；
4)将培养基倒干净，敲打离心管底部，使细胞沉淀松散；
5)用巴斯德吸管沿离心管壁加入1ml聚乙二醇(peg)，搅拌60秒，随后加入30ml预热的培养液。盖好盖子，混匀，离心，倒净培养基；
6)加入新鲜hat培养基重悬细胞铺入96孔细胞培养板。
7)通过elisa筛选获得阳性细胞株，进行两次亚克隆，获得系列稳定的阳性细胞融合株，例如保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的，保藏号9109的pmt-001细胞株，该细胞株可以分泌单克隆抗体。
5、腹水生产
1)亚克隆稳定的细胞扩大培养(例如保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的，保藏号9109的pmt-001细胞株)；
2)8周龄以上的balb/c小鼠腹腔注射0.5ml不完全佐剂；10天后，待小鼠腹部稍稍隆起，，每只小鼠免疫1x106细胞；
3)7天后收集腹水，12000g离心，去掉脂肪，收集上清。
6、腹水纯化
1)15毫升腹水12000g离心10分钟，0.45μm滤膜过滤；
2)将5毫升的proteing装入层析空柱中，用4倍柱体积pbs清洗1次，室温平衡30分钟；
3)将步骤1中的腹水15毫升加入proteing柱子中，室温孵育2小时；
4)静置15分钟后，放出腹水，15倍柱体积的pbs洗涤柱子；
5)用6倍柱体积的甘氨酸洗脱液洗脱，收集并加入中和缓冲液，pbs中4℃透析过夜。
7、斑点印迹(dotblot)检测：
1)将表3与表4中所列的多肽溶于水中，配置成初始浓度为100ng/μl的多肽溶液；
2)裁剪合适大小的pvdf膜，无水甲醇处理大约40秒，去离子水中漂洗3次，自然干燥2分钟；
3)将初始浓度为100ng/μl的多肽溶液进一步分别稀释为20ng/μl与4ng/μl。然后依次点样，1μl/点，干燥10分钟后放入六孔板中；
4)5％脱脂奶粉室温封闭60分钟，tbst洗液漂洗两次，5分钟/次；
5)用5％脱脂奶粉稀释抗体，室温孵育1小时，用tbst洗液漂洗三次，10分钟/次；
6)用5％脱脂奶粉稀释羊抗兔hrp标记抗体，室温45分钟，tbst洗液漂洗三次，10分钟/次；
7)将化学发光显色液均匀铺于膜上，孵育5分钟后曝光，结果见图3与图4。
斑点印迹检测表明，通过本发明设计的cegrgdsgggk*ggsg多肽作为抗原获得的单克隆抗体可以特异性识别赖氨酸甲基丙酰化多肽库，甲基丙酰化赖氨酸小分子化合物，赖氨酸甲基丙酰化gg多肽与klh偶联的甲基丙酰化赖氨酸小分子化合物，但并不识别其他类型赖氨酸修饰的多肽(图4)，由此说明了抗体良好的特异性。图5的结果表明，所开发的单甲基化丙酰化赖氨酸单克隆抗体能够识别4纳克的赖氨酸甲基丙酰化多肽库，但不识别结构类似的直至100纳克的其他修饰性赖氨酸多肽库，这既表明所开发抗体的灵敏度，也进一步表明了该多克隆抗体的特异性。
8、elisa检测：
1)包被：用去离子水稀释cegrgdsgggk*ggsg抗原多肽至1x10-3mg/ml，50μl/孔，4℃包被酶标板过夜；
2)封闭：第二天用tbst洗1次，5分钟/次，200μl/孔，拍干，1％bsa/tbs70μl封闭45分钟；
3)竞争：纯化的赖氨酸单甲基化丙酰化单克隆抗体用pbs1:200稀释，随后分别加入0纳克，10纳克,50纳克和100纳克表1及表2中所列举多肽，4℃反应过夜；
4)加入纯化的赖氨酸单甲基化丙酰化单克隆抗体：第二日，3000g离心取上清，稀释10倍，加入到酶标板中，50μl/孔。26℃孵育2小时。
5)加hrp标记的羊抗兔igg二抗：tbst洗3次，5分钟/次，200μl/孔，拍干，加入二抗，1:10000稀释(1％bsa/tbs)，50μl/孔，26℃孵育45分钟。
6)加底物：按步骤5的方法，tbst洗3次，拍干。50μl/孔加入tmb显色底物，26℃反应30分钟；
7)终止：加入2m硫酸，50μl/孔。
8)显色：酶标仪od450测定吸光度。
从图6的结果可以看出，逐渐提高与纯化抗体相竞争的赖氨酸甲基丙酰化多肽库、赖氨酸甲基丙酰化抗原多肽的量，抗体与预包被的赖氨酸甲基丙酰化抗原多肽反应的elisa信号也随之逐渐降低，而与其他修饰性赖氨酸多肽竞争后抗体则与预包被的赖氨酸甲基丙酰化抗原多肽反应的elisa信号基本保持不变，由此进一步说明所开发的赖氨酸单甲基化丙酰化单克隆抗体的特异性。
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