本发明属于生物工程领域，更具体地，本发明涉及优化的杀念菌素生产方法及培养基。
背景技术：
杀念菌素(candicidin)是链霉菌fr-008或灰色链霉菌imru3570产生的一种七烯大环内酯类抗生素。研究表明，多烯大环内酯类抗生素是典型的抗真菌剂。
杀念菌素的抑菌机制主要是：通过多烯大环内酯的多烯结构一侧与真菌细胞膜上的甾醇分子发生疏水相互作用，相邻的大环内酯链上的带电基团间发生静电相互作用，使得真菌的细胞膜上形成离子通道，从而来介导真菌细胞内的k+和mg2+，使得泄露发生破坏胞内物质的正常生理浓度进而导致细胞死亡。
杀念菌素作为抗真菌剂对白色念珠菌作用较强，临床主要用于局部感染，适用于眼部、呼吸道、口腔、阴道、尿路等部位的真菌感染，如用于治疗由于白色念珠菌引起的阴道炎，皮炎以及呼吸道真菌感染。有报道表明杀念菌素对治疗前列腺肥大，缩小前列腺有一定的作用。除此之外，对于前列腺肥大引起的尿频、尿急、小便淋漓不尽及尿潴留、排尿困难等症状都有明显改善或较好的缓解作用。也有研究表明杀念珠菌素通过抑制胆酸和胆固醇的吸收从而对饲胆固醇的狗和鸡有降血浆胆固醇作用。
无论是在临床治疗局部的和全身性的真菌感染，还是在食品行业中作为防腐剂，杀念菌素这类抗生素都得到了广泛的应用，也受到人们越来越多的关注。
目前，本领域中已经采用生物工程发酵方法来生产杀念菌素。例如，由链霉菌(streptomycessp.)fr-008产生。该菌株经过发酵培养合成fr-008/candicidin(杀念菌素)，目前培养该菌株所用培养基是成分复杂的复合培养基，该培养基中含有酵母粉、蛋白胨以及麦芽提取物等众多富含c源n源以及b族维生素、核甘酸、多肽及微量元素等营养物质，但是由于成本高，产素水平低严重限制了杀念菌素的大规模工业化生产。
除此之外，以往对杀念菌素研究主要集中于菌种的改造，对于发酵下游研究较少，对于发酵研究必不可少的对胞内代谢物进行分析，而胞内代谢物分析的前提就是需要有一个有利于生长产素并且组分清晰易于分析的全合成培养基，才能够进行准确而迅速的分析胞内代谢活动。这样一来，寻求价格低廉又能够保证菌体正常生长和产素的培养基就显得尤为重要。目前，本领域针对链霉菌fr-008的合成培养基还不存在。
综上，目前本领域尚缺少高效生产杀念菌素的发酵技术，进一步地研究优化是必要的。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供优化的杀念菌素生产方法及培养基。
在本发明的第一方面，提供一种提高链霉菌的杀念菌素的产量的方法，所述方法包括：利用含有葡萄糖·h2o，kh2po4，cacl2，edtana2，znso4·7h2o，feso4·7h2o，mnso4·7h2o，nacl，cuso4·5h2o，mgso4·7h2o和组氨酸的培养基进行发酵培养，其中各组分浓度如下：
在一个优选例中，所述的提高链霉菌的杀念菌素的产量的方法中，培养基的各组分浓度如下：
在另一优选例中，所述的提高链霉菌的杀念菌素的产量的方法中，培养基的各组分浓度如下：
在另一优选例中，所述的提高链霉菌的杀念菌素的产量的方法中，发酵培养的温度是30±1℃。
在另一优选例中，所述的提高链霉菌的杀念菌素的产量的方法中，发酵培养的转速是220±20r/min。
在另一优选例中，所述的提高链霉菌的杀念菌素的产量的方法中，发酵培养的培养基的初始ph为7.8±0.2(较佳地为7.8±0.1)。
在另一优选例中，所述的提高链霉菌的杀念菌素的产量的方法中，所述的链霉菌是链霉菌fr-008。
在本发明的另一方面，提供一种用于发酵培养链霉菌、生产杀念菌素的培养基，所述培养基的各组分及浓度如下：
在一个优选例中，所述培养基中各组分浓度如下：
在另一优选例中，所述培养基中各组分浓度如下：
在本发明的另一方面，提供前面任一所述的培养基的用途，用于发酵培养链霉菌，提高链霉菌的杀念菌素的产量。
在本发明的另一方面，提供一种制备用于发酵培养链霉菌、生产杀念菌素的培养基，所述方法包括：将葡萄糖·h2o，kh2po4，cacl2，edtana2，znso4·7h2o，feso4·7h2o，mnso4·7h2o，nacl，cuso4·5h2o，mgso4·7h2o和组氨酸混合；其中各组分及浓度如下：
本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
附图说明
图1、应用本发明优化前的原始合成培养基以及优化合成培养基进行发酵生产杀念菌素，发酵过程随着发酵时间的变化，发酵液中的杀念菌素的产量曲线。
图2、应用本发明优化前的原始合成培养基以及优化合成培养基进行发酵生产杀念菌素，发酵过程随着发酵时间的变化，发酵液中的菌体的干重曲线。
具体实施方式
本发明人经过长期而深入的研究，开发了一种新的适合于培养链霉菌(更佳地是链霉菌fr-008)，使之高效生产杀念菌素的培养基配方。本发明的培养基，适合于链霉菌的生长，且可大大地提高杀念菌素的产量。
如本文所用，所述的“含有”，“具有”或“包括”包括了“包含”、“主要由……构成”、“基本上由……构成”、和“由……构成”；“主要由……构成”、“基本上由……构成”和“由……构成”属于“含有”、“具有”或“包括”的下位概念。
术语“链霉菌的培养基”指含有葡萄糖·h2o，kh2po4，cacl2，edtana2，znso4·7h2o，feso4·7h2o，mnso4·7h2o，nacl，cuso4·5h2o，mgso4·7h2o和组氨酸的组合物；或基本上由葡萄糖·h2o，kh2po4，cacl2，edtana2，znso4·7h2o，feso4·7h2o，mnso4·7h2o，nacl，cuso4·5h2o，mgso4·7h2o和组氨酸组成的组合物。在组合物中，所述的葡萄糖·h2o，kh2po4，cacl2，edtana2，znso4·7h2o，feso4·7h2o，mnso4·7h2o，nacl，cuso4·5h2o，mgso4·7h2o和组氨酸占培养基总重量的80-100％，较佳地占90-100％，更佳地占95-100％，如98％，99％。
本领域技术人员均了解，培养基包括复合培养基和合成培养基。复合培养基的优点是营养成分丰富，培养效果较好，但其缺点是成分复杂，来源受限，难以被应用于大规模商品化生产，这是一些必需采用复合培养基生产的产品的大规模生产的瓶颈。目前本领域中，杀念菌素的合成用的都是复合培养基，虽然产量基本符合要求，但是复合培养基成本高、成分复杂、来源受限的问题也大大阻碍了杀念菌素的工业生产；目前本领域中尚没有应用合成培养基生产杀念菌素的报道。
本发明人经过深入研究，揭示一种新的适合于培养链霉菌并使之高效生产杀念菌素的合成培养基。用于配制本发明的链霉菌培养基的各组分的用量如表1所示。
表1
在得知本发明的链霉菌(更佳地是链霉菌fr-008)培养基所用的组分及其配方以后，本领域技术人员可方便地进行配制。
本发明的培养基的应用的组分(原料)均为商业化的普通化学产品，价格比较低，制备也非常简单，与现有技术的培养基相比，本发明的新型培养基能显著促进链霉菌发酵生产杀念菌素，杀念菌素的产量得到显著提高，有利于大规模工业化生产。
本发明以灰色链霉菌次级代谢合成杀念菌素用到的合成培养基为基础进行优化。作为本发明的优选方式，在配制所述的链霉菌(更佳地是链霉菌fr-008)培养基时，先分别准确称取各组分，将它们混合于水中。所述的水较佳地为去离子水。更优选的，提供一种用于制备上述培养基的方法，包括步骤：将所述葡萄糖·h2o，kh2po4，cacl2，edtana2，znso4·7h2o，feso4·7h2o，mnso4·7h2o，nacl，cuso4·5h2o，mgso4·7h2o和组氨酸逐一溶解，混合均匀，获得所述的培养基。
本发明人意外地发现，以edtana2作为螯合剂，以合适的比例添加到培养基中，对于发酵的过程控制以及发酵结果具有积极的作用。
本发明人还确定了mgso4·7h2o、nacl、cuso4·5h2o是发酵过程中非常重要的影响因素
本发明还提供了使用所述培养基培养链霉菌(更佳地是链霉菌fr-008)发酵生产杀念菌素的发酵方法，所述方法包括：利用含有葡萄糖·h2o，kh2po4，cacl2，edtana2，znso4·7h2o，feso4·7h2o，mnso4·7h2o，nacl，cuso4·5h2o，mgso4·7h2o和组氨酸的培养基进行发酵培养。较佳地，所述方法中，发酵培养的温度是30±1℃；或所述方法中，发酵培养的转速是220±20r/min。
本发明的有益效果具体如下：
1.本发明的新型培养基成分包括葡萄糖·h2o，kh2po4，cacl2，edtana2，znso4·7h2o，feso4·7h2o，mnso4·7h2o，nacl，cuso4·5h2o，mgso4·7h2o和组氨酸，均为常见试剂，原料易得，用量少，成本低，制备方法简单，有利于大规模工业化生产。
2.采用本发明的新型培养基培养链霉菌(更佳地是链霉菌fr-008)，该菌株在该新型培养基中生长杀念菌素的产量有显著提高，合成杀念菌素的量为371μg/ml，比优化前的106μg/ml单位提高了3.5倍。对链霉菌发酵研究及杀念菌素活性化合物的医药学研究具有重要意义。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如j.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
材料
1、菌株
链霉菌fr-008，由王涛博士构建，获自上海交通大学。
2、一些基本的培养基
斜面培养基(g/l)(sfm)：
琼脂20；
甘露醇20；
黄豆饼粉20(黄豆饼粉需要煮沸熬制后进行过滤除渣)；
用naoh调节ph至7.2～7.5，121℃高温灭菌30min，放置妥当备用。接种孢子，恒温30℃进行培养，3-4天用于孢子萌发。
种子培养基(g/l)(tsby)：
胰蛋白胨30；
酵母粉5；
蔗糖103；
用naoh调节ph至7.2～7.5，121℃高温灭菌30min，接种已经活化的孢子菌悬液，恒温30℃摇床发酵30h，用于菌丝体生长。
复合发酵培养基(g/l)(yeme)：
用naoh调节ph至7.8，115℃30min灭菌，接种前补加2ml的无菌2.5mmgcl2·6h2o，恒温30℃摇床发酵84h用于发酵产杀念菌素。
3、杀念菌素含量测定
发酵液：dmso(1：2，v/v)超声破碎提取30min，8000r/min离心10min取上清，用0.22μm有机相滤膜过滤到棕色液相小瓶中，用于后续的hplc分析，色谱柱为zorbaxsb-c18(4.6×250mm)，5μm，流动相为5.5mmol/l、ph4.5乙酸铵缓冲液：乙腈(60：40，v/v)，流速0.6ml/min，柱温25℃，检测波长380nm。
4、细胞干重测定
菌体浓度采用细胞干重法，取5ml发酵液于已去皮离心管中称取重量，用真空泵和0.8μm孔径47mm尺寸的微孔滤膜过滤得菌丝体，将带有菌丝体的滤饼置于80℃烘箱中烘干至恒重。
5、葡萄糖浓度测定
葡萄糖测定方法采用长春汇力生物技术公司所生产的葡萄糖测定试剂盒(葡萄糖氧化酶法)单一试剂测定。
实施例1、杀念菌素合成培养基优化
1、原始培养基配方
本发明人经过前期的大量分析后，所制定原始合成发酵培养基(g/l)的配方如下：
用naoh调节ph至7.8，115℃30min灭菌，恒温30℃摇床发酵84h用于发酵产杀念菌素。
2、螯合剂的优化
该原始合成培养基中，值得注意的是柠檬酸钠可能作为金属离子螯合剂的同时也可能被当作碳源来利用，这就使得代谢流计算复杂化。
对比了多种螯合剂后，本发明人经过反复论证后发现，与柠檬酸钠相比，edtana2产生了极为明显的正效应。其中，edtana2的量是根据金属离子的摩尔数确定的。
3、碳源优化
为了保证碳源的单一性，将葡萄糖作为培养基中唯一的碳源，本发明人考察了诸多碳源，进行碳源优化实验。找出该培养基中的几个显著的影响因素。接着再对这几个显著的因素的浓度进行优化，最后确定出一个最佳的初始合成培养基。
原始合成培养基中含有11个组分，为了得到对杀念菌素合成影响较大组分，本发明人分析了11个成分中哪些组分对杀念菌素的合成影响较大。实验设计和结果如表2所示，各个因子的浓度见表1，其中1、-1分别表示各成分浓度的最高值和最低值。对产物浓度分析，对各物质进行增加和减少。浓度增加的有：b磷酸二氢钾，c氯化钠，j七水合硫酸镁；浓度降低的有:d七水合硫酸亚铁，f氯化钙，h乙二胺四乙酸二钠。
表1、考察的组分及水平值
表2、实验设计及结果
其中a是葡萄糖，b磷酸二氢钾，c氯化钠，d七水硫酸亚铁，e五水硫酸铜，f氯化钙，g甘氨酸，h乙二胺四乙酸二钠，j七水硫酸镁，k七水硫酸锌，l一水硫酸锰，candicidin指杀念菌素。
4、就前次优化结果的进一步优化
根据上述结果，确定有三个具有非常显著影响的因素是c氯化钠，d五水硫酸铜，j七水硫酸镁。为了进一步确定最优的浓度范围。分别进行了三组单因素爬坡实验。
通过维持其他成分不变，进行mgso4·7h2o梯度实验，设计了五个培养基.m1、m2、m3、m4和m5，mgso4·7h2o的浓度分别为1g/l、4g/l、12g/l、16g/l和20g/l。在其它成分不变的情况下，mgso4·7h2o的浓度在1g/l时杀念菌素浓度为0μg/ml；4g/l时杀念菌素浓度为0μg/ml；12g/l时杀念菌素浓度为73μg/ml；16g/l时杀念菌素浓度为49μg/ml；20g/l时杀念菌素浓度为51μg/ml；在实验过程中发现，在mgso4·7h2o的浓度为1g/l和4g/l的两个培养基上菌体不能够正常生长。
通过维持其他成分不变，进行nacl梯度实验，设计了n1、n2、n3、n4、n5和n6六个培养基，nacl浓度分别为5g/l、7g/l、9g/l、11g/l、13g/l和15g/l。在其它成分不变的情况下，nacl浓度为5g/l时杀念菌素浓度为144μg/ml；7g/l时杀念菌素浓度为190μg/ml；9g/l时杀念菌素浓度为217μg/ml；11g/l时杀念菌素浓度为147μg/ml；13g/l时杀念菌素浓度为173μg/ml；和15g/l时杀念菌素浓度为107μg/ml；其中nacl浓度为9g/l产素能力最好取为最优点，初始的nacl浓度为5g/l。
通过维持其他成分不变，进行cuso4·5h2o梯度实验来验证，设计了c1、c2、c3、c4、c5和c6六个培养基。cuso4·5h2o浓度分别为0.024g/l、0.03g/l、0.036g/l、0.042g/l、0.048g/l和0.054g/l。在其它成分不变的情况下，cuso4·5h2o浓度在0.024g/l时杀念菌素浓度为92μg/ml；0.03g/l时杀念菌素浓度为110μg/ml；0.036g/l时杀念菌素浓度为126μg/ml；0.042g/l时杀念菌素浓度为115μg/ml、0.048g/l时杀念菌素浓度为107μg/ml和0.054g/l时杀念菌素浓度为91μg/ml。cuso4·5h2o的初始浓度为0.016g/l杀念菌素浓度为106μg/ml，最优浓度在0.036g/l，杀念菌素浓度为126μg/ml。
根据上述结果，确定有三个具有非常显著影响的因素是c氯化钠，d五水硫酸铜，j七水硫酸镁。经过三个组分的五水平中心组合实验及响应面分析优化，得到较优的发酵培养基组成为(g/l)：
用naoh调节ph至7.8，115℃30min灭菌，恒温30℃摇床发酵84h用于发酵产杀念菌素。
5、氮源优化
对链霉菌fr-008培养基筛选完成后，发现不同的氮源对杀念菌素的合成有着千差万别的作用。在已经筛选得到比较有利于菌体生长和产素的合成培养基的基础上继续进行了氮源的优化实验。该实验的核心部分是保证单一变量原则，在确保培养基中氮含量一定的前提下，改变培养基中氮源的种类，然后将目标菌种接到各个培养基中进行发酵培养。通过取样记录培养基在各个时间点的ph，氮含量，糖含量，单位菌液干重等来确定菌体的生长情况，通过杀念菌素产量数据的处理与分析来确定一种或者几种比较适合目标菌生长和生产的氮源种类，来判断不同氮源对链霉菌fr-008合成杀念菌素的影响。
本次实验用于筛选的氮源为：甘氨酸glycine，丙氨酸alanine，缬氨酸valine，亮氨酸leucine，异亮氨酸isoleucine，苯丙氨酸phenylanine，脯氨酸proline，色氨酸tryptophan，丝氨酸serine，酪氨酸tyrosine，半胱氨酸cysteine，蛋氨酸methionine，天冬氨酸asparticacid，谷氨酰胺glutamine，苏氨酸threonine，天冬酰胺asparagine，谷氨酸glutamicacid，赖氨酸lysine，精氨酸arginine，组氨酸histidine，尿素co(nh2)2，硫酸铵(nh4)2·so4，硝酸钠nano3，对氨基苯甲酸。
最终，得到最优的发酵培养基组成为(g/l)：
实施例2、杀念菌素产物浓度比较
1、发酵方法
(1)斜面培养
将放于-80℃冰箱甘油管保藏的菌种取出，吸取100μl涂布于50mlsfm培养基，在30℃恒温培养箱进行3天的产孢发酵。
(2)种子瓶培养
将平板从30℃恒温箱中拿出，用灭过菌的去离子水洗孢子，在得到的孢子菌悬液中吸取1ml孢子菌悬液接种于含有100mltsby发酵培养基的500ml摇瓶，30℃，220r/min，培养30小时，用于菌丝体生长。
(3)发酵培养
将1ml30小时培养过后的种子接种于含有100ml发酵培养基500ml摇瓶，30℃，220r/min，84h，摇床培养用于菌体生长和产杀念菌素。所应用的发酵培养基包括本发明中优化前的培养基以及优化后的培养基。
2、杀念菌素产量测定
在发酵过程中，12小时取样一次，分别测杀念菌素浓度和菌体干重，杀念菌素产量曲线如图1所示。由图可见，本发明中优化的合成培养基杀念菌素产量达到371μg/ml，而优化前的培养基的产量为106μg/ml，显著提高了3.5倍，实现了极为显著的进步。
3、菌体生长曲线
发酵过程中取样，测得的菌体干重dcw如图2所示。由图可以看出，本发明的合成培养基菌体浓度显著高于原始培养基。
综上，本发明提供了一种用于杀念菌素生产的合成培养基。采用本合成培养基更有利于对杀念菌素的合成和代谢调控机理进行分析，为进一步提高杀念菌素的工业产量奠定了基础。
该培养基中各成分浓度如下(g/l)：葡萄糖·h2o22，kh2po40.5，cacl20.05，edtana21.81，znso4·7h2o0.036，feso4·7h2o0.028，mnso4·7h2o0.009，nacl12.5，cuso4·5h2o0.036，mgso4·7h2o7.98，histidine5.74。
用优化后配方培养链霉菌fr-008合成杀念菌素的量为371μg/ml，比优化前的106μg/ml单位提高了3.5倍。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。