一种鉴定水稻产生ALS基因突变的四引物分子标记方法与流程

一、技术领域

本发明涉及一种鉴定水稻产生als基因突变的四引物分子标记方法，属于生物技术工程领域，专用于抗als抑制剂类除草剂水稻品种资源的鉴定和品种选育。

二、

背景技术：

随着社会经济的不断发展，农村劳动力大量转移，直播稻作为水稻轻简栽培的一种重要方式，由于省工节本效果明显，深受广大农户的欢迎，种植面积迅速扩大。以江苏省为例，2008年全省直播稻面积高达69.3万hm²，约占水稻总面积的33％(孙统庆等，中国稻米，2014，20(6)：5-9)。近年来，随着机插秧技术的快速推广以及严控直播稻盲目发展措施的落实，其快猛增长的趋势有所遏制，但仍是水稻种植的重要方式。长期以来，田间杂草危害一直是困扰直播稻生产的技术难题，尽管一些商业化的除草剂能有效防治草害发生，但不当施用经常常会对水稻造成不同程度的伤害。因此，培育具有除草剂抗性的水稻品种是防治直播田杂草危害最经济、有效的途径。

近年来，各种以乙酰乳酸合成酶(acetolactatesynthase,als)为靶标的除草剂如咪唑啉酮类(imidazolinones,ims)、磺酸脲类(sulfonylureas,sus)、三唑并嘧啶类(triazolopyrimidines,tps)、嘧啶羧酸类(pyrimidinylcarboxyherbicides,pcs)等，由于具有除草谱广、低毒高效、选择性强等优点，被广泛应用于作物杂草的灭除(曲仁渝等,华中师范大学学报(自然科学版),2015,49(5):735-745)。该类除草剂的作用机理主要是通过与植物体内的乙酰乳酸合酶形成复合物阻断底物进入酶活性位点通路，抑制als酶活性，使支链氨基酸如亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸的合成受阻，导致植物死亡。抗性机制研究表明，植物als基因保守区发生错义突变会导致酶结构发生变化，降低对除草剂的亲和力，进而产生抗性(dugglebyrg,etal.,plantphysiolbiochem,2008,46:309-324)。

美国是最早开展als抑制剂类除草剂抗性品种选育的国家。1993年路易斯安那州立大学农业中心利用甲磺酸乙酯(ethylmethanesulfonate,ems)诱变水稻品种as3510，m2代喷洒咪唑乙烟酸，筛选出具有咪唑啉酮类除草剂抗性的突变系93as3510，并进一步与品种cocodrie和maybelle杂交，选育出抗性品种cl121与cl141，并于2002年首次在美国进行商业化种植(sudiantoe,etal.,cropprot,2013,49:40-51)。为进一步提高品种的丰产性，该中心利用相同的方法对美国优质籼稻品种cypress进行诱变，筛选出抗性品系pwc16，并系统选育出品种cl161，并逐步取代cl121和cl141(wenefridaietal.,canjplantsci,2007,87:659-669.)。此后，阿根廷学者也从当地品种irga417的ems诱变后代中筛选出抗性材料并育成品种puita’intacl(goularticgr,etal.,weedres,2012,52:224-232)。分子生物学研究表明，虽然as3510、pwc16和puita’intacl等材料都具有相似的除草剂抗性，但基因的变异位点则完全不同。as3510的抗性源自als基因第654位甘氨酸(gly,g)转变为谷氨酸(glu,e)；pwc16的抗性是由第653位丝氨酸(ser,s)突变为天冬氨酸(asp,d)造成的；而puita’intacl出现抗性则是由第122位缬氨酸(val,v)到苏氨酸(thr,t)的变异(goularticgr,etal.,weedres,2012,52:224-232)。目前，由于上述位点均已申请相关专利，而我国想在此基础上开展商业化育种，不仅会受到国外研究机构的诸多限制，而且还必须承担昂贵的专利使用费。近年来，深圳兴旺生物种业有限公司利用化学诱变的方法处理广东优质常规籼稻品种黄丝占和黄华占，通过苗期大规模咪唑啉酮类除草剂的筛选，获得一些突变体具有新的als基因突变位点。研究发现，与野生型相比，其中黄华占突变植株1的als基因在编码区第1642和1643碱基发生tg到at的突变，导致第548位编码氨基酸由色氨酸(trp,w)突变为甲硫氨酸(met,m)，进而产生除草剂抗性(陈竹锋，王承旭，柳威，唐晓艳，邓兴旺.中国专利，cn201210037789.9，2013-04-17)，这是我国首次报道在水稻中发现具有自主知识产权的抗als抑制剂类除草剂新位点和新材料，它将推动国内相关育种工作的蓬勃开展。

利用目标基因存在的碱基差异，开发共显性的功能标记进行辅助选择是提高als抑制剂类除草剂抗性品种选育效率的最佳方法。针对已发现的变异位点，kadaru和roso等分别利用等位基因特异pcr(allele-specificpcr，as-pcr)和竞争性等位基因特异性pcr的方法(kompetitiveallelespecificpcr，kasp)，对造成g654e、s653d、a122t氨基酸变异的碱基位点开发相应的分子标记，实现了对上述差异位点准确的鉴定(kadarus,etal.,euphytica,2008,160:431-438；rosoac,etal.,fieldcropsres,2010,119:175-182；rosasjeetal.,electronicjofbiotechn,2014,17:95-101)。然而，传统aspcr虽然能够避免caps(cleavedamplifiedpolymorphismsequences)标记检测过程中酶切等繁琐的操作，但结果假阴性偏多，且不能对杂合基因型进行一次性检测；而kasp技术尽管具有高通量的特性，但对引物和检测设备的要求较高，国内大多数育种单位目前还难以应用。

四引物扩增受阻突变体系pcr技术(tetra-primeramplificationrefractorymutationsystempcr,tetra-primerarms-pcr)是近年来在等位基因特异扩增pcr基础之上发展起来的，专门针对单核苷酸突变一种新的检测方法。通过四条引物的一次pcr扩增、电泳就可以直接达到区分不同基因型的目的，具有快速、简便、费用低等特点，并在水稻分子育种中开始得到广泛应用(陈涛等，中国水稻科学，2013，27(5)：529-534；李军等，中国水稻科学，2014，28(4)：442-446)。其技术原理是依据taqdna酶聚合酶缺少3′→5′外切酶活性，对于3′末端错配的引物，以低于正常末端配对引物的速度延伸，当错配碱基的数目达到一定程度或者条件达到一定的严谨程度时，3'末端碱基则因磷酸二酯键的形成困难而不能继续延伸，反应终止，不能得到特异长度的扩增条带(yes,etal.,nucleicacidsres,2001,29,e88)。因此，有必要建立一种新的基于pcr技术的基因分型法来鉴定水稻产生als抑制剂类除草剂抗性新的基因变异，为als抑制剂类除草剂抗性品种资源的鉴定和品种高效选育提供技术支撑。

三、

技术实现要素：

技术问题：本发明针对传统as-pcr结果假阴性偏多，且不能对杂合基因型进行一次性检测以及kasp技术对引物和检测设备的要求较高，国内大多数育种单位目前还难以应用等缺点，根据抗als抑制剂类除草剂水稻黄华占突变植株1与野生型黄华占在als基因编码区第1642和1643碱基存在tg到at的突变，设计四条特异性引物并采取一步pcr的方法来快速、准确的鉴定水稻产生als基因突变，以达到抗als抑制剂类除草剂抗性品种资源鉴定和标记辅助育种的目的。

技术方案：

一种鉴定水稻产生als基因突变的四引物分子标记方法，其特征在于：所述als基因突变指的是als抑制剂类除草剂抗性基因在编码区第1642和1643位点发生tg到at的变异，用als基因特异性引物：

正向外引物als-o-f序列为5’-aggtgaggcaatcatcgctac-3’

反向外引物als-o-r序列为5’-atgggtcattcaggtcaaaca-3’

正向内引物als-i-f序列为5’-aaccaacatttgggtatggttgtgctaa-3’

反向内引物als-i-r序列5’-ctatttgccttgtaaaacctatccttcc-3’

扩增水稻基因组dna，如果同时有646bp和321bp两条特征条带，则为不含als基因突变的纯合体，不具有als抑制剂类除草剂抗性；如果同时有646bp和381bp两条特征条带，则为含als基因突变的纯合体，具有als抑制剂类除草剂抗性；如果同时存在646bp、381bp和321bp三条特征条带，则为含als基因突变的杂合体，同样具有als抑制剂类除草剂抗性。

所述的方法，其特征在于：

(1)水稻植株基因组dna的提取；

(2)将所述的四条分子标记引物als-o-f、als-o-r、als-i-f和als-i-r加入同一pcr反应体系，并对水稻种质资源或育种群体植株的dna进行扩增；

20μlpcr体系包括10ng/μldna2.0μl，4pmol/μl正反向引物2.0μl，其中引物als-o-f、als-o-r、als-i-f和als-i–r各0.5μl，含25mmol/lmgcl2的10×缓冲液2.0μl，2.5mmol/l的dntp0.4μl，5u/μl的taq0.5μl，ddh2o13.1μl；

反应程序包括：95℃下预变性5min，95℃下变性30s，59℃下复性30s，72℃下延伸1min，循环35次后，72℃下延伸7min，10℃冷却10min，将扩增产物加入上样缓冲液终止反应；

(3)反应产物在质量比浓度为3.0％的琼脂糖凝胶上130v电泳30min，经dured核酸染色并于凝胶成像系统下观察，记载。

其中als抑制剂类除草剂包括咪唑啉酮类、磺酸脲类、三唑并嘧啶类和嘧啶羧酸类除草剂。

其抗性鉴定方法为当水稻生长到5叶1心期，将als抑制剂类除草剂水剂稀释1000倍，按300l/hm²的用量进行喷雾处理，10天后调查除草剂抗性，无明显症状的记为抗，叶片全部黄化枯死的记为感。

所述的方法可以在鉴定水稻产生als基因突变中得到应用，也可以在水稻抗als抑制剂除草剂性状改良过程中得到应用。

有益效果

本发明提供的“一种鉴定水稻产生als基因突变的四引物分子标记方法”，具有以下优点：

(1)本发明提供的分子标记并非与als基因连锁的分子标记，而是根据基因的变异位点设计的功能性标记，它能直接反映植株的基因型和表型，不存在由于标记和基因间的遗传交换而造成基因型鉴定的错误；

(2)本发明提供的分子标记能实现对als基因编码区第1642和1643碱基存在tg到at的突变进行检测，由于现有产生抗als抑制剂类除草剂的als基因的变异位点较多，很难根据表型进行有效区分，通过本发明的方法可以实现对上述位点的检测，而不需要通过测序以及大量、复杂的遗传试验来确定其变异位点；

(3)本发明提供的分子标记方法能有效用于抗als抑制剂类除草剂水稻品种辅助育种，由于传统育种中对除草剂抗性的鉴定主要是通过田间喷施除草剂后对表型进行观察得出的，这样的方法不仅受植株生长发育阶段的影响，耗时、耗力，而且很难对同样具有除草剂抗性的杂合基因型进行有效判断。而利用一种鉴定水稻产生als基因突变的四引物分子标记方法可以在种子发芽后提取dna就对该变异位点的纯合基因型进行鉴定、选择，淘汰大量非目标单株，这能有效提高抗als抑制剂类除草剂水稻品种的选择效率，缩短育种周期和减少育种成本。

(4)与现有鉴定als抑制剂类除草剂抗性其它变异位点的分子标记caps、as-pcr和kasp相比，本发明采用四引物一步pcr扩增的方法对als基因突变位点不同基因进行鉴定，不仅能有效区别其纯合和杂合基因型，而且还可以避免检测过程中准确性差、试验流程烦琐、费用昂贵等弊端，更为高效、快捷，适合于对大量水稻资源和育种材料进行鉴定和选择。

四、附图说明

图1用于检测水稻产生als抑制剂类除草剂抗性als基因变异的四引物分子标记的策略

(阴影表示不同品种差异碱基，阴影斜体表示产生als抑制剂类除草剂抗性的关键碱基，下划线表示终止密码子)。

图2四引物pcr分子标记对不同水稻品种(品系)als基因型的电泳检测

(m：dna分子量标准，100-2,000bp；1：含als基因突变的纯合体水稻黄华占突变植株1；2-5：不含als基因突变的纯合体水稻黄华占、南粳2728、淮稻5号和镇稻99)

图3als抑制剂类除草剂咪唑乙烟酸对不同水稻品种(品系)的抗性测试

(a：黄华占突变植株1；b：南粳2728)

图4四引物pcr分子标记对淮稻5号/黄华占突变植株1f2群体部分单株als基因型的电泳检测

(m：dna分子量标准，100-2,000bp；1：黄华占突变植株1；2-淮稻5号；3-淮稻5号/黄华占突变植株1f1杂种个体；4～17-部分f2分离单株)

图5als抑制剂类除草剂咪唑乙烟酸对淮稻5号/黄华占突变植株1f2群体的抗性测试

(a：不含als基因突变纯合基因型单株；b：含als基因突变纯合基因型植株；c：含als基因突变杂合基因型单株)

图6本发明分子标记方法用于水稻品系南粳2728抗als抑制剂除草剂性状的改良过程

五、具体实施方式

通过引进深圳兴旺生物种业有限公司利用化学诱变的方法处理广东优质常规籼稻黄华占获得的突变体材料黄华占突变植株1(公知公用，见公开专利cn201210037789，水稻抗除草剂蛋白及其在植物育种中的应用，公开日：20120220.)。比较粳稻品种nipponbare和籼稻品种黄华占的相关序列，发现上述籼、粳稻als基因在cds区域存在29处单核苷酸变异，其中绝大多数点突变为同义突变，并不影响其编码的氨基酸，而4处导致氨基酸序列变异的错义突变，均不位于能够导致als基因产生除草剂抗性的5个高度保守区域。在此基础上，进一步与黄华占突变植株1的编码区序列进行比较，发现其als基因在编码区第1642和1643位点发生tg到at的变异，导致第548位氨基酸由色氨酸突变为甲硫氨酸，而该位点正好位于als基因高度保守区域domainb中，进而产生als抑制剂类除草剂抗性。在此基础上，根据两个连续核苷酸的差异设计了四引物pcr分子标记，利用该标记方法不仅可以有效鉴定抗als抑制剂类除草剂水稻als基因的变异类型，同时还可以对该变异位点的不同基因型进行检测，达到抗als抑制剂类除草剂抗性品种资源鉴定和标记辅助育种的目的。

“一种鉴定水稻产生als基因突变的四引物分子标记方法”其具体实施步骤如下：

(一)试验材料

抗als抑制剂类除草剂突变体材料：黄华占突变植株1，深圳兴旺生物种业有限公司利用化学诱变的方法处理广东优质常规籼稻品种黄华占，通过苗期大规模咪唑啉酮类除草剂的筛选，获得了抗性突变体材料。

不抗als抑制剂类除草剂水稻品种(品系)：黄华占(常规籼稻品种，广东省农业科学院水稻研究所)；南粳2728(常规粳稻新品系，江苏省农业科学院粮食作物研究)、淮稻5号(常规粳稻品种，江苏徐淮地区淮阴农业科学研究所)、镇稻99(常规粳稻品种，江苏丘陵地区镇江农业科学研究所)、日本晴(常规粳稻品种，日本爱知县农试场)

als突变基因分离群体是以淮稻5号为母本，黄华占突变植株1父本进行杂交、自交获得的280个f2单株。

以上材料均为公知公用材料，江苏省农业种质资源中期库可免费提供。具体参考文献为：陈竹锋，王承旭，柳威，唐晓艳，邓兴旺.中国专利，cn201210037789.9，2013-04-17.；周少川等，优质稻品种黄华占的选育及育种体会，湖南农业科学，2012，9：1-4；http://crops.jaas.ac.cn/show.aspx？class＝1&id＝966；袁彩勇等，淮稻5号的特征特性及高产栽培技术，中国稻米，2002，8：14；胡春明等，中熟中粳稻镇稻99的选育及利用，江苏农业科学，2002，1：32-33；中国水稻信息中心http://www.ricedata.cn/variety/varis/602979.htm)

(二)核酸序列分析

相关研究表明，水稻als基因cds全长为1935bp，仅有一个外显子，编码644个氨基酸(宋贵生等，中国农业科技导报，2007,9(3)：66-72.)。通过比较粳稻品种日本晴和籼稻品种黄华占的相关序列，发现上述籼、粳稻als基因在cds区域存在29处单核苷酸变异，其中绝大多数点突变为同义突变，并不影响其编码的氨基酸，而4处导致氨基酸序列变异的错义突变，均不位于能够导致als基因产生除草剂抗性的5个高度保守区域domaina(¹⁶⁵aitgqvprrmigt¹⁷⁷)、domainb(⁵⁴⁷qwed⁵⁵⁰)、domainc(⁸⁹vfaypggasmeihqaltrs¹⁰⁷)、domaind(¹⁷⁹afqetp¹⁸⁴)和domaine(⁶²⁵ipsgg⁶²⁹)中(boutsalisp,etal.,pesticsci,1999,55:507-516)。在此基础上，进一步与黄华占突变植株1的cds序列进行比较，发现其als基因在编码区第1642和1643位点发生tg到at的变异，导致第548位编码氨基酸由色氨酸(trp,w)突变为甲硫氨酸(met,m)，而该位点正好位于als基因高度保守区域domainb中，进而产生als抑制剂类除草剂抗性。

(三)分子标记的开发

下载nipponbareals基因的全长序列，根据tetra-primerarmspcr技术的原理，先确定正向(als-i-f)和反向内引物(als-i-r)，其中正向内引物的3’末端与黄华占突变植株1第1642位碱基相同，反向内引物与黄华占野生型第1643位碱基互补，同时为增强内引物的特异性，在3’端第3位各引入一个人工错配碱基，即als-i-f由a变t，而反向内引物则由c变t。同时，利用primerpremier5.0软件设计出多对正向和反向外引物，综合考虑四条引物的tm(meltingtemperature)值、引物之间的互补情况以及差异片段是否能在琼脂糖凝胶电泳中得到有效区分等多种因素，选择出最合适的外引物对进行搭配(图1)。根据各引物在als基因序列中的位置，从理论上讲无论是否具有目标位点的碱基变异都能被正反向外引物扩增出具有阳性对照作用的646bp条带。除此之外，含als基因突变纯合基因型的水稻还能扩增出381bp的特征条带，不含als基因突变纯合基因型水稻则能扩增出321bp的特征条带，而杂合材料能同时扩增646bp、381bp以及321bp三条特征条带。

(四)分子标记验证

(1)在als抑制剂类除草剂处理前3天，收集水稻品种(品系)、f1杂种、f2群体的新鲜幼嫩叶片，按ctab法提取基因组dna(murraymg,etal.,nucleicacidsres,1980,8:4321–4325)。具体步骤为：取2-3cm水稻嫩叶装入2ml的离心管中，液氮冷冻后用磨样棒磨成粉末；向研磨好的材料中加入65℃恒温水浴锅中预热30min的700μl含质量浓度比2％ctab的dna提取液，混匀后，放入35℃的恒温水浴锅中30min，期间每隔10min摇匀一次；取出离心管，在通风橱中每管加入24:1(氯仿：异戊醇＝24：1)700μl，充分混匀，放入离心机内1,2000rpm离心15min，使其分为三层；吸取上清液400μl与另一个1.5ml灭菌的离心管中，加入-20℃预冷的400μl异丙醇，缓慢混匀，在-20℃冰箱自由沉降30min。然后，10000rpm离心10min，弃上清；加入70％乙醇400μl洗涤1次，弃上清，风干；加入100-200μl的te缓冲液，室温溶解成dna溶液1-2d，置-20℃保存；

(2)分子标记的扩增和电泳电测

利用als基因四引物分子标记，其引物序列为

正向外引物als-o-f序列为5’-aggtgaggcaatcatcgctac-3’

反向外引物als-o-r序列为5’-atgggtcattcaggtcaaaca-3’

正向内引物als-i-f序列为5’-aaccaacatttgggtatggttgtgctaa-3’

反向内引物als-i-r序列5’-ctatttgccttgtaaaacctatccttcc-3’

对不同水稻品种(品系)以及als突变基因分离群体进行pcr扩增和电泳检测。

20μlpcr体系包括10ng/μldna2.0μl，4pmol/μl正反向引物2.0μl，其中引物als-o-f、als-o-r、als-i-f和als-i-r各0.5μl，含25mmol/lmgcl2的10×缓冲液2.0μl，2.5mmol/l的dntp0.4μl，5u/μl的taq0.5μl，ddh2o13.1μl；

反应程序包括：95℃下预变性5min，95℃下变性30s，59℃下复性30s，72℃下延伸1min，循环35次后，72℃下延伸7min，10℃冷却10min，将扩增产物加入上样缓冲液终止反应；

(3)结果分析

①不同品种(品系)als基因型检测和除草剂抗性鉴定

在除草剂处理前3天，提取黄华占、黄华占突变植株1、南粳2728、淮稻5号和镇稻99等5个籼、粳稻品种(品系)的dna进行分子标记扩增，产物经3.0％琼脂糖凝胶电泳可显示两种类型的条带(图2)，被正向外引物als-o-f和反向外引物als-o-r扩增起阳性对照作用的646bp的条带在每个检测材料中均出现，这表明所有样本的dna都得到了有效扩增。除646bp的条带外，南粳2728、淮稻5号、镇稻99和黄华占中还能检测出一条约为321bp的条带，它是由正向外引物als-o-f和反向内引物als-i-r扩增产生的，其特异扩增als基因编码区中第1643位核苷酸为g的等位位点。而黄华占突变植株1虽不能扩增出321bp的条带，但却能扩增除一条381bp的条带，该条带是由正向内引物als-i-f和反向外引物als-o-r扩增产生的，其特异扩增als基因cds第1642位核苷酸为a的等位变异位点。为验证基因型和表型是否具有一致性，当上述品种(品系)生长到5叶1心期时进行als抑制剂类除草剂—咪唑乙烟酸喷雾处理。除黄华占突变植株1没有表现出明显症状外，其它材料叶片全部黄化枯死(图3)。这说明利用该方法可以快速、准确的对als基因编码区第1642和1643位点发生tg到at突变的抗除草剂水稻进行有效鉴定。

②f2分离群体als基因型检测和除草剂抗性鉴定

为进一步验证四引物标记对杂合基因型的检测效果，在4叶1心期时，提取淮稻5号/黄华占突变植株1f2群体280个单株的dna并对其进行pcr扩增。结果表明，所有f2单株的电泳产物只出现三种类型的条带，其中67株能扩增出646bp和381bp的条带，60株能扩增出646bp和321bp的条带，其余153株则能扩增出646bp、381bp和321bp的条带(图4)。三种带型对应的基因型比例为1∶2∶1，符合1对基因的分离规律(χ²＝2.764<χ²0.052，0.25<p<0.50)。为直观反映基因型和表型是否一致性，将群体单株按不同基因型进行移栽，待苗恢复正常后进行als抑制剂类除草剂—咪唑乙烟酸进行喷雾处理。除不含als基因突变纯合基因型水稻全部黄化枯死外，其它两种基因型的单株都不出现除草剂危害的症状(图5)。这不仅说明该引物可以有效对杂合基因型进行准确鉴定，同时也说明突变所产生的除草剂抗性由一对显性基因所控制。

(五)本发明分子标记方法用于抗als抑制剂类除草剂水稻育种

选用抗als抑制剂类除草剂黄华占突变植株1为供体，优良食味、抗稻瘟病粳稻新品系南粳2728为供体，采用回交育种的策略，定向导入抗als抑制剂类除草剂性状。在连续回交和自交的过程中，利用本发明的四引物pcr分子标记进行跟踪检测，并结合农艺性状的系统选择，至bc3f3代获得具有als抑制剂类除草剂抗性，其它农艺性状与原始亲本南粳2728基本一致的改良品系，其具体选育过程详见图6。这表明利用本发明的分子标记方法能够对水稻产生als抑制剂类除草剂抗性的碱基变异进行选择，实现对als抑制剂类除草剂抗性水稻品种的高效选育。

sequencelisting

<110>江苏省农业科学院

<120>一种鉴定水稻产生als基因突变的四引物分子标记方法

<130>0

<160>4

<170>patentinversion3.1

<210>1

<211>30

<212>dna

<213>1

<220>

<221>gs3-o-f

<222>(1)..(30)

<223>

<400>1

cctcagacatcacctgaaaagttgacaggc30

<210>2

<211>29

<212>dna

<213>人工

<220>

<221>gs3-o-r

<222>(1)..(20)

<223>

<400>2

cggtcaaagttcatgatcaaaaactgggg29

<210>3

<211>23

<212>dna

<213>人工

<220>

<221>gs3-i-f

<222>(1)..(21)

<223>

<400>3

tccacgctgcctccagatgccga23

<210>4

<211>27

<212>dna

<213>了

<220>

<221>gs3-i-r

<222>(1)..(20)

<223>

<400>4

agaaacagcaggctggcttactctttg27