猪传染性胃肠炎病毒检测试剂盒及检测方法与流程

本发明属于动物疾病分子生物学检测
技术领域：
，具体涉及一种猪传染性胃肠炎病毒检测试剂盒及检测方法。
背景技术：
：猪传染性胃肠炎(transmissiblegastroenteritisofswine,tge)是由猪传染性胃肠炎病毒(transmissiblegastroenteritisvirusofswine,tgev)引起的一种以呕吐、水样腹泻、脱水为主要特征的高度传染性疾病，美国1945年首次证实该病病原，世界动物卫生组织(oie)将其列为b类疾病中必检的传染病。我国至20世纪50年代首次报道以来，目前我国大部分地区都有该病发生流行，秋冬为该病高发期，各种不同品种和周龄的猪都能感染tgev病发病，其中以2周龄内仔猪发病后死亡率最高，高达100％；5周龄以上的仔猪感染传染性胃肠炎后死亡率较低，但会影响仔猪后期的生长，降低仔猪的饲料利用率，是重要的猪病毒性腹泻病之一，给养猪业带来了严重危害。然而，该病原与猪流行性腹泻病毒(pedv)、猪轮状病毒(rv)、呼吸道冠状病毒(prcv)等其他病原所引起的临床症状相似，仅通过流行病学和临床症状不能作出准确诊断，行之有效的实验室诊断方法对该病发生和流行的控制起到了至关重要的作用。tgev属于冠状病毒科冠状病毒属，其基因组为大的单链正股rna，n基因编码其核衣壳蛋白，在病毒复制、转录及致病性等方面具有重要作用，且基因结构高度保守，在疫苗应用及分子诊断方面均有较大价值。实验室检测tgev的方法很多，这些常规检测方法在技术上虽然比较成熟，但目前尚存在一些问题：病毒的分离鉴定是确认该病原最准确的病原学诊断方法之一，一般大多数传染病的确定都是依靠病原的分离鉴定。但此方法耗时时间长(7～10天)，且存在成本高、操作过程复杂等缺点，很难满足临床诊断所要求的时效性，主要应用于科学研究。电镜技术检测tgev也是常用的病原学诊断方法之一，但由于tgev与pedv猪呼吸道冠状病毒等冠状病毒形态相似，仅靠电镜观察无法鉴别诊断，免疫电镜法可以更敏感确切地检测临床样品或细胞培养物中的tgev，并可提供病毒血清学鉴定。然而，不管是常规电镜检测技术还是免疫电镜检测技术，都存在操作复杂，成本高，对仪器设备要求高等缺点。也可用血清中和试验、酶联免疫吸附试验、免疫荧光法和免疫过氧化物酶技术等免疫学技术检测tgev，特异性抗体的质量是免疫学检测准确度的首要因素，而prcv与tgev的抗原性有一定的相关性，很易出现假阳性反应，是该技术应用于检测tgev的重要缺点之一。常规rt-pcr方法是目前疫控中心、科研机构所普遍选用的tgev检测方法，可免去病毒分离培养的过程，同时，检测灵敏度和准确度都较常规病毒分离和免疫学诊断方法高，但该方法对仪器设备要求较高，操作复杂，扩增产物极易造成气溶胶污染，不适合在基层推广，多重pcr方法亦存在相同的缺陷。荧光定量pcr虽可解决气溶胶污染的问题，但昂贵的仪器设备一般的检测机构难易承受。lamp方法是另外一种分子检测方法，该方法廉价、快速、灵敏度和特异度高，且因其恒温扩增不需要pcr仪等昂贵设备，且可通过观察扩增副产物的有无判断扩增结果。但是，有研究表明通过扩增副产物观察结果没有电泳法灵敏，而如果开盖电泳观察结果又将大大增加气溶胶污染的可能性，且lamp扩增产物所引物的气溶胶假阳污染比常规pcr/rt-pcr更严重，因此，怎样有效的检测lamp的扩增产物是制约该技术发展的一大因素。基因芯片技术也是未来疾病快速诊断的一个发展方向，但是目前该技术还不成熟。因此，尚没有一种操作简单、成本低廉、检测效果灵敏的检测方法用来检测tgev。交叉引物恒温扩增技术(crossingprimingamplification,cpa)是一种新型核酸等温扩增技术(专利号：200810134583.1)。该技术利用一种链置换dna聚合酶在62℃左右的恒温条件下保温1小时即可特异、快速、高效地完成核酸扩增反应。该技术与一些快速检测技术结合(如快速检测试纸条[专利号：200610003429.1]、一次性全封闭式靶核酸扩增物快速检测装置[专利号：200610109620.4]等)，可以为现场快速分子检测提供一个平台，操作简单，仅需一台水浴锅或金属浴即可完成核酸扩增，其扩增产物用密闭的核酸检测试纸条进行结果判定，检测结果肉眼可见，且可有效避免气溶胶污染。简便、快速、准确、灵敏，在食品安全检测、传染性病原检测、日常病原监测、海关检验检疫、突发公共卫生事业的战略性技术储备等领域有广泛应用。技术实现要素：本发明要解决的技术问题为：现有技术缺乏一种操作简单、成本低廉的检测猪传染性胃肠炎病毒的方法。本发明解决技术问题的技术方案为：提供一种猪传染性胃肠炎病毒检测试剂盒及检测方法。本发明提供了一种猪传染性胃肠炎病毒检测试剂盒，包括：检测猪传染性胃肠炎病毒的正向外围引物f3、反向外围引物b3、交叉引物cpr、正向探针df5f和反向探针df5b。其中，上述猪传染性胃肠炎病毒检测试剂盒中，所述的正向外围引物f3的核苷酸序列为seqidno.1所示核苷酸序列中的至少5个连续核苷酸。其中，上述猪传染性胃肠炎病毒检测试剂盒中，所述的反向外围引物b3的核苷酸序列为seqidno.2所示核苷酸序列中的至少5个连续核苷酸。其中，上述猪传染性胃肠炎病毒检测试剂盒中，所述的交叉引物cpr的核苷酸序列为seqidno.3所示核苷酸序列中的至少5个连续核苷酸。其中，上述猪传染性胃肠炎病毒检测试剂盒中，所述的正向探针df5f的核苷酸序列为seqidno.4所示核苷酸序列中的至少5个连续核苷酸，5’端标记有fam基团。其中，上述猪传染性胃肠炎病毒检测试剂盒中，所述的反向探针df5b的核苷酸序列为seqidno.5所示核苷酸序列中的至少5个连续核苷酸，5’端标记有biotin基团。其中，上述猪传染性胃肠炎病毒检测试剂盒中，所述核酸恒温扩增反应液组成包括：每16μl中反应液中正向外围引物f30.1～0.6μmol，反向外围引物b30.1～0.6μmol，交叉引物cpr0.4～1.6μmol，正向探针df5f0.2～1μmol，反向探针df5b0.2～1μmol，mgso40～6mmol，dntp溶液0.1～0.6mmol，betaine0～1.5mol，gspf酶8u/μl4～12u，10×gspfbuffer2μl，amv0.02～0.5u，25×rnasecure0.8μl，余量为双蒸水。优选的，上述猪传染性胃肠炎病毒检测试剂盒中，所述核酸恒温扩增反应液组成包括：每16μl中反应液中正向外围引物f30.1～0.3μmol，反向外围引物b30.1～0.2μmol，交叉引物cpr0.9～1.0μmol，正向探针df5f0.3～0.4μmol，反向探针df5b0.7～0.8μmol，mgso41～3mmol，dntp溶液0.3～0.5mmol，betaine0.9～1.0mol，gspf酶8u/μl9～10u，10×gspfbuffer2μl，amv0.1～0.2u，25×rnasecure0.8μl，余量为双蒸水。更优选的，上述猪传染性胃肠炎病毒检测试剂盒中，所述核酸恒温扩增反应液组成包括：每16μl中反应液中正向外围引物f30.26μmol，反向外围引物b30.1μmol，交叉引物cpr1.0μmol，正向探针df5f0.4μmol，反向探针df5b0.8μmol，mgso42mmol，dntp溶液0.4mmol，betaine1.0mol，gspf酶8u/μl10u，10×gspfbuffer2μl，amv0.2u，25×rnasecure0.8μl，余量为双蒸水。更优选的，上述猪传染性胃肠炎病毒检测试剂盒中，所述的10×gspfbuffer含有摩尔浓度为500mmtris-hcl(ph8.5,25℃)，300mmkcl，300mm(nh4)so4和1％tritonx-100。进一步的，上述猪传染性胃肠炎病毒检测试剂盒中，还包括阳性对照和阴性对照；所述阳性对照为含有猪传染性胃肠炎病毒n基因的dna片段，序列为seqidno.6所示，所述阴性对照为无菌双蒸水。本发明还提供了一种采用上述猪传染性胃肠炎病毒检测试剂盒检测病毒的方法，包括以下步骤：a、用rna提取试剂盒从待检测的标本中提取rna；b、将提取的rna与猪传染性胃肠炎病毒检测试剂盒混合，在58～65℃下扩增反应30～90分钟，15min后与对照对比判读结果。其中，上述采用猪传染性胃肠炎病毒检测试剂盒检测病毒的方法中，步骤a中所述的待检测的标本包括猪肠系膜淋巴结、空肠、小肠或肠内容物、粪便或肺中的一种。其中，上述采用猪传染性胃肠炎病毒检测试剂盒检测病毒的方法中，步骤b为在63℃下扩增反应60分钟。本发明的有益效果为：(1)相比传统生理生化检测方法，交叉引物核酸恒温扩增技术适用于直接从待检样品中扩增靶基因，只需要一次恒温扩增就能够检测猪传染性胃肠炎病毒是否存在，大大提高了效率节约了时间，扩增时间仅为常规rt-pcr的1/3～1/2；(2)扩增产物通过可视化核酸薄膜层析快速检测试纸条观察结果，相比传统的pcr扩增法，省去配胶、电泳、凝胶成像等繁琐的操作程序，且不接触有潜在致癌风险的核酸染料，同时，检测试纸条置于全封闭式靶核酸扩增物快速检测装置中，可有效避免气溶胶污染引起的假阳检测；(3)可同时满足高通量和低通量的样品检测；(4)本发明提供了一种对猪传染性胃肠炎病毒的实时快速检测和出入境检验检疫的新技术，对提高我国猪传染性胃肠炎病免疫防控水平、引种、常规监测、疾病净化、疾病检测等具有重要意义。附图说明图1所示为实施例5中tgev-pcr细胞毒rt-pcr扩增结果；图2所示为实施例5中tgev-pcr质粒rt-pcr扩增结果。具体实施方式本发明提供了一种猪传染性胃肠炎病毒检测试剂盒，包括：检测猪传染性胃肠炎病毒的正向外围引物f3、反向外围引物b3、交叉引物cpr、正向探针df5f和反向探针df5b。该试剂盒中，有两条外围引物、两条检测探针和一条交叉引物。本发明试剂盒中的5条寡核苷酸序列依靠gspf酶的高活性的链置换特性，使得链置换dna合成不断的自我扩增循环。本发明试剂盒的交叉引物恒温扩增反应有有3个阶段，首先，交叉引物位点的引入，然后在恒温下核酸片段的自我循环扩增，最后扩增产物的产生。由于两条探针分别标记有fam基团和biotin基团，特异性扩增产物同时带有生物素和fam标记，从而使得产物可在核酸试纸条中呈阳性而被检出。本发明中所述的交叉扩增引物是指用于交叉扩增的主要引物，其中5’端末端序列与fam标记探针序列相同。外围引物是指位于交叉扩增引物后方的短链引物，其作用是在链置换bstdna聚合酶或gspfdna聚合酶的作用下，将扩增产物的延伸链从模板上剥离。探针引物为检测引物，是指用生物素或半抗原fam标记的短链引物，其作用是使扩增产物带有标记，以用于检测。半抗原fam是指用于检测引物的化学物质，它们与相应的抗体特异性的结合，用于检测扩增产物。为了更充分地解释本发明的实施方法，提供了用于检测猪传染性胃肠炎病毒的cpa试剂盒的实施例。这些实施实例仅仅是解释，而不是限制本发明要求保护的范围。其中所用的原料均为普通市售。实施例1制备猪传染性胃肠炎病毒质粒dna包括下列步骤：(1)利用两条外围引物seqid.1和seqid.2进行pcr扩增获得目的基因；(2)对步骤(1)得到的pcr扩增产物进行纯化；(3)将步骤(2)得到的纯化后的扩增产物通过质粒转染及时和构建完整的含有目的基因seqidno.6所示的质粒序列；(4)将所抽提的质粒定量并稀释至106拷贝/μl，﹣20℃保存。其中，在步骤(2)中，采用takara的minibestagarosegeldna胶回收试剂盒对pcr扩增产物进行纯化；在步骤(3)中采用takara的pmdtm18-tvectorcloning质粒转染试剂盒。实施例2配制检测猪传染性胃肠炎病毒的试剂盒反应液包括以下步骤：(1)rna提取试剂：购自市场上的商品化柱式法totalrna小量提取试剂盒；(2)猪传染性胃肠炎病毒核酸恒温扩增反应液：正向外围引物f3(seqidno.1)0.2μmol，反向外围引物b3(seqidno.2)0.1μmol，正向探针df5f(seqidno.3)0.4μmol，正向探针df5f(seqidno.4的5’端连接标记基团fam基团)0.8μmol，交叉引物cpr(seqidno.5的5’端连接标记基团biotin基团)1μmol10×buffer，mgso42mmol，dntp溶液0.4mmol,betaine1mol,gspf酶10u、amv酶0.2u、25×rnasecure和无菌双蒸水组成，总反应液体积为16μl。(3)实施例1制备的猪传染性胃肠炎病毒质粒dna(seqidno.6)作为阳性对照，无菌双蒸水作为阴性对照。其中，所有引物和探针均交由有资质的基因公司合成；gspf酶和10×gspfbuffer：购自neb公司；amv：要求65℃有活性的逆转录酶；dntp、rnasecure和无菌双蒸水均为普通市售产品。实施例3用实施例2的试剂盒检测猪传染性胃肠炎病毒包括以下步骤：(1)用柱式法totalrna小量提取试剂盒从待检测的标本(肠系膜淋巴结、肠及内容物、粪便)中提取rna；(2)取标本rna作为模板加入到装有反应液的pcr管中，在63℃扩增反应60分钟，其中标本rna与复溶缓冲液的比例为1:4，标本添加量不低于4μl；对照pcr管中分别加入阳性对照模板和阴性对照模板；(3)将温浴后的pcr管放置到一次性核酸检测装置中进行检测，15分钟以后判读结果。当样本中含有猪传染性胃肠炎病毒核酸时，试纸条的检测线上呈红色条带；注意无论怎样，对照线都应为红色条带；(4)取另外两批次试剂盒重复实验2次，总共3次临床样本检测试验，结果如下表1所示。其中，“+++”表示强阳性，“+”表示阳性，“-”表示阴性。表1不同批号试剂盒检测结果由实施例3可看出：3个批次的试剂盒检测结果无显著差异，说明本发明试剂盒的不同批次间的检测结果具有可比性，具有良好的重复性。本发明的检测方法重复性好，且仅需要2小时就可完成，大大缩短检测时间，同时仅需一个人就可完成操作，节约人力和检测成本。实施例4本发明试剂盒检测猪传染性胃肠炎病毒的专一性按照实施例3的方法检测猪流行性腹泻病毒(pedv)、猪轮状病毒(rv)、猪瘟病毒(csfv)、高致病猪蓝耳病毒(hp-prrsv)、猪伪狂犬病毒(prv)、猪圆环病毒2型(pcv2)、阳性对照品，检测结果如下表2所示。其中，“+++”表示强阳性，“+”表示阳性，“-”表示阴性。表2本发明试剂盒检测不同病毒的结果由表2可知：本发明试剂盒检测猪传染性胃肠炎病毒核酸具有很强的专一性。实施例5采用本发明试剂盒检测和pcr测定方法的灵敏度对比包括以下步骤：(1)将致弱的tgev华毒株(hstrain)细胞毒用生理盐水依次作10倍梯度稀释，然后按照实施例3的方法提取核酸后扩增、检测，以确定本发明试剂盒用于检测猪传染性胃肠炎病毒核酸的灵敏度。扩增反应结束，取反应管于检测装置中，合上装置，静置15min观察结果，阳性结果显示为ct线处均为红色条带，阴性结果显示仅c线处为红色条带，用本发明试剂盒检测猪传染性胃肠炎病毒的最低可以检测到74tcid50/ml。将制备的tgev阳性对照质粒用用生理盐水依次作10倍梯度稀释，然后按照实施例3的方法对不同浓度质粒进行扩增、检测，以确定本发明试剂盒用于检测猪传染性胃肠炎病毒阳性质粒的检测限。扩增反应结束，取反应管于检测装置中，合上装置，静置15min观察结果，阳性结果显示为ct线处均为红色条带，阴性结果显示仅c线处为红色条带，用本发明试剂盒检测猪传染性胃肠炎病毒的最低可以检测到45copies/μl。(2)rt-pcr方法：扩增用引物：选用cpa扩增的正向外围引物f3和反向外围引物b3rt～pcr反应为20μl体系:扩增程序为：50℃30min扩增样本：为上述不同稀释度的致弱的tgev华毒株(hstrain)细胞毒核酸和不同浓度阳性质粒。rt-pcr产物取10μl于2％琼脂糖凝胶电泳，100v电压下40min，通过凝胶成像系统观察，rt-pcr方法最低可以检测到740tcid50/ml(图1)，450copies/μl(图2)。本发明方法与pcr方法的对比结果如下表3所示。其中，“+++”表示强阳性，“+”表示阳性，“-”表示阴性。表3采用不同方法检测结果从实施例5的结果可知：本发明的方法灵敏度明显高于rt-pcr方法的敏感度，能检测出猪传染性胃肠炎病毒含量更低的样品。实施例6试剂盒反应液浓度摸索实验包括以下步骤：(1)按照实施例2的方法配制猪传染性胃肠炎病毒核酸恒温扩增反应液，根据反应液中各成分的浓度不同分为a、b、c三组，每组反应液浓度如下表4所示。表4不同反应液浓度的试剂盒组a组b组c正向外围引物f30.2μmol0.3μmol0.1μmol反向外围引物b30.1μmol0.2μmol0.1μmol交叉引物cpr1μmol1μmol0.9μmol正向探针df5f0.4μmol0.4μmol0.3μmol反向探针df5b0.8μmol0.8μmol0.7μmolmgso42mmol3mmol1mmoldntp溶液0.4mmol0.5mmol0.3mmolbetaine1mol1mol0.9molgspf酶8u/μl10u10u9u10×gspfbuffer2μl2μl2μlamv0.2u0.2u0.1u25×rnasecure0.8μl0.8μl0.8μl无菌双蒸水补足到16μl补足到16μl补足到16μl(2)将致弱的tgev华毒株(hstrain)细胞毒用生理盐水依次作10倍梯度稀释，按照实施例3的方法提取核酸，分别用上述组a、组b、组c的体系扩增后检测，以确定本发明试剂盒中最优体系与次优体系检测检测猪传染性胃肠炎病毒核酸的灵敏度。扩增反应结束，取反应管于检测装置中，合上装置，静置15min观察结果，阳性结果显示为ct线处均为红色条带，阴性结果显示仅c线处为红色条带，详细结果见下表5。其中，其中，“+++”表示强阳性，“+”表示阳性，“+/-”表示弱阳性，“-”表示阴性。表5采用不同组成的试剂盒灵敏度分析从表5结果可见，组a体系(即本发明试剂盒最优体系)检测猪传染性胃肠炎病毒的最低可以检测到74tcid50/ml，组b和组c体系检测猪传染性胃肠炎病毒的最低可检测限较组a差，为740tcid50/ml。由上述试验可知，本发明提供了一种利用核酸恒温扩增检测猪传染性胃肠炎病毒的试剂盒，对不同的反应条件进行了优化，如引物和探针的浓度，mg2+浓度，反应温度等的优化，并将本发明与核酸检测试纸条检测系统相结合，建立了猪传染性胃肠炎病毒核酸恒温扩增定性检测的方法。该试剂盒的灵敏度可在每个反应体系中检测45copies/μl，可以满足快速检测猪传染性胃肠炎病毒的要求，具有重要的意义。sequencelisting<110>四川纳比生物科技有限公司;杭州优思达生物技术有限公司<120>猪传染性胃肠炎病毒检测试剂盒及检测方法<130>a170587<160>6<170>patentinversion3.5<210>1<211>19<212>dna<213>artificialsequence<220><223>正向外围引物f3的核苷酸序列<400>1caatgggagcagtgccaag19<210>2<211>22<212>dna<213>artificialsequence<220><223>反向外围引物b3的核苷酸序列<400>2taatctgctgaaggaattgttc22<210>3<211>41<212>dna<213>artificialsequence<220><223>交叉引物cpr的核苷酸序列<400>3attggctgaatgtgttcctggcaagtggtatttgtgtgtga41<210>4<211>18<212>dna<213>artificialsequence<220><223>正向探针df5f的核苷酸序列<400>4attggctgaatgtgttcc18<210>5<211>22<212>dna<213>artificialsequence<220><223>反向探针df5b的核苷酸序列<400>5tctgtgtctagcattttgtttg22<210>6<211>182<212>dna<213>artificialsequence<220><223>猪传染性胃肠炎病毒质粒dna的核苷酸序列<400>6caatgggagcagtgccaagcattacccacaattggctgaatgtgttccatctgtgtctag60cattttgtttggaagctattggacttcaaaggaagatggcgaccagatagaagtcacgtt120cacacacaaataccacttgccaaaggatgatcctaaaactgaacaattccttcagcagat180ta182当前第1页12