一种CD40单克隆抗体、其制备方法及其应用与流程

本发明属于免疫性领域，更具体地，本发明涉及一种cd40单克隆抗体、其制备方法及其应用。

背景技术：

中国是全球第二大医药消费市场，生物医药市场缺口极大，发展生物医药产业意义重大。加之老年化严重，老龄人口庞大，带来了国内医疗需求的快速增长。国家十三五规划把生物医药作为重点发展产业，大力发展多项生物相关前沿产业，促进整个产业接轨国际水平，提升中国生物医药产业整体水平和竞争力。单抗药作为生物制药的分支，在生物药物里比重超过30％，是生物制药中最大的子行业，一半以上的全球在研生物医药为抗体类药物，抗体药物在市场和研发上的增速领跑整个生物制药行业。抗体药具有靶向性高和纯度好等特点。目前在临床上单抗药已经用于治疗多种疾病。但是，单克隆抗体药物在前期开发是较为困难的，需要综合考虑多种多样的因素，往往需要大量的筛选工作；并且，一些单抗还存在着特异性、亲和力不够理想或存在副作用等等的问题，阻碍其临床应用。

cd40是肿瘤坏死因子受体(tnfrsf)超家族成员之一，表达于多种抗原呈递细胞(apcs)、成纤维细胞、内皮细胞以及肿瘤细胞表面。cd40与其配体cd40l是一对共刺激分子，参与机体体液免疫和细胞免疫等重要生理功能。cd40或cd40l功能缺陷均会导致机体的免疫缺陷，伴随着许多疾病的发生，如自身免疫病、移植排斥、动脉粥样硬化和肿瘤逃逸免疫监视等。cd40-cd40l信号通路已经是治疗相关疾病的一大靶点。

目前已有许多的cd40单克隆抗体药物被广泛地运用到临床实验中，应用于治疗肿瘤。并取得了很好的效果，但伴随一些并发症的发生，如血小板减少性紫斑症，血栓栓塞，导致实验终止。因此，寻找新的识别位点和对cd40单抗的改造已经成为研究的一种趋势。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种cd40单克隆抗体、其制备方法及其应用。

在本发明的第一方面，提供一种分离的单克隆抗体，所述单克隆抗体包含重链可变区和轻链可变区；其中，所述的重链可变区包括seqidno:3所示重链cdr1区、seqidno:4所示重链cdr2区和seqidno:5所示重链cdr3区；所述的轻链可变区包括seqidno:6所示轻链cdr1区、seqidno:7所示轻链cdr2区和seqidno:8所示轻链cdr3区。

在一个优选例中，所述的单克隆抗体的重链可变区和轻链可变区分别具有seqidno:1和seqidno:2所示的氨基酸序列。

在另一优选例中，所述的单克隆抗体是fab、f(ab”)、f(ab”)2、fv、dab、fd、互补决定区(cdr)片段、单链抗体(scfv)、二价单链抗体、单链噬菌体抗体、双特异双链抗体、三链抗体、四链抗体。

在另一优选例中，所述的单克隆抗体的重链恒定区可以是选自下组中重链类型之一的恒定区：iggl、igg2a、igg2b和igg3，和其轻链恒定区可以是选自下组轻链类型的恒定区之一：κ链和λ链。

在本发明的另一方面，提供编码所述的单克隆抗体的核酸分子。

在本发明的另一方面，提供所述的单克隆抗体在制备用于阻断cd40l-cd40相互作用的药物中的用途。

在一个优选例中，所述的阻断cd40l-cd40相互作用可以预防或治疗：b淋巴瘤，乳腺癌，结直肠癌。

在本发明的另一方面，提供所述的单克隆抗体在制备抑制tnf-α过度表达的药物中的用途。

在一个优选例中，所述的抑制tnf-α过度表达可以预防或治疗：b淋巴瘤，乳腺癌，结直肠癌。

在本发明的另一方面，提供所述的单克隆抗体在制备检测细胞膜表面cd40表达情况的试剂中的用途。

在本发明的另一方面，提供一种表达载体，所述表达载体中含有编码所述的单克隆抗体的dna。

在本发明的另一方面，提供一种宿主细胞，所述宿主细胞中含有所述的表达载体。

在本发明的另一方面，提供一种组合物，它含有有效量的所述的单克隆抗体，以及药学上可接受的载体。

在本发明的另一方面，提供一种用于阻断cd40l-cd40相互作用的药盒，所述的药盒中包括所述的单克隆抗体。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

图1、cd40单克隆抗体可以作为wb一抗，使用hrp-抗鼠-igg作为二抗检测cd40蛋白表达。

a.淋巴瘤细胞系bjab细胞总蛋白，大小在39kd处检测到目的蛋白；

b.酵母表达表达的cd40胞外段，大小29kd处检测到目的条带。g28-5作为阳性对照。

图2、不同单克隆细胞株培养上清按1:100稀释，以facs检测bjab细胞表面cd40的表达

图3、cd40单克隆抗体能上调tnf-α的表达a.培养上清的稀释倍数为1:10；b.稀释倍数为1:50；c.稀释倍数为1:250，刺激bjab诱导tnf-α表达。

图4、no.3单克隆抗体能够拮抗cd40l与cd40的相互作用，降低cd40下游基因tnf-α的表达。

a.培养上清的稀释倍数为1:10；

b.培养上清的稀释倍数为1:5。

以上统计，采用双尾t检验(*，p<0.05；**，p<0.01)。

图5、cd40mab能够促进小鼠脾脏细胞的体外增殖铺2×10⁵(200μl/孔)个小鼠脾脏细胞到96孔板内，加入1∶10稀释的单抗刺激，48h后显微镜下观察，用鼠cd40激动剂(1μg/ml)作为阳性对照。

图6、体外cd40单抗能激活小鼠脾脏nf-κb下游基因。取1×10⁶小鼠脾脏细胞于24孔板内，刺激一定时间，收集其mrna，rt-pcr检测相关基因的表达。

a.anti-cd40(1μg/ml)不同时间点刺激下相关基因表达情况；

b&c.按1∶10加入cd40单抗隆抗体体外刺激3h，检测c-myc和bcl-xl的表达情况。以上统计采用双尾t检验(*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001)。

图7、cd40能上调小鼠脾脏b细胞cd86的表达。取8周大wt小鼠脾脏，裂解红细胞后，铺2×10⁵个细胞于96圆底板内，加入按1∶10稀释cd40单抗隆抗体，阳性对照加入鼠cd40激动剂(1μg/ml)，培养48h收集细胞，facs检测。

具体实施方式

本发明人经过深入的研究，找到了特异性针对cd40与cd40l相互作用的结合域的单克隆抗体，其是一株抑制型的单克隆抗体，能够有效地拮抗人cd40-cd40l的相互作用，从而阻断cd40l的激活功能。

本领域技术人员均了解，一种抗原可能含有多个抗原表位(抗原决定簇)，因此，针对同一个抗原可以获得不止一个抗体(包括单克隆抗体或多克隆抗体)，这些抗体对抗原的结合特性(如特异性等)均可能是不同的。因此，本领域技术人员在研究中往往难以找到特别理想的，阻断效果明显的单克隆抗体。针对同一个抗原，是否能够找到适合于特异性和敏感性结合的抗体，并不确定，也往往需要经历大量的筛选工作。由于cd40是一条具有较长的氨基酸序列的蛋白，具有较多的抗原决定簇，因此找到适合的抗体难度较高。

针对上述技术难题，本发明人制备了多种对应于cd40的单克隆抗体和多克隆抗体，通过大量的试验，检测不同种单克隆抗体或多克隆抗体对于cd40的结合特异性以及检测特性，最终找到了本发明的特异性针对cd40与cd40l相互作用的结合域的单克隆抗体。

本发明表达了经过改造的cd40胞外段蛋白，通过免疫制备多株cd40单克隆抗体。本发明人在筛选过程中，获得多株cd40抗体可以作为一抗用于westernblot检测cd40的表达。其中，9株cd40抗体可作为一抗用于流式细胞术检测cd40表达；8株cd40抗体能结合人cd40分子，激活人cd40信号，其中有3株同时能结合cd40分子，激活小鼠cd40信号；有7株能上调脾脏细胞c-myc和bcl-xl的表达，促进小鼠脾脏细胞的增殖；但仅有1株cd40抗体能阻断cd40l和cd40作用。

cd40单克隆抗体

本发明提供了能特异性结合cd40的单抗，本发明的单抗可以是完整的免疫球蛋白分子，也可以是抗原结合片段，包括但不限于fab片段，fd片段，fv片段，f(ab’)2片段、互补决定区(cdr)片段、单链抗体(scfv)、结构域抗体，二价单链抗体、单链噬菌体抗体、双特异双链抗体、三链抗体、四链抗体等。

cdr区是免疫学感兴趣的蛋白质的序列。在本发明的实施方案中，单抗可包含本文揭示的二、三、四、五或者所有六个cdr区。优选地，本发明的单抗包含本文揭示的至少两个cdr。

本发明的另一方面包括所述单抗的功能变体。如果变体能与亲代单抗竞争特异性结合cd40，则认为该变体分子是本发明单抗的功能变体。换句话说，所述功能变体仍能结合cd40或其片段。功能变体包括但不限于一级结构序列基本相似、但是含有例如在亲代单抗中未发现的体外或体内化学和/或生物化学修饰的衍生物。这种修饰包括乙酞化、酞化、核苷酸或者核苷酸衍生物的共价附着、脂质或者脂质衍生物的共价附着、交联、二硫键形成、糖基化、羟基化、甲基化、氧化、聚乙二醇化、蛋白酶解加工、磷酸化等。换句话说，亲代单抗的氨基酸和/或核苷酸序列中的修饰不显著影响或改变由所述核苷酸序列编码的或者含有所述氨基酸序列的所述单抗的结合特性，即所述单抗仍能识别并结合其靶位。

所述功能变体可以具有保守序列修饰，包括核苷酸和氨基酸取代、添加和缺失。这些修饰可以通过本领域己知的标准技术导入，例如定向诱变和随机pcr介导的诱变，并且可包含天然以及非天然核苷酸和氨基酸。

保守氨基酸取代包括其中氨基酸残基由具有相似结构或者化学性质的另一氨基酸残基置换的取代。具有相似侧链的氨基酸残基的家族己经在本领域中限定。这些家族包括具有碱性侧链的氨基酸(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链氨基酸(例如天冬氨酸、谷氨酸)、无电荷极性侧链氨基酸(例如天冬酞胺、谷氨酞胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、非极性侧链氨基酸(例如甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、分支侧链氨基酸(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)以及芳香侧链氨基酸(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸)。本领域技术人员明白也可以使用除了上述家族之外的其它氨基酸残基家族分类方式。另外，变体可具有非保守的氨基酸取代，例如氨基酸由具有不同结构或者化学性质的另一氨基酸残基置换。相似的小变异也可包括氨基酸缺失或者插入，或者这二者。使用本领域熟知的计算机程序可以发现确定哪些氨基酸残基可以被取代、插入或者缺失而不消除免疫学活性的指导。

功能变体可包含氨基酸序列在氨基末端或者羧基末端或者这两端的截短体。本发明的功能变体与亲代单抗相比可具有相同或不同的、更高或更低的结合亲和性，但是仍能结合cd40或其片段。例如，本发明的功能变体与亲代单抗相比对于cd40或其片段可具有增加或降低(优选增加)的结合亲和性。优选地，可变区包括但不限于构架区、高变区或cdr区的氨基酸序列被修饰。通常，轻链和重链可变区包含三个高变区，包括三个cdr，以及更保守的区域，即所谓的构架区((fr)。高变区包含来自cdr的氨基酸残基和来自高变环的氨基酸残基。在本发明范围内的功能变体与本文所述亲代单抗具有至少大约50％至大约99％、优选至少大约60％至大约99％、更优选至少大约70％至大约99％、甚至更优选至少大约80％至大约99％、最优选至少大约90％至大约99％、特别是至少大约95％至大约99％，以及特别是至少大约97％至大约99％的氨基酸序列同源性。本领域技术人员已知的计算机算法如gap或者bestfit可用于最佳地排列氨基酸序列以进行对比以及明确相似或相同的氨基酸残基。功能变体可以通过使用本领域己知的普通分子生物学方法改变亲代单抗或其一部分而获得，所述方法包括但不限于易错pcr、寡核苷酸指导的诱变、定点诱变以及重链和/或轻链改组法。

抗体的抗原结合特性可由位于重链和轻链可变区的3个特定的区域来描述，称为互补决定区(cdr)，所述的cdr区将可变区间隔成4个框架区域(fr)，4个fr的氨基酸序列相对比较保守，不直接参与结合反应。这些cdr形成环状结构，通过其间的fr形成的β折叠在空间结构上相互靠近，重链上的cdr和相应轻链上的cdr构成了抗体的抗原结合位点。本发明的抗cd40单克隆抗体的cdr区是全新的，不同于现有的抗cd40抗体。

本发明另一方面提供了编码本发明的至少一种单抗、其功能变体或者免疫缀合物的核酸分子。这种核酸分子可以用作中间物以进行克隆，例如用于如上述的亲和力成熟方法中。在一个优选的实施方案中，所述核酸分子是分离或纯化的。dna分子的序列可以用常规技术，或利用杂交瘤技术获得。

一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。

此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。

目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明的单抗(或其片段，或其衍生物)的dna序列。然后可将该dna序列引入本领域中已知的各种现有的dna分子(或如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明的单抗的序列中。

本发明还涉及包含上述的适当dna序列以及适当启动子或者控制序列的载体。这些载体可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。

宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有：细菌细胞如大肠杆菌，链霉菌属；鼠伤寒沙门氏菌；真菌细胞如酵母；植物细胞；昆虫细胞如果蝇s2或sf9；动物细胞如cho、cos7、nso或bowes黑素瘤细胞等。特别适用于本发明的宿主细胞是真核宿主细胞，尤其是哺乳动物细胞，如cho细胞、293细胞。

如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的单抗。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超声处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(hplc)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。

药物组合物

本发明的单抗可用于制备诊断、治疗和/或预防cd40l-cd40过度相互作用相关疾病的药物组合物。

所述的“cd40l-cd40过度相互作用相关疾病”包括如下的病症：b淋巴瘤，乳腺癌，结直肠癌等。本发明所述cd40单抗还可在检测和定量cd40中发挥作用，以用于各种诊断目的。由于cd40l-cd40相互作用的紊乱导致的疾病是本领域已知的，因此可以预期到本发明的能够阻断cd40l-cd40相互作用的单抗对于cd40l-cd40相互作用紊乱相关的疾病具有治疗作用。

基于本发明的新发现，还提供了一种治疗和/或预防cd40l-cd40过度相互作用相关疾病的药物组合物，其包含：有效量的本发明所述的单抗；以及药学上可接受的载体。

本文所用的术语“药学上可接受的”是指当分子本体和组合物适当地给予动物或人时，它们不会产生不利的、过敏的或其它不良反应。本文所用的“药学上可接受的载体”应当与本发明的单抗相容，即能与其共混而不会在通常情况下大幅度降低组合物的效果。

可作为药学上可接受的载体或其组分的一些物质的具体例子是糖类，如乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉，如玉米淀粉和土豆淀粉；纤维素及其衍生物，如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和甲基纤维素；西黄蓍胶粉末；麦芽；明胶；滑石；固体润滑剂，如硬脂酸和硬脂酸镁；硫酸钙；植物油，如花生油、棉籽油、芝麻油、橄榄油、玉米油和可可油；多元醇，如丙二醇、甘油、山梨糖醇、甘露糖醇和聚乙二醇；海藻酸；乳化剂，如润湿剂，如月桂基硫酸钠；着色剂；调味剂；压片剂、稳定剂；抗氧化剂；防腐剂；无热原水；等渗盐溶液；和磷酸盐缓冲液等。

本发明的药物组合物可根据需要制成各种剂型，并可由医师根据患者种类、年龄、体重和大致疾病状况、给药方式等因素确定对病人有益的剂量进行施用。给药方式例如可以采用注射或其它治疗方式。

本发明的单抗可以以未分离的或者分离的形式使用。此外，本发明的单抗可以单独应用或者于包含至少一种本发明的单抗(或其变体或片段)的混合物中应用。换句话说，所述单抗可以组合应用，例如作为包含两或更多种本发明的单抗、其变体或片段的药物组合物。例如，具有不同但互补活性的单抗可以组合在一个治疗方案中以达到希望的预防、治疗或诊断作用，但是或者也可以将具有相同活性的单抗组合在一个治疗方案中以达到希望的预防、治疗或诊断作用。

本发明的单抗或药物组合在用于人体之前可以在合适的动物模型系统中检测。这种动物模型系统包括但不限于小鼠、猴。

本发明的单抗的合适的剂量范围可例如是0.001-100mg/kg体重，优选0.01-15mg/kg体重。此外，例如可以给予一次推注、随时间给予多次分开剂量或者根据治疗情况的紧急性而可以按比例降低或增加剂量。本发明的分子和组合物优选是无菌的。使得这些分子和组合物无菌的方法为本领域所熟知。用于诊断、预防和/或治疗的其它分子可以以与本发明的单抗相似的给药方案给予。如果单独给予其它分子，则可以在给予本发明的一或多种单抗或药物组合物之前、同时或者之后给予患者。对于人患者的精确给药方案通常在临床实验期间挑选出。

本发明所述的单抗可被置于适当的包装中，制成药盒，以便于临床医师使用。较佳地，所述的药盒中也可包含说明如何给药的使用说明书。

免疫缀合物

另一方面，本发明包括免疫缀合物，即包含本文所述至少一个单抗以及进一步包含至少一个功能性分子(如可检测的部分/物质的分子)。所述抗体与所述功能性分子可以通过共价连接、偶联、附着、交联等方式构成辍合物。本发明的免疫缀合物可包含一个以上的标记。所述标记也可以通过共价键与本发明的单抗直接结合/缀合。或者，所述标记可以通过一或多种连接化合物与所述单抗结合/缀合。标记与单抗的缀合技术为本领域技术人员所熟知。本发明的免疫缀合物的标记也可以是治疗剂。

所述免疫缀合物可包含：本发明的抗体以及可检测标记物。所述的可检测标记物包括但不限于：荧光标记物、显色标记物；如：酶、辅基、荧光材料、发光材料，生物发光材料、放射性材料、正电子发射金属以及非放射性顺磁性金属离子。也可包含一个以上的标记物。为了检测和/或分析和/或诊断目的用于标记抗体的标记依赖于使用的特定检测/分析/诊断技术和/或方法例如免疫组织化学染色(组织)样品、流式细胞计量术等。对于本领域已知的检测/分析/诊断技术和/或方法合适的标记为本领域技术人员所熟知。

此外，本发明的人单抗或者免疫缀合物也可以附着于固体支持物上，其特别用于cd40蛋白或其片段的体外免疫测定或者纯化。这种固体支持物可以是多孔或者无孔的、平面或非平面的。本发明的单抗可以与标记序列融合以便于纯化。所述标记序列的例子包括但不限于六组氨酸标记、血凝素(ha)标记、myc标记或者flag标记。或者，一种抗体可以与另一种抗体缀合形成抗体异源缀合物(heteroconjugate)。

检测试剂和试剂盒

以本发明所述的单抗为基础，可制备方便、快速且准确地检测待测样品中cd40水平的试剂或试剂盒。

如本文所用，术语“待测样品”涵盖了多种样品类型，包括生物学来源的血液及其它体液样品，实体组织样品如活检组织样品或者组织培养物，或者衍生自其中的细胞或者其后代。该术语还包括在获得后已经通过任何方式处理的样品，例如用试剂处理、溶解、或者富集某些成分如蛋白质或者多核苷酸。

因此，本发明提供了一种用于检测待测样品中cd40水平的检测试剂盒，该试剂盒中含有本发明的cd40单抗，或cd40单抗与可检测标记物构成的免疫缀合物。

在获得了本发明提供的cd40单抗后，可以方便地制备出用于特异性检测cd40水平的检测试剂盒。

为了在检测时更方便，所述试剂盒中除了含有本发明的单抗或含有cd40单抗与可检测标记物构成的免疫缀合物以外，还可以包含其它检测试剂或辅助试剂，所述的辅助试剂例如是elisa试剂盒中常规使用的一些试剂，这些试剂的特性以及它们的配制方法均是本领域技术人员所熟知的，如显色剂、标记物、二抗、抗抗体、增敏剂等。本领域人员应理解，各种变化形式的检测试剂盒均是包含在本发明中的，只要在其中利用了本发明的单抗作为识别cd40的试剂。

此外，在所述试剂盒中还可包含使用说明书，用于说明其中装载的试剂的使用方法。

在获得了本发明提供的单抗和/或试剂盒后，可以利用多种免疫学相关方法来检测样品中cd40或其含量，从而得知待测样品的供体是否存在cd40l-cd40过度相互作用。

结论

靶向cd40-cd40l信号通路具有很重要临床意义。目前在移植排斥、自身免疫病和肿瘤中出现许多抗体药物，很多进入临床试验，抗体人源化和寻找新识别位点是当前研究的一大热点。开发cd40抗体不仅可用于研究cd40信号的功能，也能用于cd40的检测，更重要的可以进行人源化，开发治疗性抗体，用于重要的应用价值。

本发明人表达cd40胞外段蛋白，经免疫融合和筛选获得14株产生cd40抗体的杂交瘤细胞，及其培养上清，通过wb、facs和细胞功能实验，验证这些杂交瘤细胞培养上清是否具有相关生物学特性和功能，本发明人发现这些细胞株均可以作为wb的一抗；同时本发明人还发现no.2、no.3、no.5、no.7、no.9、no.11、no.12、no.13和no.14杂交瘤细胞培养上清可以作为细胞表面cd40蛋白的的流式细胞术检测的一抗。除此之外，本发明人还通过细胞实验筛选激动型或者拮抗型的cd40单克隆抗细胞株，本发明人发现no.2、no.5、no.7、no.9、no.11、no.12、no.13和no.14能够激活cd40下游tnf-α的表达，而no.3能够拮抗人cd40-cd40l的相互作用，从而阻断cd40l的激活功能，是一株抑制型的单抗。最后还发现no.2、no.5和no.14能够很好的促进小鼠脾脏细胞的增殖，提示其可以结合鼠cd40分子，从而激活鼠cd40信号。

本发明人的研究从单抗的生化特性延伸到功能方面，筛选验证得到可以作为wb和facs的一抗的单克隆细胞株，通过体外功能试验筛选具有活性的cd40单抗，后期需要对cd40单抗进行纯化，得到cd40的亲和常数并进行体内试验，为后面的临床试验打下前期基础。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如j.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

1、材料和方法

1.1材料

本发明人选择了cd40胞外段蛋白的特定区段，并进行了有利于表达以及抗原免疫的序列改造。将所述序列表达后用于抗原免疫，改造后的cd40胞外段蛋白的具体编码序列如下：

cgcctcgagaaaagagagccacccacagcttgcagagagaaacaatatctgattaactcccagtgttgctctctgtgccaaccaggtcagaaattggtgtctgattgcactgaatttaccgagacagaatgccttccatgcggcgaatcagaattccttgatacctggaatcgtgaaactcactgtcatcaacataagtactgtgatcctaacttaggattgagggtacagcaaaagggaacttccgaaaccgacacaatctgtacttgtgaggagggttggcattgtacttcagaagcttgtgaaagttgtgtcttgcacagatcctgttcccctggttttggtgtcaagcaaattgcaacgggtgtctctgatactatatgtgaaccttgccccgttggctttttctctaacgttagttctgccttcgagaagtgtcacccatggacttcatgtgagacgaaagatttagttgttcagcaagctggaaccaataaaacagacgtggtttgtggacctcaagacagactacgataagcggccgcattattaa

cd40激动剂抗体g28-5杂交瘤细胞：购自atcc；

g28-5抗体：商购，由cd40激动剂抗体g28-5杂交瘤细胞产生；

bjab细胞：购自atcc。

1.2方法

1.2.1细胞总mrna的抽提

将培养的细胞收集到1.5毫升离心管内，4℃800g离心3分钟，pbs洗一次，加入1毫升trizol重悬细胞，室温裂解5分钟；加入200微升的三氯甲烷，剧烈震荡15秒，室温放置10分钟，4℃12000rpm离心15分钟；将上层水相约500毫升转移到无rna酶的离心管内，加入等体积的异丙醇，上下颠倒7-8次混匀。4℃12000rpm离心10分钟；弃上清，加入1毫升的70％的depc乙醇，振荡让沉淀浮起，4℃7500rpm离心5分钟；弃上清，通风橱内干燥15分钟。加入适量的depc水溶解rna，混匀，测浓度后-80℃保存备用。

1.2.2rt-pcr

使用takarart试剂盒，将反转的cdna使用takarasybr试剂盒进行实时定量pcr检测各个基因的表达情况。

humanactin引物序列：

前引物：ctggaacggtgaaggtgaca；

后引物：aagggacttcctgtaacaatgca；

humantnf-alpha引物序列：

前引物：cagagggaagagttccccag；

后引物：ccttggtctggtaggagacg。

1.2.3细胞的流式染色技术

收集细胞，pbs洗一次，按1×10⁶细胞每个样品，抗体按一定比例稀释，每个样品用100微升抗体稀释液(2％小牛血清)重悬，室温避光染色15分钟，300g离心3分钟，pbs洗一遍，300微升抗体稀释液(2％小牛血清)重悬，上机检测。

1.2.4蛋白westernblot技术

将蛋白按每孔1～2微克的蛋白上样sds-page胶，加入电极缓冲液，80v电泳一段时间，当蛋白marker条带出来时，将电压调为120v恒压电泳值溴酚蓝刚好快离开page胶；跑完胶后，将上层浓缩胶切除，将sds-page胶转印到转膜装置内；冰上，100伏电压，电流小于400毫安，转膜1小时；将转好的硝酸纤维膜先用tbst洗一次，加入一定量的10％脱脂牛奶-tbst封闭1小时；tbst洗三次，每次5分钟，沿着蛋白marker剪下目的条带，加入对应的蛋白抗体，4℃摇床孵育过夜；回收一抗，tbst洗三次，加入对应的二抗室温孵育1小时，暗室冲片显影。

1.2.5脾脏细胞的体外培养

在超净工作台内将小鼠引颈处死，取下脾脏放置于5毫升的无菌的pbs的培养皿中；用灭菌好的玻片将其研磨成单细胞，吸取4毫升匀浆液400g离心3分钟，弃上清加入5毫升的红细胞裂解液(ack)冰上裂解3分钟；离心弃上清，细胞过40微米的细胞筛，显微镜下计数，按2×10⁵(200微升)个每孔铺于96圆底孔内；加不同杂交瘤细胞的培养上清液，以培养液做1:10稀释，96孔板置于37℃细胞培养箱培养72小时；显微镜下观察细胞的生长情况。

1.2.6cd40单克隆抗体的制备

腹腔注射的将本发明人制备的cd40胞外段蛋白(约150微克/只)腹腔注射入6-8周大的体内(第一次免疫)；2周后进行第二次免疫；3周后进行第三次免疫；5周后进行第四次免疫；8周进行第五次免疫。9周后在无菌条件下得到脾脏细胞。之后在无菌条件下将脾脏细胞和骨髓瘤细胞进行融合得到融合细胞。针对获得的大量融合细胞，本发明人进行了反复筛选和验证，进一步筛选获得14株细胞株，本发明人将它们编号为no.1、no.2、no.3、no.4、no.5、no.6、no.7、no.8、no.9、no.10、no.11、no.12、no.13和no.14，在培养到对数生长期时冻存于液氮中备用。

单克隆制备：首先将液体石蜡或者降植烷预处理6～8周大balb/c雌性小鼠。同时大量培养上述得到的细胞株。1～2周后小鼠体内接种杂交瘤细胞(1～2×10⁷/只)。杂交瘤细胞在小鼠腹腔内增殖，并产生和分泌单克隆抗体。约1～2周可见小鼠腹部膨大。用注射器抽取腹水，即可获得大量单克隆抗体。

1.2.6单克隆抗体no.3序列

对于抗体no.3，本发明人通过ta克隆的方法，对该抗体进行了测序，其重链和轻链的序列如下：

3#重链：

evqlqqsgpelvkpgasvkivckasgytftdynmdwvkqshgkslewigdinpknggiiynqkfkgkatltvdkssstaymelrsltsedtavyycvrrfaywgqgttvtvss(seqidno:1)；

其中，

cdr1：gytftdyn(seqidno:3)；

cdr2：igdinpkngg(seqidno:4)；

cdr3：vrrf(seqidno:5)。

3#轻链：

dieltqspttmaaspgekititcsasssissnylhwyqqkpgfspklliyrtsnlaygvparfsgsgsgtsysltigtmeaedvatyycqqgssipytfgggtkleikr(seqidno:2)；

其中，

cdr1：ssissnyl(seqidno:6)；

cdr2：liyrtsn(seqidno:7)；

cdr3：qqgssip(seqidno:8)。

实施例1、蛋白印迹法(westernblot)中作为一抗的鉴定

为了探究单克隆抗体与cd40结合的亲和力和反应性，本发明人通过westernblot实验检测cd40单克隆抗体是否可以作为westernblot一抗cd40蛋白的表达。

结果如图1，结果表明，各个单克隆细胞株培养上清均可以用作westernblot一抗，其中no.4、no.6、no.8、no.10、no.11、no.12、no.13的检测信号强，但是否属于高特异性的单克隆抗体，还需要进一步研究。

实施例2、流式细胞术检测细胞膜表面cd40表达的鉴定

本实施例中，探究cd40单抗隆抗体是否能结合细胞膜表面的cd40，本发明人将cd40单克隆细胞培养上清用作一抗，用荧光标记的二抗，使用流式细胞术检测细胞膜表面的cd40的表达。

本发明人发现，no.2、no.3、no.5、no.7、no.9、no.11、no.12、no.13和no.14克隆产生的一抗，用作facs检测细胞表面的cd40表达(图2)。

实施例3、对于cd40介导的下游信号诱导tnf-α表达的情况

cd40激动性抗体能够和细胞膜表面的cd40分子结合，激活cd40下游的mapk、pi3k、nf-κb等信号通路。在bjab细胞系中g28-5能够激活非经典nf-κb信号通路。

为了探究本发明人生产的单克隆抗体是否也具有类似于g28-5的激活效果，本发明人将生长在24孔板的bjab细胞加入一定比例的杂交瘤细胞的培养上清，刺激0.5小时后，收集细胞的mrna，实时定量pcr检测下游基因tnf-α的表达情况，以g28-5为阳性对照。

结果显示，在单克隆细胞培养上清按1:10稀释条件下，no.2、no.5、no.7、no.9、no.11、no.12、no.13和no.14都表现出良好的激活效果(图3a)；在1:50稀释条件下no.5、no.11和no.13都具有很好的激活效果(图3b)；同样本发明人加大稀释倍数，按1:250稀释下no.13和no.14也表现出很好的效果(图3c)。

实施例4、cd40单抗体外能够促进鼠脾脏细胞增殖

激活cd40信号通路可刺激脾脏细胞的增殖。由于人鼠cd40蛋白的高度同源性，本发明人想知道这些单抗是否也能通过结合鼠cd40，从而刺激鼠cd40信号，进而刺激鼠脾脏细胞的增殖。本发明人收集8周大的c57/wt雄鼠脾脏细胞，去除红细胞后加入杂交瘤培养上清体外刺激48h，观察脾脏细胞的增殖情况。

结果显示，加入no.2、no.3、no.4、no.5、no.7、no.13和no.14单克隆培养上清刺激后，小鼠脾脏细胞的增殖明显增加，提示这些单克隆抗体可能也识别小鼠cd40，激活小鼠cd40信号(图5)。

实施例5、cd40单抗能激活小鼠脾脏nf-κb通路下游基因表达

cd40主要表达于b细胞表面，对b细胞的分化和激活起到重要的调控作用。激活状态下，cd40可以招募脚手架蛋白(如traf，tnf受体相关因子)与其胞内结构域结合，激活nf-kb信号通路。cd40及其配体cd40l相互作用，提供了共刺激信号，诱导t细胞依赖性的b细胞增殖和分化。

为了验证本发明的cd40单抗是否也具有类似的功能，本发明人首先使用抗鼠cd40激动剂体外刺激小鼠脾脏细胞，检测tnf和nf-κb通路下游基因的表达情况，发现nf-κb信号下游相关基因c-myc和bcl-xl的表达分别在刺激1h和3h达到最大，随后开始下调，而tnf-α和bcl-3却没有如此明显的变化(图6a)。

根据以上结果，本发明人选取c-myc和bcl-xl2个基因验证cd40单克隆抗体的激活情况，发现小鼠脾脏细胞体外刺激3h下，no.2、no.3、no.4、no.5、no.7、no.9、no.11、no.12、no.13和no.14能上调c-myc和bcl-xl的表达(图6b，图6c)。

实施例6、cd40单抗上调脾脏b细胞cd86的表达

b7分子(cd80/cd86)以单体形式存在apc细胞表面，其能与t细胞表面的cd28或ctla-4结合，提供共刺激信号，促进t细胞活化和存活。静息状态的apc细胞表面几乎不表达b7分子，当apc细胞活化后，其表面的b7分子表达上调。b细胞在炎性刺激激活24h后，cd86的表达到达顶峰并维持到48h，随后开始下降。

为了探究本发明的cd40单克隆抗体是否也能增加b细胞表面b7分子的表达，本发明人通过体外培养小鼠脾脏细胞，加入cd40单抗刺激48h后，facs检测b细胞表面共刺激分子cd86的表达。

本发明人发现，no.2、no.3、no.4、no.5、no.7、no.13和no.14单克隆抗体能上调cd86的表达，证明cd40单抗能活化b细胞，促进脾脏细胞增殖(图6，7)。

实施例7、cd40单抗可拮抗cd40l的功能

cd40的自然配体是cd40l(cd154)，二者是一对共刺激分子。当cd40l细胞表面cd40结合后，相关信号通路开始激活。

为了探究本发明人表达的cd40单抗是否能够拮抗cd40l和cd40结合的功能，本发明人在cd40l刺激bjab细胞的同时加入一定比例的单抗，收集细胞mrna，检测相关基因的表达情况。

结果显示，抗体no.3能够很好地抑制cd40l的诱导的tnf-α的表达，并且显示该克隆抗体能阻断cd40l-cd40相互作用，因此其是一株具有拮抗功能的cd40单抗(图4a，图4b)，能够通过阻断cd40l-cd40相互作用发挥抑制肿瘤如b淋巴瘤，乳腺癌，结直肠癌的作用。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110>中国科学院上海生命科学研究院

<120>一种cd40单克隆抗体、其制备方法及其应用

<130>173445

<160>13

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>113

<212>prt

<213>小鼠

<400>1

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151015

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202530

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354045

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505560

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<210>2

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<213>小鼠

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<213>小鼠

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15

<210>4

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<213>小鼠

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<210>6

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<213>小鼠

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15

<210>7

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<400>7

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15

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<213>小鼠

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15

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<211>20

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<213>引物

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<210>10

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<213>引物

<400>10

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<213>引物

<400>12

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<210>13

<211>553

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>改造后的cd40胞外段蛋白的具体编码序列

<400>13

cgcctcgagaaaagagagccacccacagcttgcagagagaaacaatatctgattaactcc60

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