本发明涉及微生物领域，具体涉及一种黑曲霉及其在辣木叶发酵中的应用。
背景技术：
辣木是一种富营养植物，辣木叶中钙的含量是牛奶的26倍、铁的含量是菠菜的4倍、钾的含量是香蕉的10倍，锌的质量分数为6.99％、蛋白质为27％、总氨酸为19.8％、总糖为33.6％；辣木种子中蛋白质的质量分数为38％、粗纤维为73％，基本满足动物对各种营养素的需要,是一种新型优良的动物饲料资源。
但实际生产中，由于辣木叶饲料风味差，日粮中辣木叶的添加量一般不超过10％，替代鱼粉等高价原料从而降低成本的作用十分有限。要提高辣木叶替代日粮中高价原料的作用，需要通过发酵来改善辣木叶的风味，提高其饲喂品质。cn104982521a公开了植物乳杆菌亚种和干酪乳杆菌l在辣木叶发酵中的应用，但关于黑曲霉在辣木叶发酵中的应用未见报道。
技术实现要素：
发明目的：为了克服现有技术的缺陷，本发明提供了一种黑曲霉，并提供了黑曲霉在辣木叶发酵中的应用。通过本发明黑曲霉菌株发酵后，辣木叶的风味得到明显改善，营养价值提高，同时还增加了益生菌和消化酶，使辣木的饲喂品质提高。
技术方案：
一种黑曲霉，其分类命名为黑曲霉(aspergillusniger)，菌株号为lm_2017，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏时间为2017年7月18日，保藏编号为cctccno:m2017428，保藏地址为中国.武汉.武汉大学，邮编430072。该菌株是发明人于2017年3月从云南省保山市辣木叶中筛选获得的。
cctccno:m2017428的主要生物学特征：培养24～48小时呈白色绒状菌丝，此后菌丝色泽变深，60小时后产生黑色的分生孢子。分生孢子头的顶囊球形或近球形，黑色，双层小梗且长短不一，呈放射状排列。
cctccno:m2017428的18sdna基因序列，见seqidno.1所示。
将cctccno:m2017428的18sdna测序结果在ncbi进行blast比对，结果表明，cctccno:m20174281669bp核苷酸片段与genbank中已知黑曲霉对应核苷酸片段同源性高达100％。综合通过以上结果分析，该分离的菌株为黑曲霉(aspergillusniger)。
cctccno:m2017428在辣木叶发酵中的应用。
辣木叶发酵步骤如下：将黑曲霉接种于活化培养基中进行活化，然后将活化的黑曲霉转入发酵培养基进行发酵。
所述活化培养基为虎红琼脂培养基；所述活化温度为25～31℃，活化时间为5～6天。
所述发酵培养基包括辣木叶和水。
所述辣木叶为辣木叶粉末，粒径为20～40目。
所述发酵培养基的含水量为50～70wt.％。
所述活化的黑曲霉的接种量为辣木叶质量的0.03～0.05％。
所述发酵为固态发酵，发酵培养基厚度为5～8cm。
所述发酵温度为25～31℃，发酵时间为36～72h。
有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下优势：通过利用菌株cctccno:m2017428对辣木叶进行发酵，辣木叶的风味得到明显改善；且每克干料中黑曲霉益生菌8×108cfu/g以上，含有多种消化酶，营养价值提高；较未发酵辣木叶，蛋白质含量增加5～7％，游离氨基酸提高23.5～25.9％，总氨基酸生物效价更好，使辣木的饲喂品质提高。
附图说明
图1为辣木叶发酵前色谱图；
图2为辣木叶发酵后色谱图。
具体实施方式
根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂家建议的条件。
实施例1
1、原始菌株的获得
取辣木叶10g，加100ml无菌水，无菌室中室温搅拌20min，静置10min，取上清液用无菌水稀释。稀释液涂布于虎红琼脂平板培养基上，28℃±0.5℃培养5～10天。挑选产生黑曲霉孢子继续划线培养，直至获得单菌落。获得5株纯培养的黑曲霉，分别命名为lm_2017、1m_02、1m_03、1m_04、1m_05。培养24～48小时呈白色绒状菌丝，此后菌丝色泽变深，60小时后产生黑色的分生孢子。分生孢子头的顶囊球形或近球形，黑色，双层小梗且长短不一，呈放射状排列。
2、真菌18sdna序列
为了进一步鉴定该菌株，本发明对菌株lm_2017做了18sdna基因片段序列测定，序列长度1669bp，序列测定结果如seqidno.1所示：
将菌株lm_201718sdna上述测序结果在ncbi进行blast比对，结果表明，菌株lm_20171669bp核苷酸片段与genbank中已知黑曲霉对应核苷酸片段同源性高达100％。综合通过以上结果分析，该分离的菌株为黑曲霉(aspergillusniger))。
实施例2
配制活化培养基，将8.7g虎红琼脂培养基粉末溶解至250ml水中，121℃灭菌30min，制作平板培养基。将asp.nigerlm_2017、1m_02、1m_03、1m_04、1m_05、t8、t10、a、b、c分别接种于活化平板培养基上，在28℃静置培养5～6天。
然后将辣木叶粉碎至20～40目，加自来水混合，不加其他辅料，混合物总含水量为63wt.％；混合物在120℃灭菌15min，冷却后接种活化的lm_2017、1m_02、1m_03、1m_04、1m_05、t8、t10、a、b、c，接种量为辣木叶重量的0.037％，混合物厚度5～8cm，28℃±0.5℃条件下通气固态发酵36～60h。发酵结果见表1。
表1不同黑曲霉发酵辣木叶风味和速度的比较
筛选辣木发酵菌种的目的是获得适应性强，发酵速度快和发酵效果较好的菌种，以满足生产需求。然而，辣木中含有黄酮类等物质，对菌种具有选择性。从表1发酵结果可见，多株黑曲霉发酵辣木叶速度存在明显差异，asp.nigert8未见发酵，asp.nigerlm_2017和asp.nigerlm_03发酵速度较快，24h可见白色菌丝长满整个培养基，其余几种黑曲霉白色菌丝布满培养基的时间需要36h。发酵速度和风味密切相关，一般发酵速度快，风味较浓，但部分菌株发酵有霉臭等不良风味。考虑到辣木风味是其品质的最主要指标之一，同时发酵速度直接关系生产效率，选择asp.nigerlm_2017最佳。
实施例3
asp.nigerlm_2017的活化方法同实施例2。
首先将辣木叶粉碎至20～40目，然后加自来水混合，不加其他辅料，使混合物总含水量为45wt.％；混合物在120℃灭菌15min，冷却后接种活化的lm_2017,接种量为辣木叶重量的0.037％，混合物厚度5～8cm，25℃条件下通气固态发酵36h，发酵结果见表2、表3和图2。块状发酵物适度破碎后于35～40℃鼓风干燥至含水量小于10wt.％，粉碎过60目筛，以添加量5～15％与其他日粮混合使用；块状发酵物也可以不进行干燥，按干基量5～15％直接与日粮混合饲喂。
实施例4
发酵方法同实施例3，不同的是混合物总含水量为55wt.％，发酵温度为28℃，发酵时间为48h，发酵结果见表2。
实施例5
发酵方法同实施例3，不同的是混合物总含水量为65wt.％，发酵温度为31℃，发酵时间为60h，发酵结果见表2和表3。
实施例6
发酵方法同实施例3，不同的是混合物总含水量为70wt.％，发酵温度为28℃，发酵时间为72h。
实施例7
发酵方法同实施例3，不同的是黑曲霉接种量为辣木叶重量的0.03％。
实施例8
发酵方法同实施例3，不同的是黑曲霉接种量为辣木叶重量的0.05％。
表2辣木叶发酵后槲皮素和纤维素酶含量变化
gdw：每g绝干辣木叶
表3辣木叶发酵后氨基酸含量变化
gdw：每g绝干辣木叶
由表2、表3可知，采用asp.nigerlm_2017对辣木叶进行固态发酵处理，每克干料中黑曲霉益生菌8×108cfu/g以上，并含有多种消化酶，辣木叶发酵后产生的芳樟醇气味纯正、圆和,甜润、幽雅，风味明显得到改善；较未发酵物，蛋白质含量增加5～7％，游离氨基酸含量提高23.5～25.9％，总氨基酸生物效价更好，使辣木叶饲料品质得到改善。
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<110>南京林业大学,保山九润绿色产业发展有限公司
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