一种来源于真菌淀粉酶TlAmy5及其基因和应用的制作方法

本发明涉及基因工程领域，具体地，本发明涉及一种来源于真菌淀粉酶tlamy5及其基因和应用。

背景技术：

淀粉酶是一种用途极为广泛的生物催化剂，可应用于面包制作业、淀粉的糖化和液化、纺织品脱浆、造纸、清洁剂工业、化学、临床医学的分析和制药业等。淀粉酶家族包括α-淀粉酶、β-淀粉酶和葡萄糖淀粉酶。α-淀粉酶为内切酶，以无规则的方式切开淀粉分子内部的α-1，4糖苷键，而使淀粉生成糊精和低聚糖，是一种钙离子依赖性酶。β-淀粉酶从非还原性末端顺次切下麦芽糖，为外切酶。葡萄糖淀粉酶是一种作用于α-1，4糖苷键的外切酶，从非还原糖末端切下葡萄糖分子。

淀粉水解酶是淀粉制糖工业的重要用酶。根据其在淀粉制糖工业中的应用可分为液化酶和糖化酶，而葡萄糖淀粉酶和麦芽三糖淀粉酶是重要的糖化酶。麦芽三糖淀粉酶可以催化降解淀粉生成高浓度的麦芽三糖。麦芽三糖作为一种优势特别明显的麦芽寡糖，被广泛地应用于焙烤、运动饮料和医药行业，受到越来越多的青睐。本研究挖掘新型的嗜酸麦芽三糖淀粉酶，为淀粉制糖工业提供性质优良的淀粉水解酶。

麦芽三糖具有高吸水、耐酸和耐热等特性，受到越来越多食品和饮料生产的青睐，以普鲁兰多糖为底物虽然能够获得高纯度的麦芽三糖，但普鲁兰多糖价格昂贵，增加了生产成本。以价格低廉的淀粉为底物，利用麦芽三糖淀粉酶的催化水解获得以麦芽三糖为主的低聚麦芽糖浆是最经济的方法。

α-淀粉酶(ec.3.2.1.1)属于糖苷水解酶13家族，能够作用于可溶性淀粉、糖元、直链淀粉等α-1,4-葡聚糖，其水解淀粉的主要产物是一些由葡萄糖单位组成的低聚糖和糊精的混合物。α-淀粉酶广泛应用于食品、纺织和制药等工业。

本发明从talaromycesleycettanusjcm12802菌株中得到了一个新的淀粉酶基因，其编码的淀粉酶具有以下几个优点：酸性、广泛的底物特异性、比活高、有降解生淀粉的能力。所有这些优点都意味着新发明的淀粉酶在饲料、食品、医药等行业中，将会比之前报道的淀粉酶更有应用价值。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种酸性、广泛底物特异性、具有降解生淀粉能力的的淀粉酶。

本发明的再一目的是提供上述淀粉酶的基因。

本发明的再一目的是提供包含上述淀粉酶的重组载体。

本发明的再一目的是提供包含上述淀粉酶基因的重组菌株。

本发明的再一目的是提供一种制备淀粉酶的方法。

本发明的再一目的是提供上述淀粉酶的应用。

本发明首先所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种性质优良的、适合于在饲料、食品、医药等行业中应用的新的淀粉酶。该淀粉酶tlamy5，氨基酸序列如seqidno.1：

其中，该酶全长610个氨基酸，n端20个氨基酸为信号肽序列“mmkrgvlvtvlcllnlavha”。

因此，成熟的淀粉酶tlamy5的理论分子量为64.7kda，其氨基酸序列如seqidno.2：

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该淀粉酶最适ph为4.5，在ph4.5-ph6.0范围内，该酶能够维持其70％以上的酶活力；最适温度60℃，在70℃时依然具有50％以上的酶活力，在50℃下处理60min，剩余酶活在80％以上，在60℃下处理20min，依然能够保持37％的酶活力，具有良好的稳定性。

本发明还提供了编码上述淀粉酶的基因。该酶的全基因序列如seqidno.3所示：

本发明通过pcr的方法分离克隆了这个淀粉酶基因tlamy5，dna全序列分析结果表明，淀粉酶tlamy5结构基因全长2316bp，含有8个内含子，cdna长1833bp，其cdna序列如seqidno.4所示：

成熟蛋白理论分子量为63.4kda，该酶属于糖基水解酶第13家族，一种新的淀粉酶。

去除信号肽后的cdna序列如seqidno.5所示

本发明还提供了包含上述淀粉酶基因的重组载体，优选为ppic9-tlamy5。将本发明的淀粉酶基因插入到表达载体合适的限制性酶切位点之间，使其核苷酸序列可操作的与表达调控序列相连接。作为本发明的一个最优选的实施方案，优选为将淀粉酶基因插入到质粒ppic9上的ecori和noti限制性酶切位点之间，使该核苷酸序列位于aoxl启动子的下游并受其调控，得到重组酵母表达质粒ppic9-tlamy5。

本发明还提供了包含上述淀粉酶基因的重组菌株，优选为重组菌株gs115/tlamy5。

本发明还提供了一种制备淀粉酶的方法，包括以下步骤：

1)用上述重组载体转化宿主细胞，得到重组菌株；

2)培养重组菌株，诱导重组淀粉酶的表达；以及回收并纯化所表达的淀粉酶。

其中，优选所述宿主细胞为毕赤酵母(pichiapastoris)细胞、啤酒酵母(saccharomycescerevisiae)细胞或多型汉逊酵母(hansenulapolymorpha)细胞，优选将重组酵母表达质粒转化毕赤酵母细胞(pichicpastoris)gs115，得到重组菌株gs115/tlamy5。

本发明还提供了上述淀粉酶的应用。运用基因工程手段来产业化生产淀粉酶。

本发明提供了一个新的淀粉酶基因，可作应用于饲料、食品、医药等工业。根据本发明的技术方案就可以实现利用基因工程手段生产性质优良适合工业应用的淀粉酶。

附图说明

图1本发明重组淀粉酶的最适ph值。

图2本发明淀粉酶的ph稳定性。

图3本发明淀粉酶最适反应温度。

图4本发明淀粉酶热稳定性。

具体实施方式

试验材料和试剂

1、菌株及载体：毕赤酵母(pichiapastorisgs115)；毕赤酵母表达载体ppic9及菌株gs115购自于invitrogen公司。

2、酶类及其它生化试剂：内切酶购自takara公司，连接酶购自invitrogen公司，其它都为国产试剂(均可从普通生化试剂公司购买得到)。

3、培养基：

(i)产酶培养基：30g/l麦麸，30g/l玉米芯粉，30g/l豆粕，5g/l大麦葡聚糖，5g/l(nh4)so4，1g/lkh2po4，0.5g/lmgso4·7h2o，0.01g/lfeso4·7h2o，0.2g/lcacl2于1l去离子水中，121℃，15磅条件下灭菌处理20min

(2)大肠杆菌培养基lb(126蛋白胨、0.5％酵母提取物、126naci，ph7.o)。

(3)bmgy培养基；1％酵母提取物，2％蛋白胨，1.34％ynb，0.000049<biotin，1％甘油(v/v)。

(4)bmmy培养基：除以0.5％甲醇代替甘油，其余成份均与bmgy相同，ph4.0。

说明：以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》(第三版)j.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。

实施例1淀粉酶编码基因tlamy5的克隆

提取talaromycesleycettanusjcm12802基因组dna

设计克隆引物，以talaromycesleycettanusjcm12802总dna为模板进行pcr扩增。pcr反应参数为：95℃5min；94℃30sec,60℃30sec,72℃2min,35个循环，72℃10min。得到一约1800bp片段，将该片段回收后送睿博生物技术有限公司测序。

表1基因克隆本实验所需的引物

实施例2淀粉酶cdna的获得

提取talaromycesleycettanusjcm1280,总rna，利用oligo(dt)20和反转录酶得到cdna的一条链，然后设计扩增开放阅读框的的引物12802gh13-5-f和12802gh13-5-r(见表1)，扩增该单链cdna，获得淀粉酶的cdna序列，扩增得到产物回收后送睿博生物技术有限公司测序。

通过对淀粉酶的基因组序列和cdna序列比对后发现该基因有含有8个内含子，cdna长1833bp，编码610个氨基酸和一个终止密码子，n端20个氨基酸为其信号肽序列，从talaromycesleycettanusjcm1280中分离克隆得到的编码淀粉酶的基因为新基因。

实施例3淀粉酶工程菌株的构建

(1)表达载体的构建及在酵母的表达

以测序正确的淀粉酶tlamy5的cdna为模板，设计合成了带有ecori和noti限制性酶切位点的引物12802gh13-5-f和12802gh13-5-r(见表1)，对tlamy5的成熟蛋白的编码区进行扩增。并利用ecori和noti酶切pcr产物，连接进入表达载体ppic9(invitrogen,sandiego)，淀粉酶tlamy5成熟蛋白的序列插入到上述表达载体的信号肽序列的下游，与信号肽形成正确的阅读框架，构建成酵母表达载体ppic9-tlamy5，转化大肠杆菌感受态细胞trans1。阳性转化子进行dna测序，测序表明序列正确的转化子用于大量制备重组质粒。用限制性内切酶bglii进行线性化表达质粒载体dna，电击转化酵母gs115感受态细胞，30℃培养2-3天，挑取在md平板上生长的转化子进行进一步的表达实验，具体操作请参考毕赤酵母表达操作手册。

以同样的方式构建含tlamy5信号肽序列的cdna的表达载体，并转化。

(2)高淀粉酶活性转化子的筛选

用灭过菌的牙签从长有转化子的md板上挑取单菌落，按照编号先点到md平板上，将md平板置于30℃培养箱中培养1～2天，至菌落长出。按编号从md平板上挑取转化子接种于装有3mlbmgy培养基的离心管中，30℃、220rpm摇床培养48h；将摇床培养48h的菌液3,000×g离心15min，去上清，离心管中再加入1ml含有0.5％甲醇的bmmy培养基，在30℃、220rpm诱导培养；诱导培养48h后，3,000×g离心5min，取上清用于酶活性检测，从中筛选出高淀粉酶活性的转化子，具体操作请参考毕赤酵母表达操作手册。

实施例4重组淀粉酶的制备

(1)淀粉酶基因tlamy5在毕赤酵母中摇瓶水平的大量表达

筛选出酶活较高的转化子，接种于400mlbmgy液体培养基的1l三角瓶中，30℃，220rpm摇床振荡培养48h；4500rpm离心5min，轻柔弃上清，再向菌体加入200ml含有0.5％甲醇的bmmy液体培养基，30℃，220rpm诱导培养48h。诱导培养期间，间隔24h补加一次甲醇溶液以补偿甲醇的损失，使甲醇浓度保持在0.5％左右；(3)12,000×g离心10min，收集上清发酵液，检测酶活性并进行sds-page蛋白电泳分析。

(2)重组淀粉酶的纯化

收集摇瓶表达的重组淀粉酶上清液，通过10kda膜包进行浓缩，同时用低盐缓冲液置换其中的培养基，然后用10kda超滤管进一步的浓缩。浓缩能稀释到一定倍数的重组tlamy5，通过离子交换层析进行纯化。具体地，取tlamy5浓缩液2.0ml经预先用20mmtris-hcl(ph7.5)平衡过的hitrapqsepharosexl阴离子柱，然后用0-1mol/l的nacl进行线性梯度洗脱，对分步收集的洗脱液检测酶活性和进行蛋白浓度的测定

实施例5重组淀粉酶部分性质分析

采用dns法对本发明的淀粉酶进行活性分析。具体方法如下：在ph4.5，60℃条件下，1ml的反应体系包括l00μl适当的稀释酶液，900μl底物，反应l0rnin，加入1.5mldns终止反应，沸水煮5min。冷却后540nm测定od值。淀粉酶活性单位定义：在60℃ph4.5条件下，每分钟内催化水解底物释放出1μmol还原糖所需的酶量为一个酶活单位。

(1)淀粉酶tlamy5的最适ph及ph稳定性

经纯化的实施例3表达的淀粉酶tlamy5在不同的ph下进行酶促反应以测定其最适ph。所用缓冲液为ph1.0～3.0甘氨酸-盐酸缓冲液，ph3.0～8.0的柠檬酸一磷酸氢二钠系列缓冲液及ph8.0～l0.0tris-hcl系列缓冲液。纯化的淀粉酶tlamy5在不同ph的缓冲体系.60℃下测定的ph适性结果(图1)表明：tlamy5的最适ph为4.5，在ph4.5-ph6.0范围内，该酶能够维持其75％以上的酶活力。

将酶液在不同ph值的缓冲液中于37℃下处理60min，再测定酶活性以研究酶的ph稳定性。结果表明(图2)，分析结果表明ph3.0-ph7.0之间能够维持85％以上的酶活力，说明该酶具有优良的ph稳定性。

(2)淀粉酶tlamy5反应最适温度及热稳定性

纯化的淀粉酶在ph4.5条件下，测定不同温度(40-90℃)下的酶活性，分析实验结果表明显示，该酶的最适反应温度为60℃，在55-65℃时依然具有89％以上的酶活力(图3)。耐温性测定为淀粉酶在不同温度下处理不同时间，再在60℃下进行酶活性测定。热稳定性实验表明：该淀粉酶在50℃下处理60min，剩余酶活在89％以上，即使该酶在60℃下处理20min，依然能够保持31％的酶活力，这表明该酶具有较好的稳定性(图4)。

<110>中国农业科学院饲料研究所

<120>一种来源于真菌淀粉酶tlamy5及其基因和应用

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