本发明涉及基因工程研究领域，具体涉及蛋白酶抗性及催化效率提高的植酸酶突变体f89s/k226h及应用。
背景技术：
植酸酶可以提高磷的生物可利用性，一些细菌植酸酶对植酸盐具有高度特异性，而曲霉等真菌来源植酸酶显示了广泛的底物特异性，可作用于amp、adp、atp、三聚磷酸钠、焦磷酸、乙酰磷酸、对硝基苯磷酸和质酸钠等。
通过突变技术可以改善酶的热稳定性、ph耐受性及催化性能。植酸酶对蛋白酶的敏感性通常会降低单胃动物肠道中植酸酶的活性和稳定性，限制了植酸酶在工业上的应用范围。胃蛋白酶和胰蛋白酶是具有特定底物选择性的消化酶。胃蛋白酶优先切割f，l，e和k羧基端的肽键，而胰蛋白酶则特异降解k和r后面的肽健。本发明通过定点突变的方法干扰胰蛋白酶和胃蛋白酶对植酸酶特定位点的切割，提高了植酸酶的胰蛋白酶和胃蛋白酶抗性及催化活性。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种胰蛋白酶和胃蛋白酶抗性及催化效率提高的植酸酶。
本发明另一目的是提供编码上述胰蛋白酶和胃蛋白酶抗性及催化效率提高的植酸酶基因。
本发明的另一目的是提供包含上述胰蛋白酶和胃蛋白酶抗性及催化效率提高的植酸酶基因的重组载体。
本发明的另一目的是提供包含上述胰蛋白酶和胃蛋白酶抗性及催化效率提高的植酸酶基因的重组菌株。
本发明的另一目的是提供上述胰蛋白酶和胃蛋白酶抗性及催化效率提高的植酸酶基因的应用。
本发明对小肠结肠炎耶尔森氏菌(yersiniaenterocolitica)来源植酸酶yeappa基因进行定点突变。seqidno.1所示的氨基酸序列是植酸酶yeappa的成熟蛋白序列。seqidno.2所示的核苷酸序列编码yeappa的成熟蛋白。
seqidno.1
msvakrnlhlsaltlimgcftagaapiatppasytlervvilsrhgvrsptkqtqlmndvtpdkwplwpvkagyltprraelvtlmggfygdyfrsqgllsagcpvdgsvyaqadvdqrtrltgqafldgiapdcglkvhyqadlkkvdplfhtveagvckldsakthqaveerlggplsdlsqryakpfaqmgevlnfaaspyckslqkngktcdfatftaneikvneegtkvslsgplalsstlgeifllqdsqampdvawhrlsgeenwvsllslrnaqfdlmaktpyiarhkgtpllqqidtalvlqrdaqgqtlplspqtkllflgghdtnianiagmlganwqlpqqpdntppggglvfelwqnpdnhqryvavkmfyqtmdqlrnaekldmknnpakivpitiegcenegdnklcqletfqkkvaqviepachi.
seqidno.2
atgtcagttgcaaagagaaatctgcacttatccgcactcactttgataatgggctgttttaccgcaggtgctgccccgattgctacaccgccggccagctacacattagagcgtgtggttattttgagtcgacatggtgttcgctccccgacaaaacaaacccagctaatgaatgatgtcacacctgataaatggcccctgtggccagtaaaagcgggctatttaacaccgcgaagggctgagttagtgactttgatggggggattttatggtgattatttccgcagccaagggttgttgtctgcggggtgtccggtagatggctccgtttatgcacaggcagatgttgaccaacgaacccgcttaaccggacaggcattcttggatgggatcgcaccggattgtggtctgaaagtacattatcaggctgatttgaagaaagttgacccgctatttcataccgtcgaagcgggggtctgtaaactggactcagcgaaaactcatcaggctgttgaggagcgattgggcgggccattgagtgatcttagccagcgctatgccaaaccctttgctcagatgggcgaagtgctgaattttgcagcatcgccttattgcaagtcattgcaaaaaaatggaaaaacctgtgattttgcaacttttacggcaaatgaaattaaggtaaacgaagaaggtactaaagtttctctgagtgggccattggcactatcgtcgacattgggtgaaattttcctgttacaagactcacaagctatgccggatgtggcctggcatcggctcagcggtgaagagaactgggtttcgctattgtcgttgcgcaatgcgcaatttgatttgatggccaaaaccccgtatatcgctcgccataaagggaccccgctgttgcaacaaattgatacggcattagtgctgcaacgcgatgcccaagggcaaacactgccgctgtcaccgcaaaccaaattgctgttcctcggcgggcatgacaccaatattgctaatatcgctggtatgttaggggccaattggcaattaccacagcaacctgataataccccgcctggtggcggattagtctttgagctatggcagaacccagataatcatcagcgctatgtcgccgtgaaaatgttctatcaaacgatggatcagctgcgaaatgccgagaaattagatatgaaaaacaacccagctaaaattgttccaattaccattgaaggttgtgagaacgagggtgataacaaactttgccaacttgagactttccaaaagaaagttgcccaagtgatcgagccagcctgccatatttaa
根据本发明的胰蛋白酶和胃蛋白酶抗性及催化效率提高的植酸酶yeappa的突变体，氨基酸序列如seqidno.1所示的植酸酶的第89位的苯丙氨酸突变为丝氨酸，进一步，第226位的赖氨酸突变为组氨酸。
根据本发明的具体实施方式，采用定点突变的方法，获得了2个胰蛋白酶和胃蛋白酶抗性提高的植酸酶yeappa的突变体，分别命名为yeappa-f89s和yeappa-f89s/k226h，其中yeappa-f89s/k226h的催化效率得到了提升。yeappa-f89s为第89位苯丙氨酸突变为丝氨酸；yeappa-f89s/k226h为第89位苯丙氨酸突变为丝氨酸且第226位赖氨酸突变为组氨酸。
因此根据本发明的胰蛋白酶和胃蛋白酶抗性改良的植酸酶突变体yeappa-f89s，其中第89位苯丙氨酸突变为丝氨酸，其氨基酸序列如seqidno.3所示
seqidno.3
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根据本发明的胰蛋白酶和胃蛋白酶抗性及催化效率提高的植酸酶突变体yeappa-f89s/k226h，其中第89位苯丙氨酸突变为丝氨酸且第226位赖氨酸突变为组氨酸，其氨基酸序列如seqidno.4所示
seqidno.4
msvakrnlhlsaltlimgcftagaapiatppasytlervvilsrhgvrsptkqtqlmndvtpdkwplwpvkagyltprraelvtlmggsygdyfrsqgllsagcpvdgsvyaqadvdqrtrltgqafldgiapdcglkvhyqadlkkvdplfhtveagvckldsakthqaveerlggplsdlsqryakpfaqmgevlnfaaspyckslqkngktcdfatftaneikvneegtkvslsgplalsstlgeifllqdsqampdvawhrlsgeenwvsllslrnaqfdlmaktpyiarhkgtpllqqidtalvlqrdaqgqtlplspqtkllflgghdtnianiagmlganwqlpqqpdntppggglvfelwqnpdnhqryvavkmfyqtmdqlrnaekldmknnpakivpitiegcenegdnklcqletfqkkvaqviepachi.
本发明还提供了编码上述胰蛋白酶和胃蛋白酶抗性改良及催化效率提高的植酸酶突变体yeappa-f89s和yeappa-f89s/k226h的基因序列，其核苷酸序列分别如seqidno.5和6所示。
seqidno.5
atgtcagttgcaaagagaaatctgcacttatccgcactcactttgataatgggctgttttaccgcaggtgctgccccgattgctacaccgccggccagctacacattagagcgtgtggttattttgagtcgacatggtgttcgctccccgacaaaacaaacccagctaatgaatgatgtcacacctgataaatggcccctgtggccagtaaaagcgggctatttaacaccgcgaagggctgagttagtgactttgatggggggaagctatggtgattatttccgcagccaagggttgttgtctgcggggtgtccggtagatggctccgtttatgcacaggcagatgttgaccaacgaacccgcttaaccggacaggcattcttggatgggatcgcaccggattgtggtctgaaagtacattatcaggctgatttgaagaaagttgacccgctatttcataccgtcgaagcgggggtctgtaaactggactcagcgaaaactcatcaggctgttgaggagcgattgggcgggccattgagtgatcttagccagcgctatgccaaaccctttgctcagatgggcgaagtgctgaattttgcagcatcgccttattgcaagtcattgcaaaaaaatggaaaaacctgtgattttgcaacttttacggcaaatgaaattaaggtaaacgaagaaggtactaaagtttctctgagtgggccattggcactatcgtcgacattgggtgaaattttcctgttacaagactcacaagctatgccggatgtggcctggcatcggctcagcggtgaagagaactgggtttcgctattgtcgttgcgcaatgcgcaatttgatttgatggccaaaaccccgtatatcgctcgccataaagggaccccgctgttgcaacaaattgatacggcattagtgctgcaacgcgatgcccaagggcaaacactgccgctgtcaccgcaaaccaaattgctgttcctcggcgggcatgacaccaatattgctaatatcgctggtatgttaggggccaattggcaattaccacagcaacctgataataccccgcctggtggcggattagtctttgagctatggcagaacccagataatcatcagcgctatgtcgccgtgaaaatgttctatcaaacgatggatcagctgcgaaatgccgagaaattagatatgaaaaacaacccagctaaaattgttccaattaccattgaaggttgtgagaacgagggtgataacaaactttgccaacttgagactttccaaaagaaagttgcccaagtgatcgagccagcctgccatatttaa
seqidno.6
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将上述编码胰蛋白酶和胃蛋白酶抗性改良及催化效率提高的植酸酶yeappa的突变体的cdna分子正确的读码框以合适的取向插入到所述载体的限制性酶切位点之间，使其核苷酸序列可操作的与表达调控序列相连接。本发明优选的载体为ppic9γ，改造的植酸酶基因插入到质粒ppic9γ上的ecori和noti限制性酶切位点之间，获得重组细菌表达质粒。各突变体基因在重组质粒中位于aox1启动子下游并受其调控。本发明优选的宿主菌为毕赤酵母(pichiapastoris)gs115。重组质粒经bglii线性化后在毕赤酵母gs115中大量表达。
相比于野生型，本发明的植酸酶突变体yeappa-f89s和yeappa-f89s/k226h对胰蛋白酶和胃蛋白酶的耐受性及催化效率明显提高，在动物生产中具有很大应用潜力。
附图说明
图1为改造前、后的植酸酶对不同浓度胰蛋白酶和胃蛋白酶处理的耐受性曲线
具体实施方式
实验材料
酵母表达载体为ppic9γ，表达宿主菌为毕赤酵母gs115，二者购自novagen公司。大肠杆菌trans1-t1细胞用于质粒扩增。trans1-t1细胞、pfudna聚合酶、限制性内切酶、t4dna连接酶购自天根。dna纯化试剂盒购自takara。植酸钠、胃蛋白酶(p0685)和胰蛋白酶(t0458)购自sigma。核苷酸引物由上海英俊生物技术有限公司合成。
实施例1：突变基因的获得
以小肠结肠炎耶尔森氏菌(yersiniaenterocolitica)来源的植酸酶yeappa的基因序列(seqidno.2)进行改造，通过overlappcr产生突变基因。该方法以含有野生植酸酶基因yeappa的peasy-t3-yeappa重组质粒为模板，通过两轮pcr反应引入突变，所需的突变基因连接到载体peasy-t3载体上并经公司测序证实。
突变使用6条引物：ye-f、ye-r、f89s-f、f89s-r、k226h-f和k226h-r。
引物序列如下：
ye-f：5’-cgcgaattcgccccgattgctacaccgcc-3’
ye-r：5’-gatgcggccgcttaaatatggcaggctggctcga-3’
f89s-f：5’-tgatggggggaagctatggtgattatttc-3’
f89s-f：5’-gaaataatcaccatagcttccccccatca-3’
k226h-f：5’-caaatgaaattcatgtaaacgaagaaggta-3’
k226h-r：5’-taccttcttcgtttacatgaatttcatttg-3’
引物中斜体代表限制性酶切位点ecori和noti，下划线标记的核苷酸序列为突变位点。
实施例2：改造前后的植酸酶在毕赤酵母中的表达与纯化
植酸酶突变体yeappa-f89s和yeappa-f89s/k226h的编码区序列插入到分泌型表达载体ppic9γ的ecori和noti酶切位点之间，在毕赤酵母gs115细胞中受aox1启动子的调控表达。以0.5％的甲醇为诱导剂，在30℃和220rpm的摇床中诱导培养3天大量表达植酸酶。粗酶液经镍-次氮基三乙酸(ni-nta)柱和二乙基氨基乙基(deae)柱进行层析纯化。10％sds-page电泳分析显示突变酶与野生酶的表面分子量一致，均为约46kda。
实施例3：突变植酸酶对胰蛋白酶和胃蛋白酶的抗性
突变植酸酶和野生植酸酶分别用不同浓度的胰蛋白酶(ph7)和胃蛋白酶(ph2)在37℃下处理2h,蛋白酶与植酸酶的比为3到141u/mg。根据不同浓度蛋白酶处理后剩余的植酸酶酶活确定胰蛋白酶和胃蛋白酶抗性。对蛋白酶处理后的样品用最适ph缓冲液稀释至适当浓度，使用硫酸亚铁钼蓝法测定植酸酶活性。将50μl酶液加入到950μl1.5mmol/l植酸钠底物(用0.25mol/l的ph4.5的1.5mmol/l植酸钠缓冲液配制)中，在37℃下反应30min，分别用1ml10％tca和2ml显色液(1％四水合钼酸铵，3.2％浓硫酸，7.32％硫酸亚铁)终止反应和显色，根据700nm处光吸值衡量释放的无机磷酸盐的量。一个植酸酶活性单位定义为在测定条件下，每分钟释放1微摩尔的磷酸盐所需的酶量。结果(图1)显示，胰蛋白酶浓度从3u/mg升高至141u/mg时，突变植酸酶yeappa-f89s/k226h的酶活基本保持不变，而野生酶yeappa和突变酶yeappa-f89s失去了高达46％的酶活。用3u/mg胃蛋白酶处理2h时，野生酶yeappa完全失去活性，突变植酸酶yeappa-f89s可保持45％的酶活，突变植酸酶yeappa-f89s/k226h可保持74％的酶活；当胃蛋白酶浓度增加至141u/mg时，突变植酸酶yeappa-f89s和yeappa-f89s/k226h分别可保持14％和36％的酶活。因此突变植酸酶yeappa-f89s和yeappa-f89s/k226h显示了较野生酶更高的胰蛋白酶和胃蛋白酶抗性。
28u/mg的胰蛋白酶或胃蛋白酶处理不同时间后植酸酶的剩余蛋白经page分离，并用imagej软件评价其蛋白条带的灰度值。根据蛋白酶处理后剩余的植酸酶蛋白的量，计算植酸酶受蛋白酶水解的半衰期。结果(表1)显示突变植酸酶具有较强的胃蛋白酶抗性，突变植酸酶yeappa-f89s和yeappa-f89s/k226h较野生酶有更长的胃蛋白酶水解的半衰期。经28u/mg胰蛋白酶处理后，野生酶yeappa和突变酶yeappa-f89s的水解半衰期为125min，突变酶yeappa-f89s/k226h的水解半衰期较yeappa和yeappa-f89s提高了4.3倍(表1)。
表1改造前后的植酸酶在胰蛋白酶和胃蛋白处理下的半衰期
实施例4：突变植酸酶的酶学性质分析
改造前后的野生型植酸酶和突变植酸酶在不同ph(1-12)和37℃下进行酶促反应30min，测定最适ph。酶液在ph2-9和37℃下处理1h，研究不同ph下酶的活性模式。所用的缓冲液为：0.1mol/l甘氨酸-盐酸缓冲液，ph1-3；0.1mol/l醋酸钠-醋酸缓冲液，ph3-6；0.1mol/ltris-盐酸缓冲液，ph7-8；0.1mol/lbis-tris-盐酸缓冲液，ph6-7.3；0.1mol/l甘氨酸-氢氧化钠缓冲液，ph8-12。野生酶yeappa、突变酶yeappa-f89s和yeappa-f89s/k226h的最适ph为4.5-5。在ph2下处理1h，突变酶yeappa-f89s/k226h保持了80％的酶活，而野生酶yeapap和突变酶yeapap-f89s仅保持12％的酶活，因此突变酶yeappa-f89s/k226h较突变酶yeappa-f89s和野生酶yeappa具有更高酸稳定性(表2)。
在最适ph和不同温度(30-80℃)下处理30min，突变酶yeapap-f89s、yeappa-f89s/k226h和野生酶yeappa在45℃显示最高活性。60℃下将突变酶和植酸酶分别处理不同时间后测定其热失活的半衰期。突变植酸酶yeappa-f89s/k226h、yeappa-f89s和野生酶yeappa在60℃处理下的半衰期分别为10.1、3.1和1.1min(表2)。因此植酸酶yeappa的第89位的苯丙氨酸突变为丝氨酸提高了植酸酶的热稳定性，而其第226位的赖氨酸同时突变为组氨酸时不仅提高植酸酶的酸稳定性，还可提高植酸酶的耐热性。
表2改造前后植酸酶的酶学性质
实施例5：突变酶的动力学常数比较
用不同浓度的植酸钠(0.0625、0.1、0.125、0.2、0.25、0.5、1.0和1.5mmol/l)为底物，在酶的最适ph和37℃下反应5min，按上述的硫酸亚铁钼蓝法测定酶活性，用米氏方程双倒数法求km值及vmax，再根据酶的理论分子量求出kcat值。yeappa-f89s/k226h的底物亲和力(km值)与野生酶相似，其最大反应速度(vmax值)、底物转换数(kcat)和催化效率(kcat/km)较野生酶分别提升了1.2，1.7和1.8倍(表3)。突变酶yeappa-f89s的动力学常数，包括底物亲和力，最大反应速度，底物转换数和催化效率均与野生酶相似(表3)。这些结果表明yeappa第226位氨基酸残基对催化效率有很大影响，而其第89位氨基酸残基替换不影响动力学常数。
表3改造前后植酸酶的酶学性质
<110>中国农业科学院饲料研究所
<120>蛋白酶抗性及催化效率提高的植酸酶突变体f89s/k226h及应用
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