本发明属于超亲水、抗菌、防腐材料领域，具体涉及一种无抗菌剂和金属离子的抗菌、防腐、抗生物被膜新技术，尤其是一种高密度接枝酸基催化细菌裂解的抗生物被膜材料及其制备方法和应用。
背景技术：
人类的生存和健康持续受到各种细菌病毒的威胁。人类生活环境中存在大量微生物，从日常用的纤维服装、家用电器、卫生陶瓷制品、塑料薄膜，到建筑用的钢材、涂料以及饮用水的消毒处理等方面，它们在适宜温度及养分下会迅速繁殖，导致物质的变质、腐败、发霉以及伤口化脓感染等现象，严重威胁人类的健康。
近年大肠杆菌疫情等事件使人们更加认识到与细菌微生物的斗争是长期的，日常生活中人们越来越离不开抗菌技术，这就使得抗菌材料成为当今新材料研究和开发的热点之一。抗菌材料是一类具有杀菌、抑菌性能的新型功能材料，其核心成分是抗菌剂，将少量的抗菌剂添加至普通材料中制成抗菌材料。抗菌材料目前主要有3大类，分别是天然抗菌材料、有机抗菌材料和无机抗菌材料。天然抗菌材料和有机抗菌材料的研究较早，品种繁多，存在毒性、长效性、不耐高温性等不足使应用受到限制。无机抗菌材料是近20年发展的一类抗菌材料，主要有半导体光催化型、金属离子金属氧化物型等。这类抗菌材料具有化学稳定性好、热稳定性好、无毒、广谱等优点，在塑料、纤维、涂料、陶瓷等制品的应用中占有很大优势。在无机抗菌材料中，抗菌活性成分为金属的无机抗菌剂是目前研究最为广泛的抗菌剂，其中以杀菌活性强且无毒的银系无机抗菌材料研究较多。最早的有机抗菌剂是抗菌素、小分子季胺盐和季鏻盐。近年来,研究则重于向疏水链上引入氧、硫等杂原子,和向季氮上引入不饱和烷基,以有助于提高抗菌活性。这些衍生物具有强碱性，能与带负电荷的细菌相互吸引，束缚细菌的自由活动，造成“接触死亡”。另外，在电场力下，细胞壁和细胞膜上的负电荷由于分布不均而变形，造成物理性破裂，使细胞中的水、蛋白质等物质溢出，发生“细菌溶体”现象而死亡。但是有机类抗菌剂的耐温差,会有溶出、析出现象,使用寿命短。为了改善有机抗菌剂性能,降低它对环境、人类的刺激和毒害,研制具有缓释、长效、高效、低毒的抗菌剂,人们通过抗菌剂单体化合物的聚合或将抗菌剂分子固定在高分子载体上制成聚合物抗菌剂。高分子抗菌剂的低毒性、稳定性、抗菌持久性、便于改性等优点使其倍受青睐。而且对聚合物的修饰和改性可以灵活地引入无机、有机抗菌基团，合成各种不同需求的抗菌剂，制备出高性能、高选择性的高分子有机抗菌材料。高分子季铵盐在很多生产生活领域实用化。
目前抗菌材料存在的主要问题有，有机抗菌剂的成分都是阳离子基团，生物毒性大。金属离子有毒，并能引起环境污染。目前阳离子和金属离子方法不宜长期广泛的应用，不太适合医用。在医疗领域，抗菌素表面包埋被用于各种植入性器械。广泛和长期应用会加重抗药性，引起超级细菌、流行病突发和失控。
技术实现要素：
本发明的目的是克服已有技术的缺陷，为了解决有机季胺盐类和金属离子生物毒性大、环境不友好、以及抗菌素的抗药性问题，提出不用抗菌剂素和金属离子的抗菌和防腐新技术，具体为一种表面接枝高密度酸基催化细菌裂解的抗生物被膜材料及其制备方法和应用。
本发明首先公开了一种高密度接枝酸基催化细菌裂解的抗生物被膜材料的制备方法，包括如下步骤：
1)材料表面清洗，去除材料表面的颗粒和污染；如借超声辅助去除材料表面的颗粒和各种可能的有机和无机污染。根据不同材料，可以选用水、酸、碱、和有机溶剂等。
2)利用等离子体激活材料，产生表面自由基；
3)材料经等离子体激活后，暴露于空气中产生活性氧反应中心，
4)把材料加入到过量的含有酸基的不饱和单体中启动表面聚合反应，聚合反应在无氧的条件下进行，温度维持在25-95℃，反应时间在1-16小时，
5)反应结束后，清洗材料去除单体和少量游离的聚合高分子，干燥；得到表面接枝高密度酸基催化细菌裂解的抗生物被膜材料。
虽然多种气体包括氧气、氮气可以利用，但是惰性气体如氦气和氩气对材料表面损伤小，优选等离子体激活所用的气体为氦气或氩气。
所述的步骤3)暴露于空气中的时间小于30min。
所述的步骤4)中许多非饱和酸都可以用做聚合单体，本发明的含有酸基的不饱和单体可以为丙烯酸、甲基丙烯酸、山梨酸、肉桂酸、乙烯基磺酸、丙烯基硼酸中的一种或多种。
所述的步骤4)的聚合反应过程中，控制单体质量百分比浓度在5％以上。
所述步骤1)的材料为高分子材料或金属材料或各种化学惰性的复合材料。
本发明还公开了一种所述方法制备的表面接枝高密度酸基催化细菌裂解的抗生物被膜材料。
所述的表面接枝高密度酸基催化细菌裂解的抗生物被膜材料的表面羧基密度大于90微克/平方厘米。
本发明还公开了一种所述材料作为抗菌材料的应用，利用其表面接枝的高密度酸基(羧基、磺酸、硼酸)基团产生超级磷脂催化界面，引起脂膜裂解从而细菌死亡。以细菌脂膜为靶点，对革兰氏阳性，革兰氏阴性以及耐药菌同样有效，属于超级抗菌材料。
与现有技术相比，本发明所具有的有益效果有：
(1)由于不用季胺盐和金属离子等生物毒性大、环境不友好抗菌剂，本发明材料有更广泛的应用。
(2)此技术特别适应医学应用，尤其是植入性医用材料。由于避免了抗生素包埋，减低了抗药性、超级细菌产生和流行病突发和失控的风险。
(3)由于本发明材料以细菌脂膜为靶点，对革兰氏阳性，革兰氏阴性以及耐药菌同样有效，属于超级抗菌材料。
(4)这个过程可以产生超亲水表面。
(5)方法简单，成本低，并适用于高分子、金属、以及各种化学惰性的复合材料。
具体实施方式
1.抗菌乳胶导管
步骤一，医用乳胶导(1-4厘米长度，1毫米内径)管用乙醇清洗，干燥；
步骤二，乳胶导管置于等离子体发生器中，抽真空，然后引入氩气到反应仓(小于400豪托，2.4立方米\小时)，启动等离子体激发(输出功率80瓦，3分钟)；
步骤三，将等离子体激活过的乳胶导管放置空气中氧化70分钟，产生活性反应中心，然后把乳胶导管放置于预先经过脱氧处理的含40％丙烯酸水溶液容器中，密封；
步骤四，聚合反应在无氧的条件下进行，温度维持在70度，反应12小时；
步骤五，反应结束后，乳胶导管在超声水浴中，分别用水，30％氢氧化钠，纯净水，和乙醇清洗去除单体和游离的聚合高分子，在紫外灭菌的条件下干燥，得到抗菌乳胶导管。
2.抗菌硅片。
步骤一，硅片(约1x1厘米，1毫米米厚)分别用98％硫酸、2.0mnaoh、纯净水、乙醇清洗，干燥；
步骤二，硅片置于等离子体发生器中，抽真空(1000豪托)，然后引入氮气到反应仓(1.2立方米\小时)，启动等离子体激发(输出功率100瓦)10分钟；
步骤三，用等离子体激活过硅片放置空气中氧化120分钟，产生活性反应中心.然后把硅片放置于预先经过脱氧处理的含10％山梨酸水溶液容器中，密封；
步骤四，聚合反应在无氧的条件下进行，温度维持在90度，反应6小时；
步骤五，反应结束后，硅片在超声水浴中，分别用水、30％氢氧化钠、纯净水、和乙醇清洗去除单体和游离的聚合高分子，在紫外灭菌的条件下干燥，得到抗菌硅片。
3.抗菌聚对苯二甲酸乙二醇酯(pet)膜。
步骤一，食品用pet膜(1x1厘米，0.2毫米厚)用乙醇清洗，干燥；
步骤二，pet膜置于等离子体发生器中，抽真空，然后引入氩气到反应仓(小于800豪托，1.8立方米\小时)，启动等离子体激发(输出功率80瓦，5分钟)；
步骤三，用等离子体激活过pet膜放置空气中氧化60分钟，产生活性反应中心，然后把乳胶导管放置于预先经过脱氧处理的含45％丙烯酸水溶液容器中，密封；
步骤四，聚合反应在无氧的条件下进行，温度维持在80度，反应6小时；
步骤五，反应结束后，pet膜在超声水浴中，分别用水，30％氢氧化钠，纯净水，和乙醇清洗去除单体和游离的聚合高分子，在紫外灭菌的条件下干燥，得到抗菌pet膜。
3.主要性能测试：
3.1.表面羧基测定：样品表面的接枝的羧基量由甲苯胺蓝-o染色的比色法测定。首先配置0.5毫摩尔的，ph＝10的甲苯胺蓝-o溶液。接枝的材料放入甲苯胺蓝-o溶液中并放置在60℃条件下6小时。用去离子水和氢氧化钠溶液(ph＝9)清洗材料,去除附着在表面上的任何游离的染料。通过羧基复合在材料上的甲苯胺蓝-o随后33％乙酸溶解，并通过在630纳米的光学密度定出甲苯胺蓝-o的量。染料与羧酸基团之间的比例为1:1，从而可以计算出表面羧酸含量和密度。
在本发明的一个具体实施例中，以肉桂酸作为单体，材料为食品用pet膜。采用相同的等离子体条件，但是应用不同的浓度的肉桂酸单体启动pet表面修饰。高单体浓度对应高密度接枝表面如表1所示。
表1.单体浓度对pet表面酸基密度的影响
3.2.表面亲水性测定：材料表面的亲疏水性通过接触角仪器测定。利用微量注射器加注压出液体1.0μl纯净水样品量到对照和实验组材料表面，通过接触角仪器的摄像头及内置软件测定水接触角。未经过修饰的相应原材料做对照。其结果如表2所示。
3.3.人组织细胞毒性测定：材料样品(硅胶导管:1.0厘米长度，1毫米内径；pet膜：1x1厘米，0.2毫米厚；硅片：约1x1厘米，1毫米米厚)放入6空培养板，接种人细胞，并用含牛血清的培养基在37℃和5％co2条件下培养24小时.用生理盐水清洗后，材料样品表面活细胞用mtt染色，通过标准曲线确定活细胞数目。未经过修饰的相应原材料做对照。细胞毒性(％)＝100×(对照组活细胞数-抗菌样品组活细胞数)/对照组活细胞数。其结果如表2所示。
表2：材料表面的亲水性(水解触角)和对人细胞的毒性结果
从表2中可以看出，经本发明方法处理后的材料与原材料相比表现出了非常好的亲水性；即材料表面接枝高密度酸基后产生了超亲水表面。但是，这些高密度酸基接枝的高密度表面体现了非常好的生物相容性。修饰后的材料表面对来源于不同人体组织的细胞都没有产生明显的细胞毒性。
3.4.抗菌和抗生物被膜活性测定：材料样品(硅胶导管:1.0厘米长度，1毫米内径；pet膜：1x1厘米，0.2毫米厚；硅片：约1x1厘米，1毫米米厚)置于在中对数期生长的细菌(2×104cfu/ml，大肠杆菌，金黄色葡萄球菌，表皮葡萄球菌)悬浮液中2小时以便细菌细胞贴附在材料表面。小心清洗去除游离细菌，材料样品转移至tsbg(胰酪胨大豆肉汤+0.2％葡萄糖)培养液中，37℃培养过夜。清洗去除游离细菌后，材料样品表面形成的生物被膜通过常规的live/dead和mtt分析计算出抗菌和抗生物被膜活性。有三个对照组：1)原材料；2)原材料经过等离子处理，但是没有高分子接枝；3)原材料经过等离子处理，接枝有高密度醇基高分子(聚烯丙醇)。抗菌活性(live/dead分析)＝100×死细胞/(死细胞+活细胞)；抗生物被膜活性(mtt分析)＝100×抗菌样品组活细胞/对照组活细胞.
表3：材料的抗菌和生物被膜率测试结果(％)
注：3个对照组(原材料；原材料经过等离子处理，但是没有高分子接枝；原材料经过等离子处理，接枝有高密度醇基高分子(聚烯丙醇))无显著区别，均不表现抗菌或抗生物膜活性(抗菌率小于10％)。
3.5.长期生物被膜活性测定：硅橡胶导管样品(2-4厘米长度，1毫米内径)连接入半封闭的细菌培养系统。系统首先充以中对数期生长的细菌(2×104cfu/ml，大肠杆菌，金黄色葡萄球菌，表皮葡萄球菌)悬浮液，37℃静置培养4小时。然后系统连续灌以新鲜的tsbg培养基(流速＝0.12毫升/分钟)进行不间断培养，生物被膜形成通过显微镜观察。在特定时间点(1，3，5，7，14，21天)，从系统中取出硅橡胶导管，用mtt法定量分析在硅橡胶导管内壁生成的细菌被膜。有两个对照组：1)原材料；2)原材料经过等离子处理，但是没有高分子接枝。抗生物被膜活性(mtt分析)＝100×抗菌样品组活细胞/对照组活细胞。
表4：长期抗细菌(金黄色葡萄球菌)生物被膜实验结果
从表4的结果可以看出，未经合适表面酸基接枝的硅胶导管不具备任何生物活性，经过连续培养，细菌粘附于导管表面并迅速发展成生物被膜，并在2-3天内完全堵塞整个导管内管。相比之下，在相同的实验条件下，实施例1中的硅胶导管即使经过21天连续培养也没有细菌粘附和生物被膜生成。来源于用结构相近的但是不含酸基的丙烯醇修饰的导管和原来的硅胶导管一样，没有表现出任何抗生物被膜活性。