一种用于检测甲型H1N1病毒的荧光RT‑RAA引物、探针及检测方法与流程

本发明属于体外核酸检测领域，具体涉及一种用于检测咽拭子样品中甲型h1n1流感病毒的荧光rt-raa引物、探针和检测方法。

背景技术：

甲型h1n1流感为急性呼吸道传染病，其病原体是一种新型的甲型h1n1流感病毒，在人群中传播。与以往或目前的季节性流感病毒不同，该病毒毒株包含有猪流感、禽流感和人流感三种流感病毒的基因片段。人群对甲型h1n1流感病毒普遍易感，并可以人传染人，人感染甲流后的早期症状与普通流感相似，包括发热、咳嗽、喉痛、身体疼痛、头痛、发冷和疲劳等，有些还会出现腹泻或呕吐、肌肉痛或疲倦、眼睛发红等。2009年开始，甲型h1n1流感在全球范围内大规模流行。甲型h1n1流感的潜伏期，较流感、禽流感潜伏期长，潜伏期时长1～7天，多为1-3天。部分患者病情可迅速发展，来势凶猛、突然高热、体温超过38℃，甚至继发严重肺炎。因此，为及时有效发现甲型h1n1流感病毒，将该病毒防范于国门之外，建立快速、敏感、特异的甲型h1n1流感病毒检测方法十分必要。

随着全球化发展，方便、快捷的交通运输工具使旅游及不同国家和地区动物、动物产品的跨境移动日益频繁，也给传染病的传播和流行创造了有利条件。此外，甲型h1n1流感病毒早期感染呈现不典型症状，与其它呼吸道病毒感染症状类似，很难区分。因此，建立快速诊断甲型h1n1流感病毒感染的实验室方法显得尤为重要。

传统的检测方法检测周期长，且分离阳性率低，往往会延误病程和疫情的控制。分子生物学诊断方法可以在病毒血症时期检测到病毒的感染，并且快速灵敏，目前已被广泛的应用于甲型h1n1流感病毒的检测。目前，国内外已建立的甲型h1n1流感病毒检测方法有实时rt-pcr检测方法、半巢式pcr检测方法、lamp检测方法等，但pcr方法需要使用复杂的仪器和装备精良的实验室，而lamp方法引物较复杂，必须用特殊的软件设计，且用lamp方法得到的扩增产物是一些大小不等的片段，无法直接克隆和测序，只能用于判断目的基因的存在。

技术实现要素：

本发明的一个目的是提供一种用于检测甲型h1n1流感病毒的引物对，所述引物对包括下述1)-3)中的至少一种：

1)序列表中seqid№：1所示核苷酸序列和序列表中seqid№：2所示核苷酸序列；

2)在高严谨条件下可与序列表中seqid№：1限定的核苷酸序列杂交的核苷酸序列；和在高严谨条件下可与序列表中seqid№：2限定的核苷酸序列杂交的核苷酸序列；

3)与1)、或2)限定的核苷酸序列具有90％以上同源性，且具有相同功能的核苷酸序列。

具体的，所述同源性为95％以上；再具体的为96％以上；再具体的为97％以上；再具体的为98％以上；再具体的为99％以上。

上述高严谨条件可为用6×ssc，0.5％sds的溶液，在65℃下杂交，然后用2×ssc，0.1％sds和1×ssc，0.1％sds各洗膜一次。

所述具有相同功能具体包括能用于检测甲型h1n1流感病毒的核苷酸序列。

本发明的再一个目的是提供一种用于检测甲型h1n1流感病毒的探针，所述探针包括下述1)-3)中的至少一种：

1)所述探针的核苷酸序列为：

5'-catttgggtaaatgtaacattgctggctgganmcngggaaatccagagtg-3'，

其中，所述n代表任意核苷酸或任意修饰后的核苷酸，所述m代表具环状结构的化合物；

2)在高严谨条件下可与1)所述的探针的核苷酸序列杂交的核苷酸序列；

3)与1)、或2)所述的探针的核苷酸序列具有90％以上同源性，且具有相同功能的核苷酸序列。

具体的，所述n代表携带有荧光素基团fam的胸腺嘧啶脱氧核苷酸fam-dt或携带有荧光淬灭基团bhq的胸腺嘧啶脱氧核苷酸bhq-dt，所述m代表四氢呋喃。

具体的，所述同源性为95％以上；再具体的为96％以上；再具体的为97％以上；再具体的为98％以上；再具体的为99％以上。

上述高严谨条件可为用6×ssc，0.5％sds的溶液，在65℃下杂交，然后用2×ssc，0.1％sds和1×ssc，0.1％sds各洗膜一次。

所述具有相同功能具体包括能用于检测甲型h1n1流感病毒的核苷酸序列。

具体的，所述探针的核苷酸序列为序列表中seqid№：3所示核苷酸序列。

本发明的又一个目的是提供一种用于检测甲型h1n1流感病毒的组合物，所述组合物包括下述1)和2)：

1)本发明所述的引物对；

2)本发明任一所述的探针。

本发明的还一个目的是提供一种用于检测甲型h1n1流感病毒的试剂盒，所述试剂盒包括下述1)-3)所述中的至少一种：

1)本发明所述的引物对；

2)本发明任一所述的探针；

3)本发明所述组合物。

具体的，当所述试剂盒同时包括所述的引物对和所述的探针时，所述的引物对与所述的探针的摩尔比为4：4：1。

本发明的再一个目的是提供一种甲型h1n1流感病毒的检测方法，所述检测方法不包括疾病的诊断或治疗的方法；所述检测方法包括使用下述1)-3)中的至少一种进行检测：

1)本发明所述的引物对；

2)本发明任一所述的探针；

3)本发明所述组合物。

具体的，所述检测方法还包括下述1)-2)中的至少一种：

1)当所述检测方法同时使用了所述的引物对和所述的探针时，所述的引物对与所述的探针的摩尔比为4：4：1；

2)提取待检测样品的rna进行rt-raa反应，所述rt-raa反应的反应温度包括39℃；反应时间包括20分钟以上。

本发明的又一个目的是提供本发明任一所述引物对、本发明任一所述探针、本发明任一所述组合物、本发明任一所述试剂盒、本发明任一所述检测方法在检测甲型h1n1流感病毒中的应用，所述应用不包括涉及疾病的诊断或治疗方法的应用。

本发明的还一个目的是提供本发明任一所述引物对、本发明任一所述探针、本发明任一所述组合物、本发明任一所述试剂盒、本发明任一所述检测方法在制备检测甲型h1n1流感病毒相关产品中的应用。

本发明的有益效果包括：

本发明目的是提供一种用于逆转录重组酶介导核酸扩增技术检测甲型h1n1流感病毒的荧光rt-raa引物和荧光探针以及该荧光rt-raa引物和荧光探针在检测甲型h1n1流感病毒中的应用，该荧光rt-raa引物和荧光探针可以快速、定性检测咽拭子样本中的甲型h1n1流感病毒。

本发明提供的荧光rt-raa引物和荧光探针，应用该荧光rt-raa引物和荧光探针检测甲型h1n1流感病毒时，不依赖于昂贵的pcr仪器，且检测时间较pcr方法或荧光pcr显著缩短，而灵敏度与荧光pcr相当甚至更高。

在rt-raa反应过程中，甲型h1n1流感病毒rna首先通过反转录酶合成cdna，再利用重组酶代替pcr高温变性，完成对双链的解链，解开的双链被单链结合蛋白结合，防止dna链复性，再由聚合酶完成链的延伸，以cdna为模板合成目的产物。反应在39℃下进行20分钟.此外，raa技术还能完成多重引物扩增，配合荧光仪，可形成一套raa多重荧光实时检测系统，即利用不同颜色的荧光标记，在同一个反应里检测到不同的目的基因，这是其他恒温核酸扩增技术或巢式pcr技术无法相比的。

本发明可以实现单管现场、快速检测甲型h1n1流感病毒，其它检测技术相比具有以下优点：

1、全封闭反应，实时监控荧光数据，无需后续处理，避免污染，保证检测结果的可靠性；2、不依赖于pcr等贵重仪器，甚至能在37-39℃常温下检测，20分钟内即可出诊断结果，大大缩短检测时间；3、本发明提供的荧光rt-raa引物和荧光探针特异性更强、灵敏度更高，完全满足疫情快速诊断和全程监控，为疫情早诊断、早治疗、降低病死率以及控制疫情争取时间。

附图说明

图1为灵敏度实验结果图。

图2为特异性实验结果图。

图3为临床阳性样品检测结果图。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》(第三版)j.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、用于检测甲型h1n1流感病毒的荧光rt-raa引物、探针的设计

针对于甲型h1n1流感病毒的特异保守区域为靶标区域，设计特异性引物及荧光raa探针，其序列分别是：

正向引物，如序列表中seqid№：1所示核苷酸序列：

5'-gcgaacaattcaacagacactgtagacacagtac-3'

反向引物，如序列表中seqid№：2所示核苷酸序列：

5'-ctaggtgtttccacaatgtaggaccatgagc-3'

寡核苷酸探针，如序列表中seqid№：3所示核苷酸序列：

5'-catttgggtaaatgtaacattgctggctgga(fam-dt)(thf)c(bhq-dt)gggaaatccagagtg-3'；

其中：

fam-dt表示携带有荧光素基团fam(6-carboxyfluorescein)的胸腺嘧啶脱氧核苷酸；

thf表示四氢呋喃(tetrahydrofuran)连接子；

bhq-dt表示携带有荧光淬灭基团bhq(blackholequencher)的胸腺嘧啶脱氧核苷酸；

实施例2、一种用于检测甲型h1n1流感病毒的荧光rt-raa方法的建立

(一)荧光rt-raa反应

1)样本rna的提取：所述样本rna可以采用德国凯杰生物工程有限公司的viralrna核酸提取试剂盒，按照试剂盒说明书进行提取。

2)采用实施例1设计的正向引物、反向引物和探针，以及raa反应试剂盒(本实施例具体采用了江苏奇天基因生物科技有限公司的raa基础试剂盒)，以本实施例步骤1)制备的待检测样本rna为模板，进行扩增反应，其中反应体系如下：

25μlraa反应缓冲液(江苏奇天基因生物科技有限公司raa基础试剂盒提供)；

实施例1设计的正向引物、反向引物(10μm)各2μl；

0.5μl实施例1设计的探针(10μm)；

1μl步骤1)制备的待检测样本rna模板；

0.5μl的m-mlv逆转录酶(thermofisher公司产品，200u/μl)

加16.5μl双蒸水至47.5μl，混合均匀，然后加入到有干粉(江苏奇天基因生物科技有限公司raa基础试剂盒提供)的反应管中，再次混匀。各管加入2.5μl280mm醋酸镁溶液并混匀。

(二)荧光检测

将上述反应管放置于raaf-6100荧光基因检测仪(江苏奇天基因生物科技有限公司)，在39℃反应20min，进行荧光检测。

阴性对照：fam通道无扩增曲线，且无tt值；

阳性对照：fam通道有扩增曲线，tt值均≤8min

上述对阳性对照和阴性对照的要求需在同一次实验中同时满足，否则，本次实验无效，需要重新进行实验。

4)样品检测结果判读：

当所检测的样品fam通道均有扩增曲线，质量控制正常时，可判定h1n1流感病毒阳性；

当所检测的样品fam通道无扩增曲线，且tt值显示为undet或nott，质量控制正常时，可判定h1n1流感病毒阴性。

(三)灵敏度实验

该实验验证该检测方法的最低检测限，采用浓度为1.0×10⁷copies/ml、1.0×10⁶copies/ml、1.0×10⁵copies/ml、1.0×10⁴copies/ml、1.0×10³copies/ml、1.0×10²copies/ml、10copies/ml等的阳性质粒作为检测限参比品，通过该实验表明该检测方法的检测限达到10copies/ml，具体实验结果如图1所示。

图1中10⁷、10⁶、10⁵、10⁴、10³、10²、10分别表示浓度为1.0×10⁷copies/ml、1.0×10⁶copies/ml、1.0×10⁵copies/ml、1.0×10⁴copies/ml、1.0×10³copies/ml、1.0×10²copies/ml、10copies/ml的阳性质控品扩增曲线，阴为阴性质控品，横坐标表示反应时间，纵坐标mv表示荧光值。图1所示结果表明，该检测方法的检测限达到10copies/ml。

(四)特异性实验

该实验选择与甲型h1n1流感病毒具有相同感染部位的常见病原体作为特异性参考品。特异性参考品分别为h3n2流感病毒、乙型流感病毒(influb)、h5n6禽流感病毒、呼吸道合胞病毒(rsv)、鼻病毒(rv)。利用qigen公司的viral病毒rna提取试剂盒提取以上样本中的rna作为模板进行实验。特异性实验结果如图2所示。

图2中横坐标表示反应时间，纵坐标mv表示荧光值。图2所示结果表明，这5种特异性参考品均未有扩增曲线，说明该检测方法的特异性良好。

(五)临床阳性样品检测实验

该实验室选择宁波国际旅行卫生保健中心综合实验室保存的5例甲型h1n1流感病毒阳性样本(h1n1-1019、h1n1-1020、h1n1-10217、h1n1-776、h1n1-782)对该方法进行检测、验证。具体实验结果如图3所示。

图3中横坐标表示反应时间，纵坐标mv表示荧光值。图3所示结果表明，该检测方法扩增效果优异，具有良好的性能。

以上所述实施例仅表达了本发明的实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制，但凡采用等同替换或等效变换的形式所获得的技术方案，均应落在本发明的保护范围之内。

序列表

<110>宁波国际旅行卫生保健中心

<120>一种用于检测甲型h1n1病毒的荧光rt-raa引物、探针及检测方法

<160>3

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>34

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

gcgaacaattcaacagacactgtagacacagtac34

<210>2

<211>31

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

ctaggtgtttccacaatgtaggaccatgagc31

<210>3

<211>50

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<220>

<221>misc_feature

<222>(32)..(32)

<223>n=fam-dt

<220>

<221>misc_feature

<222>(33)..(33)

<223>m=thf

<220>

<221>misc_feature

<222>(35)..(35)

<223>n=bhq-dt

<400>3

catttgggtaaatgtaacattgctggctgganmcngggaaatccagagtg50